Een geconserveerd lang niet-coderend RNA, GAPLINC, moduleert de immuunrespons tijdens endotoxische shock

Neem voor meer informatie contact op metdavid.wan@wecistanche.com

Betekenis

Ontsteking is grotendeels bestudeerd in de context van eiwitcoderende genen. Recente studies hebben IncRNA's blootgelegd als belangrijke regulatoren van immuniteit. De functionele karakterisering van deze genen blijft een actief onderzoeksgebied. In deze studie identificeren we GAPLINC als een functioneel geconserveerdIncRNAtussen mensen en muizen. GAPLINC-uitputting resulteert in verbeterde expressie van immuunresponsgenen die direct zijnNF-kBdoelen. Verbazingwekkend genoeg zien we dat Gaplinc-knock-outmuizen resistentie vertonen tegen door LPS geïnduceerde endotoxische shock en ontdekken dat basale expressie van inflammatoire genen de vorming van stippen voorkomt om te beschermen tegen multi-orgaanfalen en overlijden. Deze bevindingen hebben implicaties voor de behandeling van sepsis, waarbij nieuwe therapieën die gericht zijn op IncRNA's waardevolle informatie kunnen bijdragen bij het begrijpen van ontstekingen en het verbeteren van de patiëntresultaten.

Klik hier voor meer informatie over Cistanche

FG 1. identificatie en karakterisering van macrofaag-specifiekIncRNA GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1,000-fok). (C) RNA-Seq-analyse vanGAPLNCexpressie tijdens monocyt- tot macrofaagdifferentiatie voor de aangegeven tijdstippen. GAPLINC-expressie wordt weergegeven als kopieën per cel (FPKM. (D) Heatmap vertegenwoordigt genexpressie van een aangepast Nanostring-paneel, dat de top 10 differentieel tot expressie gebrachte InciNA toont die monocyten vergelijkt met macrofagen in primaire menselijke cellen en THP-1-cellen Gegevens van Nanotring werden uitgevoerd in biologische duplicaten (E) Een schema voor granulocyt-monocyt-voorlopercellen die aanleiding geeft tot twee verschillende populaties: 1) MDDC's en 2) MDM's. UCSC-genoombrowsertrack toont RNA-Seq-lezingen van monocyten, macrofagen en dendritische cellen aan deGAPLINSplaats. () qPCR-analyse van RNA's gezuiverd uit nucleaire (witte) en cytoplasmatische (grijze) fracties in MDM's (G qPCR-analyse van Russ geïsoleerd uit verschillende polysoomfracties van MDM-systemen (10 tot 50 procent sucrosegradiënt, SW41, 40 K rpm, voor ~ 1,5 uur).

Recente studies hebben duizenden lange niet-coderende RNA's (ncRNA's) in zoogdiergenomen geïdentificeerd die genexpressie reguleren in verschillende biologische processen. Hoewel IncRNA's zijn geïdentificeerd in een verscheidenheid aan immuuncellen en betrokken zijn bij de immuunrespons, blijven de biologische functie en het mechanisme van de meerderheid onontgonnen, vooral bij sepsis. Hier identificeren we een rol voor een hdRNA - maag-adenocarcinoom voorspellend lang intergeen niet-coderend RNA (GAPLINC) - dat eerder werd gekenmerkt vanwege zijn rol bij kanker, nu in de context van aangeboren immuniteit, macrofagen en door LPS geïnduceerde endotoxische shock. Transcriptoomanalyse van macrofagen van mensen en muizen onthult dat GAPLINC een geconserveerd IndRNA is dat in hoge mate tot expressie wordt gebracht na differentiatie van macrofagen. Na ontstekingsactivering wordt GAPLIN snel neerwaarts gereguleerd. Macrofagen die uitgeput zijn van GAPLINC vertonen een verhoogde expressie van ontstekingsgenen bij baseline, terwijl overexpressie van GAPLINC deze reactie onderdrukt. In overeenstemming met GAPLINC-uitgeputte cellen, vertonen Gaplinc-knockout-muizen verbeterde basale niveaus van ontstekingsgenen en vertonen ze resistentie tegenLPS-geïnduceerdendotoxische shock. Mechanistisch gezien is overleving gekoppeld aan verhoogde niveaus van nucleair NF-xB in Gaplinc-knockout-muizen die basale expressie van doelwitgenen aansturen die doorgaans alleen worden geactiveerd na ontstekingsstimulatie. We laten zien dat deze activering van immuunresponsgenen voorafgaand aan LPS-uitdaging leidt tot de vorming van bloedstolsels, die Gaplinc-knock-outmuizen beschermen tegen multi-orgaanfalen en overlijden. Samen identificeren onze resultaten een voorheen onbekende functie voor GAPLINC als een negatieve regulator van ontsteking en ontdek een sleutelrol voor dit lncRNA bij het moduleren van endotoxische shock.

