Een 13-weekse subchronische toxiciteitsstudie van 2-(l-menthoxy)ethanol bij F344-ratten

Samenvatting: 2-(l-Menthoxy)ethanol wordt vaak gebruikt als smaakstof; gegevens over de toxiciteit van 2-(l-menthoxy)ethanol blijven echter beperkt. We hebben een 13-week opgetredensubchronische toxiciteitonderzoek naar {{0}}(l-menthoxy)ethanol bij mannelijke en vrouwelijke F344-ratten, met doses van 0, 15, 60 of 250 mg/kg lichaamsgewicht (LW)/dag oraal toegediend via maagsonde maïsolie als voertuig. Er werden in geen enkele groep significante toxicologische veranderingen in de algemene toestand, het lichaamsgewicht of de voedselinname waargenomen. Uit de hematologische beoordeling bleekverminderde hemoglobine,hematocriet, gemiddeld corpusculair volume, en gemiddeld corpusculair hemoglobine en verhoogd aantal bloedplaatjes in de mannelijke 250 mg/kg-groep.Serumbiochemieonthuldverhoogd totaal cholesterolin de 250 mg/kg-groep van mannelijke en vrouwelijke ratten, verminderde triglyceriden in de vrouwelijke 250 mg/kg-groep, en verhoogd totaal eiwit in de mannelijke 250 mg/kg-groep, wat wijst op effecten oplipidenmetabolismeEneiwitsynthese. Wat betreft orgaangewichten waren de absolute en relatieve gewichten van de lever en de bijnieren verhoogd in respectievelijk de 250 mg/kg-groep van beide geslachten en de mannelijke 250 mg/kg-groep. Histopathologische analyse toonde aanchronische nefropathiein de mannelijke groepen van 15 mg/kg of hoger, met verhoogd absoluut en relatief niergewicht, evenals verhoogd serumcreatinine, in de mannelijke groepen van 60 en 250 mg/kg. Er werden echter eosinofiele korrels met 2u-globuline geïdentificeerd in proximale tubuli, wat duidt op 2u-globuline-nefropathie die specifiek is voor mannelijke ratten en zonder toxicologische betekenis. Deze resultaten gaven aan dat het niveau zonder waargenomen nadelig effect van 2-(l-methoxy)ethanol 60 mg/kg lichaamsgewicht/dag was voor beide geslachten. (DOI: 10,1293/tox.2020-0091; J Toxicol Pathol 2021; 34: 309–317)

Trefwoorden: 2-(l-menthoxy)ethanol, 2-l-menthoxyethanol, levensmiddelenadditief, smaakstof, Fischer rat, menthol

Cistanche supplement Nierfunctie Ondersteunend supplement PhGs75% Ech 30% Act 12%

Invoering

{{0}}(l-Menthoxy)ethanol (CAS-nr. 38618-23-4) is een heldere en kleurloze vloeistof met een karakteristieke geur en wordt veel gebruikt als smaakstof. Het Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) heeft 2-(l-menthoxy)ethanol beoordeeld als smaakstof, gecategoriseerd als stoffen die structureel verwant zijn aan menthol1. Op basis van de structurele klasse van smaakstoffen werd 2-(l-menthoxy)ethanol toegewezen aan klasse I. In de Verenigde Staten en Europa zijn de innameniveaus van 2-(l-menthoxy)ethanol door mensen werden geschat op respectievelijk 12 µg/persoon/dag en 0,01 µg/persoon/dag, beide onder de Klasse I-drempel van 1.800 µg/persoon/dag. Op basis van deze schattingen wordt geoordeeld dat 2-(l-menthoxy)ethanol mogelijk geen veiligheidsproblemen oplevert bij routinematig gebruik als smaakstof.

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(l-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg lichaamsgewicht [LW])1. Ondanks het gebruik van 2-(l-menthoxy)ethanol als smaakstof, zijn er beperkte gegevens beschikbaar over de toxiciteit van deze verbinding bij herhaalde dosering. Ons laboratorium heeft de toxiciteit van verschillende voedseladditieven, inclusief representatieve smaakstoffen uit elke categorie, onderzocht in knaagdiermodellen2–7. Om het toxicologische profiel te verduidelijken en een no-observed-adverse-effect level (NOAEL) vast te stellen, hebben we een subchronisch toxiciteitsonderzoek van 13-weken uitgevoerd naar 2-(l-menthoxy)ethanol, dat oraal werd toegediend aan F344 ratten via maagsonde.