Fig. 2. GAPLINC is een negatieve regulator van ontsteking en afhankelijk van Nf-sB-signalering. Monocyten geïsoleerd uit menselijke PBMC's en gedifferentieerd tot macrofagen werden getransfecteerd met controle- of GAPLINC-siRNA. (EEN)RNA-Seqanalyseop GAPLINC kd of controle siRNA MDM's. RNA-Seq werd uitgevoerd in biologische duplicaten. Resultaten worden weergegeven in een vulkaanplot. Aanzienlijk opwaarts gereguleerde genen met vouwverandering Groter dan of gelijk aan 2 zijn in rood omkaderd. (6) GO-Term-analyse van aanzienlijk opwaarts gereguleerde genen. (C) Warmtekaart vertegenwoordigt genexpressie van top-immuungerelateerde genen die zijn opgereguleerd op GAPLINC kd. Gegevens van RNA-Seq werden uitgevoerd in biologische duplicaten. (D) GAPLINC-isovormen in MDM's werden bepaald door op Nanopore gebaseerde R2C2-sequencing. Gegevens van Nanopore-sequencing werden uitgevoerd in biologische duplicaten (ruwe gegevens zijn beschikbaar bij SRAunder Bloproject PRINA639136). (E) Een tabel die de leestellingen en het percentage van elke GAPLINC-isovorm weergeeft. (F) Bidirectionele vector die GFP-Zetocin aan de ene kant tot expressie brengt en GAPLINC aan de andere kant. (G en H) qPCR-analyse van GAPLINC-expressie in THP-1-cellen die ectopische GAPLINC of lege vectorcontrole tot expressie brengen. Niveaus van IL6 werden gekwantificeerd na stimulatie met LPS (200 nal ml) gedurende 6 uur; gegevens werden samengevoegd uit drie onafhankelijke experimenten. * P<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), U qPCR-analyse van GAPLINC in MDM's （n=3）voorbehandeld met DMSO of BAY-7082（10μM）, gevolgd door LPS-stimulatie （200 ngmL） voor 6 ht-gegevens werden samengevoegd uit drie onafhankelijke experimenten. *P<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

sepsis is een levensbedreigende ziekte die wordt veroorzaakt door een overdreven reactie van het lichaam op de aanwezigheid van een infectie, wat snel kan leiden tot multi-orgaanfalen en overlijden. Het immuunsysteem is essentieel bij het bieden van bescherming tegen infectie; ongecontroleerde activering kan echter ernstige gevolgen hebben voor de gastheer. Volgens de Centers for Disease Control and Prevention heeft een op de drie patiënten die in een ziekenhuis overlijden sepsis(1). en toch begrijpen we nog steeds niet de onderliggende moleculaire mechanismen die tot fataliteit leiden. Klinische opties voor de behandeling van sepsis zijn beperkt tot het toedienen van vocht, antibiotica en ondersteunende zorg en zijn decennialang grotendeels onveranderd gebleven. Hoewel vroege diagnose en snelle behandeling de sepsisresultaten hebben verbeterd(2), is er een kritieke behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Hoewel genexpressiestudies zijn uitgevoerd om potentiële therapeutische doelen voor sepsis te onderzoeken, blijven deze doelen grotendeels niet gekarakteriseerd (3). We hebben een lang niet-coderend RNA (lncRNA) geïdentificeerd dat een rol speelt bij het beheersen van de immuunrespons en endotoxische shock die mogelijkheden biedt voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen om sepsis aan te pakken.