Materialen en methodes

Teststof

2-(l-Menthoxy)ethanol (partij nr. 5I0002, zuiverheid 99,9%) geproduceerd door Takasago Int. Corp. (Tokio, Japan) werd geleverd door de Division of Standards and Evaluation, Department of Food Safety, Ministry of Health, Labor and Welfare, Japan, met de steun van de Japan Flavour & Fragrance Materials Association (Tokio, Japan). Hoewel de teststof werd geleverd als een mengsel van optische isomeren (CAS-nr. 38618-23-4), werd door de fabrikant bevestigd dat het de l-enantiomeer (CAS-nr. 75443-64-0) ​​is. Orale sondevoeding met maïsolie (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) als drager werd gekozen als toedieningsroute vanwege de waterige onoplosbaarheid en vluchtigheid van 2-(l-menthoxy)ethanol. Oplossingen van 2-(l-menthoxy)ethanol werden dagelijks bereid, onmiddellijk vóór toediening. Na opslag gedurende 2 uur bij kamertemperatuur werden de restverhoudingen van 2-(l-menthoxy)ethanol in 4, 40 en 400 mg/ml oplossing bevestigd als respectievelijk 96,8%, 99,8% en 96,5%. door gaschromatografie (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokio, Japan).

Experimentele dieren

In totaal werden 40 mannelijke en 40 vrouwelijke specifieke pathogeenvrije ratten (F344/DuCrlCrlj, 5-week oud) gekocht bij Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japan) en na acclimatisering gedurende één week gebruikt. Tijdens het onderzoek werden de dieren gehuisvest in kooien van polycarbonaat met zacht chip beddengoed, gehouden in een kamer met een barrièresysteem om de licht/donkercyclus (12 uur), ventilatie (luchtuitwisselingssnelheid van 18 keer/uur), temperatuur (12 uur) te controleren. 24 ± 1 graad) en relatieve vochtigheid (55 ± 5%). De kooien en het chipstrooisel werden twee keer per week vervangen. Elk dier had gratis toegang tot kraanwater en een basaal dieet (CRF-1; Oriental Yeast, Tokyo, Japan). Aan het begin van het experiment werden de dieren willekeurig toegewezen aan vier groepen van elk 10 mannelijke en vrouwelijke ratten, op basis van hun lichaamsgewicht gemeten onmiddellijk vóór aanvang van de behandeling met de teststof.

Studie ontwerp

In een voorlopig onderzoek van {0}} dagen waarin 2-(l-menthoxy)ethanol werd beoordeeld, toegediend in doses van 0, 200, 400 en 800 mg/kg lichaamsgewicht/dag, absoluut en het relatieve levergewicht was significant verhoogd in alle behandelde groepen van beide geslachten (gegevens niet getoond). Op basis van deze resultaten hebben we 2-(l-menthoxy)ethanoldoses van 0, 15, 60 en 250 mg/kg lichaamsgewicht/dag geselecteerd voor toediening aan zowel mannelijke als vrouwelijke ratten in de huidige 13- week toxiciteitsonderzoek

De algemene omstandigheden en de sterfte werden dagelijks beoordeeld. Gedurende de experimentele periode werden het lichaamsgewicht, evenals de geleverde en resterende hoeveelheid voer, eenmaal per week gemeten. Alle ratten werden een nacht gevast na voltooiing van de behandeling, en bloedmonsters voor hematologie en serumbiochemie werden verzameld uit de abdominale aorta onder diepe inhalatie-anesthesie met behulp van isofluraan. Het onderzoeksontwerp was in overeenstemming met de Guidelines for Designation for Food Additives and Revision of Standards for Use of Food Additives of Japan (1996) en goedgekeurd door de Animal Care and Utilization Committee van het National Institute of Health Sciences, Japan.

Hematologie en serumbiochemie

De volgende hematologische parameters werden geanalyseerd met behulp van ProCyte Dx automatische hematologieanalysatoren (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, VS): aantal witte bloedcellen (WBC), aantal rode bloedcellen (RBC), hemoglobineconcentratie (HGB), hematocriet (HCT), gemiddeld corpusculair volume (MCV), gemiddeld corpusculair hemoglobine (MCH), gemiddelde corpusculaire hemoglobineconcentratie (MCHC), aantal bloedplaatjes (PLT) en differentiële leukocytcellen, waaronder neutrofielen (Neut), lymfocyten (Lymph), monocyten (Mono), eosinofielen (Eosino) en basofielen (Baso). Biochemische serumanalyse werd uitgevoerd door Oriental Yeast voor de volgende parameters: totaal eiwit (TP), albumine (Alb), albumine/globuline verhouding (A/G), totaal bilirubine (Bil), glucose, totaal cholesterol (T-Chol), triglyceride (TG), ureumstikstof (BUN), creatinine (Cre), calcium (Ca), anorganische fosfor (IP), natrium (Na), kalium (K), chloor (Cl), aspartaataminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkalische fosfatase (ALP) en -glutamyltranspeptidase (-GTP).

Orgaangewichten en histopathologische beoordeling

Bij alle dieren werd een volledige necropsie uitgevoerd en de hersenen, de thymus, de longen, het hart, de milt, de lever, de bijnieren, de nieren, de testikels en de eierstokken werden gewogen. Deze organen, evenals weefsels van het ruggenmerg, de nervus trigeminus, de hypofyse, de neusholte, de speekselklieren, de tong, de slokdarm, de luchtpijp, de aorta, de schildklier, de bijschildklier, de pancreas, de maag, de dunne en dikke darm, het submandibulaire en het mesenteriale weefsel lymfeklieren, vagina, baarmoeder, urineblaas, prostaatklier, zaadblaasjes, epididymis, dijbeen en borstbeen met beenmerg, wervels, skeletspieren, heupzenuw, huid en borstklier, werden gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline; vervolgens werden in paraffine ingebedde secties bereid en gekleurd met hematoxyline en eosine voor histopathologisch onderzoek. De teelballen en ogen met Harderiaanse klieren werden respectievelijk gefixeerd in Bouin's fixeermiddel en Davidson's oplossing. Botweefsel, waaronder de neusholte, wervels, borstbeen en dijbeen, werden gedurende maximaal 2 weken ontkalkt met een mengsel van 10% mierenzuur en 10% gebufferde formaline. Histopathologische beoordeling werd uitgevoerd voor alle weefsels verkregen van dieren in de controlegroep en de groep waaraan de hoogste dosis werd toegediend, tenzij er behandelingsgerelateerde laesies werden waargenomen.

Immunohistochemie voor 2u-globuline

Bij mannelijke ratten werd de accumulatie van 2u-globuline in de nier onderzocht door immunohistochemische analyse van in paraffine ingebedde coupes. Voor het ophalen van antigeen werden de secties verkregen van 5 ratten in elke groep gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur geïncubeerd met proteïnase K (DAKO, Glostrup, Denemarken). Alle secties werden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur ondergedompeld in een 3% H2O2/methanoloplossing om de endogene peroxidaseactiviteit te inactiveren. Na het blokkeren van niet-specifieke reacties met 10% normaal konijnenserum, werden de secties 's nachts bij 4 graden Celsius geïncubeerd met een primair antilichaam voor 2u-globuline (verdund 1:400; anti-rat 2u-globuline antilichaam; R&D Systems, Minneapolis, MN, VS). 8. Visualisatie van antilichaambinding werd uitgevoerd met behulp van een Vecta Stain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, VS) en 3,3'-diaminobenzidine. Alle secties werden tegengekleurd met hematoxyline.

statistische analyse

Variaties in gegevenswaarden voor lichaamsgewicht tijdens de experimentele periode, evenals voor hematologie, serumbiochemie en orgaangewichten, werden beoordeeld op homogeniteit met behulp van de Bartlett-test. Eenrichtingsvariantieanalyse en de Kruskal-Wallis-test werden respectievelijk gebruikt voor homogene en heterogene gegevens. Bij het vaststellen van statistisch significante verschillen werd de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett gebruikt om controle- en behandelingsgroepen te vergelijken. Vergelijkingen van histopathologische incidenties en cijfers werden geanalyseerd door respectievelijk Fisher's exacte waarschijnlijkheidstest en Mann-Whitney's U-test te gebruiken. P-waarden van<0.05 were considered statistically significant.