Resultaat

Fig. 3. GAPLINC is geconserveerd in muizen en reguleert de respons op endotoxische shock. (4) GAPLINC is syntenisch geconserveerd. GAPLINC bevindt zich op Chr18in mensen en op Chr17 bij muizen, tussen de eiwitcoderende genen Dlgap1 en Gift. Dlgapil wordt niet uitgedrukt inmacrofagen. (B)MCA toont de verdeling van Gaplinc-niveaus in verschillende immuunceltypen (BM). (C) qPCR-analyse van Gaplinc-expressie in B-cellen en BMDM's; deze gegevens (gemiddelde ± SD) zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten, (D) qPCR-analyse van Gaping-expressie in BMDME gestimuleerd met LPS (200 nb/mL) gedurende 6 uur; deze gegevens (gemiddelde ± SD) zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. (E) Schematische voorstelling van de Gaplinc-locus voor en na door CRISPRCas9 gemedieerde deletie. Gestippelde lijnen geven het geschatte gebied van verwijdering aan. Gel vertegenwoordigt PCR-amplificatie van genomische gegevens. Amplicon-lengtes worden vergeleken voor WT- en Gaping KO-muizen, (F) qPCR-analyse van Gaplinc-expressie in WT- en Gaplinc-KO BMDM's met behulp van een combinatie van primers om Exon1-, Exon2- en exon-overspannende regio's van het Gaplinc-transcript te detecteren; deze gegevens (gemiddelde ± SD) zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. (G) RNA-Seq-analyse in BMDM's van WT- en Gaplinc KO-muizen (n =3). Resultaten worden weergegeven in een vulkaanplot. Aanzienlijk opwaarts gereguleerde genen met een vouwverandering groter dan of gelijk aan 2 worden in rood weergegeven. (H) GO-Term-analyse op aanzienlijk opwaarts gereguleerde genen. (I en J) Overlevingsgegevens van WT- en Gaplinc KO-muizen worden weergegeven als reactie op de E. coli LPS-uitdaging (5 mg/kg/muizen) (n =6 tot 10). De statistische test van verschillen werd geteld met behulp van de log-rank (Mantel-Cox) test. "…P< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

Omdat lncRNA-expressie de immuunrespons kan reguleren door de differentiatie van immuuncellen en hun respectievelijke functie te beïnvloeden (4-7), wilden we de rol van ncRNA's in macrofagen onderzoeken. Macrofagen zijn belangrijke aangeboren immuuncellen die kunnen worden afgeleid van monocyten en zijn van cruciaal belang voor de herkenning van pathogenen door het gebruik van Toll-like receptoren (TLR's). Na activering. TLR's initiëren complexe signaalroutes die belangrijke transcriptiefactoren zoals NF-kB activeren, wat leidt tot de transcriptie van honderden immuunresponsgenen (8).

Om IncRNA's te identificeren die betrokken zijn bij macrofaagdifferentiatie en -functie, hebben we RNA-sequencing uitgevoerd (RNA-Seq) in zowel menselijke primaire van monocyten afgeleide macrofagen (MDM's) en de monocytische cellijn THP-1s (Fig. lA en SI Appendix. Fig. S1). We identificeerden maagadenocarcinoom voorspellend lang intergeen niet-coderend RNA (GAPLINC) als het meest up-gereguleerde IncRNA tijdens monocyt- tot macrofaagdifferentiatie (figuur 1B). GAPLINC-niveaus waren op dag 1 detecteerbaar en namen toe tot ~ 300 kopieën per cel (Fig 1C). Met behulp van RNA-profileringstechnologie (nCounter, Nanostring) hebben we GAPLINC gevalideerd als een van de top 10 mRNA's die tot expressie worden gebracht in gedifferentieerde primaire MDM's en THP-1's (Fig1D). We hebben ook bevestigd dat GAPLINC in hoge mate tot expressie wordt gebracht in MDM's, maar niet tot expressie wordt gebracht in de nauw verwante van monocyten afgeleide dendritische cellen (MDDC's) van het celtype (Fig. 1E), wat suggereert dat expressie van GAPLINC-celtype specifiek is. Door een celfractioneringsexperiment uit te voeren en GAPLINC-niveaus in de cytoplasmatische en nucleaire compartimenten van macrofagen te meten met behulp van qPCR, ontdekten we dat GAPLINC voornamelijk gelokaliseerd is in het cytosol in vergelijking met CD14, een cytoplasmatisch mRNA en NEAT1, een nucleair IncRNA (Fig. 1F). Dit komt overeen met bevindingen in kankercellen, waarbij GAPLINC voornamelijk gelokaliseerd is in het cytoplasma (9). Om ervoor te zorgen dat GAPLINC niet codeert, hebben we polysoomprofilering uitgevoerd, een methode die wordt gebruikt om te analyseren of een gen actief wordt vertaald in eiwit. In tegenstelling tot CD14 werden noch NEATI noch GAPLINC gevonden in de hoog-polysoomfractie, wat suggereert dat GAPLINC niet is vertaald (figuur 1G),

Afb.4. Gaplnc KO reguleert IRG's opwaarts en vertoont een verhoogd niveau van p65 in het naakt bij baseline. (A) Cytokineniveaus in serum van WT- en Gaplinc KO-muizen op basaal.n=4 tot 7,*P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

Vervolgens onderzochten we het effect van GAPLINC-silencing op differentiërende macrofagen. Omdat GAPLINC-niveaus tijdens differentiatie toenamen, veronderstelden we dat GAPLINC knock-down (KD) van invloed zou zijn op genen die betrokken zijn bij differentiatie. Met behulp van gepoold klein interfererend RNA (siRNA) bereikten we ~ 55 tot 65 procent kd GAPLINC in primaire MDM's (SIAppendix, Fig. S2). We voerden RNA-Seq uit en identificeerden een aantal genen die ontregeld waren op GAPLINC kd (Fig. 24). We hebben de tophits bevestigd met behulp van Nanostring (SI-bijlage, Fig. S3). Gene Ontology (GO)-verrijkingsanalyse toonde aan dat immuunresponsgenen significant oververtegenwoordigd waren in genen die opwaarts gereguleerd waren op GAPLINC kd en niet in genen die betrokken zijn bij macrofaagdifferentiatie, in tegenstelling tot onze oorspronkelijke hypothese. (Fig. 2B). Met name differentieel tot expressie gebrachte genen in GAPLINC-KD-cellen omvatten pro-inflammatoire cytokinen en chemokinen (IL6, CXCL10 en TNFSF10), IFN-gestimuleerde genen (ISG's) (IFIT2 en RSAD2) en guanylaat-bindende eiwitten (GBP's) (GBP3 en GBP5) (Fig. 2C en SI Appendix. Fig. S4). Om te verifiëren dat macrofaagdifferentiatie niet werd beïnvloed door GAPLINC kd. niveaus van CD11B.CD16 en CD14 werden gemeten in met controle en signalering behandelde macrofagen en bleken vergelijkbaar te zijn (SI-bijlage, figuur S5). Vervolgens gebruikten we een extra kd-benadering met behulp vanCRISPRinhibitie (CRISPRi) om zich te richten op de transcriptionele startplaats door GAPLIN gebruik te maken van drie verschillende gids-RNA's (gRNA's) in THP-1-cellen die zijn gestimuleerd met forbol 12-myristaat13-acetaat (PMA). We bereikten meer dan 80 procent kd van GAPLINC en observeren opnieuw verhoogde expressie van het pro-inflammatoire cytokine IL6 wanneer GAPLINC bij baseline wordt uitgeschakeld (SI-bijlage, Fig. S6 A en B). Interessant is dat na activering van lipopolysaccharide (LPS) de niveaus van IL6 vergelijkbaar waren in de controle versus GAPLINC kd THP-1-cellen (SIAppendix, Fig. S6C). Aangezien de basislijnniveaus verschillen, wordt de algehele vouwinductie van IL6 verminderd wanneer GAPLINC wordt verwijderd. (S7 Bijlage, Afb. S6D).

Omdat GAPLINC kd resulteerde in de opregulatie van immuunresponsgenen, hebben we een THP-1-cellijn gegenereerd die GAPLINC tot overexpressie brengt om te bepalen of het het tegenovergestelde effect bemiddelt. Het gebruik van langgelezen sequencinggegevens. we identificeerden de dominante isovormen van GAPLINC uitgedrukt in MDM's (Fig. 2D). De meest voorkomende isovorm, die overeenkomt met de annotatie van de referentiesequentie (RefSeq), werd in ons construct opgenomen (Fig. 2E). We gebruikten een lentivirale vector die een bidirectionele promotor bevat om groen fluorescerend eiwit (GFP) / Zeocin en GAPLINC parallel aan te sturen (Fig. 2F). We bevestigden met behulp van qPCR dat GAPLINC stabiel tot expressie werd gebracht in THP -1's in vergelijking met controle (Fig. 2G). Overexpressie van GAPLINC verminderde IL6 op het RNA-niveau in vergelijking met controle na stimulatie met LPS, een component van gramnegatieve bacteriën (Fig. 2H). Deze waarnemingen suggereren dat GAPLINC werkt als een negatieve regulator van de ontstekingsreactie.

Vervolgens onderzochten we GAPLINC-niveaus in primaire MDM's als reactie op ontsteking. Na LPS-stimulatie ontdekten we dat GAPLINC snel naar beneden werd gereguleerd (Fig. 2I). Bovendien laten we met behulp van qPCR zien dat GAPLINC ook naar beneden wordt gereguleerd na activering met een verscheidenheid aanTLRliganden (SI Appendix, Fig. S7A). Inductie van positieve controle-inflammatoire genen TNF-a, IL6 en CCL5 werd bevestigd (SI-bijlage, Fig. S7B). Deze gegevens suggereren dat GAPLINC-expressie moet worden verminderd na stimulatie om optimale inductie van ontstekingsgenen te laten plaatsvinden. Om de rol van NF-kB bij het beheersen van de expressie van GAPLINC te evalueren, werden MDM's voorbehandeld met dimethylsulfoxide (DMSO) of BAY11-7082, een NF-B-remmer,

gevolgd door stimulatie met LPS gedurende 6 uur. In met BAY11-7082-behandelde MDM's was de neerwaartse regulatie van GAPLINC verminderd ten opzichte van controle (Fig. 2/). wat suggereert dat de regulatie van GAPLINC afhankelijk is van NF-KB-signalering. Inductie van positieve controle-inflammatoire genen TNF- en IL6 na LPS-stimulatie werd bevestigd (SIAppendix, Fig, S7C). Om te begrijpen hoe GAPLINC wordt gereguleerd, gebruikten we Assay for Transposase-Accessible Chromatin met behulp van sequencing (ATAC-seq) in MDM's de toegankelijkheid van chromatine van de GAPLINC-locus beoordelen. We ontdekten dat GAPLINC actief wordt getranscribeerd in rustende macrofagen maar stevig wordt afgesloten na LPS-stimulatie (Fig. 2K), wat suggereert dat GAPLINC wordt gereguleerd op het niveau van transcriptie.

Onderzoek naar het behoud van GAPLINC tussen mensen en muizen. we probeerden syntenische loci te identificeren, waarin genen positioneel geconserveerd zijn tussen dezelfde twee eiwitcoderende genen. gevolgd door een beoordeling voor functioneel behoud. Hier laten we zien dat Gaplinc positioneel geconserveerd is, door een transcript te lokaliseren tussen de genen Dlgap1 en TgifI (Fig. 3A). Om de specificiteit van het celtype te bevestigen, gebruikten we de Mouse Cell Atlas (MCA)

(10) om transcriptniveaus over immuuncellen in het beenmerg (BM) te beoordelen en vond het het hoogst tot expressie gebracht in macrofagen, met lagere expressieniveaus in neutrofiele voorlopers (Fig. 3B). Vervolgens, om te bepalen of expressiepatronen waren geconserveerd tijdens macrofaagdifferentiatie bij zowel mensen als muizen, voerden we RNA-Seq uit om BM-cellen te vergelijken met van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's), voltooide de novo transcriptassemblage en ontdekten we dat Gaplinc-niveaus van muizen verhoogden na differentiatie (SI-bijlage, Afb. S8A). We hebben dit gevalideerd door qPCR, waarbij Gaplinc-niveaus in BM-cellen worden vergeleken met BMDM's (Fig. 3C). Vergelijkbaar met menselijke GAPLINC. muis Gaplinc wordt snel naar beneden gereguleerd in LPS-gestimuleerde BMDM's (Fig. 3D). Als controle bevestigden we de inductie van ontstekingsgenen The-a en I6 (SI-bijlage. Fig. S8B). Mouse Gaplinc wordt ook snel neerwaarts gereguleerd na activering met verschillende TLR-liganden. Inductie van de positieve-controlegenen ll6 en Ccl5 werden ook bevestigd (SI-bijlage, figuur S8C).

Met behulp van CRISPR hebben we een Gaplinc-knock-out (KO) -muis gegenereerd waarin Exon I en het grootste deel van het eerste intron werden verwijderd (Fig. 3E). Chaplin KO-muizen fokten normaal en vertoonden geen duidelijke ontwikkelingsdefecten. De deletie van Gapline werd bevestigd door PCR-amplificatie van genomisch DNA in wildtype (WT) en Gaplinc KO-muizen, met amplicongroottes van ~ 1.300 bp voor WT en ~ 500 bp voor Gaplinc KO-muizen (Fig. 3E), de volledige strategie voor genotypering om WT en Gaplinc KO's te bevestigen, is gemarkeerd in SI-bijlage, Fig. S9. We bevestigden ook Gaplinc-deficiëntie in BMDM's met behulp van qPCR (Fig. 3F). Om te beoordelen of Gaplinc-deficiëntie de differentiatie beïnvloedde, kleurden we WT- en Gaplinc-KO BMDM's voor CD11B en F4/80; kleurpatronen waren vergelijkbaar, wat duidt op normale macrofaagdifferentiatie (SI-bijlage, Fig. S104). Om te beoordelen of Gaplinc KO de macrofaagfunctie verstoorde, vergeleken we de fagocytose-activiteit in WT- en Gaplinc-KO BMDM's en vonden geen verschillen (SI-bijlage, Fig. S10B).

Om de globale impact van Gaplinc-deficiëntie in macrofagen te beoordelen, hebben we RNA-Seq uitgevoerd op WT- en Gaplinc-KO BMDM's; beide waren onbehandeld en LPS gestimuleerd gedurende 6 uur. In Gaplinc-KO BMDM's was de expressie van 23 genen (weergegeven in rood. Fig. 3G) bij baseline significant omhoog gereguleerd. Deze genen omvatten pro-inflammatoire cytokinen en chemokinen (Il6.l1-a. I1-8, en Cxd10), ISG's (Ifitlbl1), GBP-familieleden (Gbp5 en Gbp0), en celoppervlakmarkers specifiek voor geactiveerde macrofagen (Cd69). GO-analyse bevestigde dat genen die betrokken zijn bij de immuunrespons oververtegenwoordigd zijn in Gaplinc-KO BMDM's bij baseline (Fig. 3H). Deze genen worden typisch opwaarts gereguleerd na LPS-stimulatie (SI-bijlage, figuur S11). Vergelijkbaar met gegevens verkregen uit onze studies bij mensen, suggereren deze gegevens dat:GAPLINSis functioneel geconserveerd over soorten om de expressie van ontstekingsreactiegenen (IRG's) basaal te regelen. Er was geen groot verschil in de genen die werden opgereguleerd na LPS-stimulatie tussen de WT en Gaplinc-KO BMDM's (Dataset S1).

Talrijke studies hebben het vermogen van IncRNA's aangetoond om de transcriptie van naburige genen te reguleren (11). Als zodanig hebben we mogelijke cis-regulerende rollen voor Gaplinc onderzocht, aangezien het naburige gen, Tgif1, eerder is betrokken bij het moduleren van macrofaagactivering (12). Met behulp van onze RNA-Seq-gegevens hebben we bevestigd dat in GaplincKO BMDM's de expressie van Tgifl ten opzichte van T-cellen niet werd beïnvloed (SIAppendir.Fig.S124). We hebben verder door qPCR bevestigd dat Tgifl ongewijzigd was in Gaplinc-KO BMDM's (SI-bijlage, Fig. S12B). Vervolgens hebben we de mogelijkheid onderzocht dat verstoring van de Gaplinc-locus een belangrijk regulerend element, zoals een versterker, zou kunnen verwijderen. We gebruikten ATAC-seq-gegevens van WT BMDM's om transcriptioneel actieve regio's in de Gaplinc-locus te beoordelen (13). We identificeerden geen signalen binnen het Gaplinc-deletiegebied, alleen die welke overeenkomen met de Gaplinc-promoter (SI-bijlage, Fig. S13). Gezamenlijk suggereren deze gegevens dat opregulatie van IRG's bij Gaplinc-deficiëntie niet te wijten is aan effecten op naburige genen of verwijdering van een regulerend element.

Omdat Gaplinc KO in BMDM's de expressie van IRG's onder basale omstandigheden opwaarts reguleert, wilden we vervolgens Gaplinc KO-dieren in vivo uitdagen om verschillen in gastheerrespons waar te nemen. We gebruikten een "endotoxisch shock"-model. waarin Escherichia coli LPS intraperitoneaal (ip) werd geïnjecteerd in WT- en Gaplinc KO-muizen om verschillen in overleving te meten. Bij een dosis van 5 mg/kg/muis. WT-muizen vertoonden 0 procent overleving na 2 dagen (Fig. 30. 100 procent van de Gaplinc KO-muizen overleefde echter, wat erop wijst dat Gaplinc KO-muizen resistent zijn tegen door LPS geïnduceerde endotoxische shock (Fig. 31). , worden significante temperatuurverschillen waargenomen tussen WT en Gaplinc-deficiënte muizen (Fig. 3. Zelfs bij gebruik van een veel hogere dosis LPS van 20 mg/kg, vertonen de Gqplinc-deficiënte muizen een significant overlevingsvoordeel (Fig. 3K). laten deze gegevens zien dat Gaplinc een belangrijke rol speelt bij het reguleren van de immuunrespons in vivo.

Uit onze studies bij mensen weten we dat GAPLINC immuungenen kan reguleren bij baseline. Hoewel er geen verschil is in cytokine-expressie na ontstekingsactivering, is er een verschil in de omvang van de respons omdat de basislijnniveaus verschillen. Om deze overlevingsverschillen in vivo beter te begrijpen, hebben we daarom gekeken naar veranderingen in cytokine-expressie bij aanvang. We gebruikten een gemultiplexte cytokine-array om tegelijkertijd biomarkers te meten die verband houden met de immuunrespons, sepsis en kanker. Bij baseline, belangrijke immuungenen, waaronder MDC. MIP-1a.IL-13. IL-5. en M-CSF was significant verhoogd in het serum van Gqplinc KO-muizen vergeleken met WT (Fig. 44). Deze cytokinen zijn betrokken bij celrekrutering: met behulp van flowcytometrie bevestigden we echter dat het percentage neutrofielen, T-cellen, B-cellen, eosinofielen, monocyten en macrofagen vergelijkbaar was tussen WT en Gaplinc KOmice bij baseline (SI-bijlage, Fig. S14) . Interessant genoeg waren deze percentages ook vergelijkbaar met post-LPS-uitdagingen op de tijdstippen van 6 uur en 18 uur (SI-bijlage, figuren S15 en S16). Verder vertoonde serum van WT- en Gaplinc KO-muizen getest op klinische kenmerken van sepsis, waaronder lactaat en C-reactief proteïne (CRP) (S7-bijlage, Fig. S17), geen verschillen

Aangezien eerder werd gekarakteriseerd dat verhoogde niveaus van MDC of IL-13(Fig. 44) een beschermende rol spelen tegen endotoxische shock door modulatie van pro-inflammatoire cytokines (14,15), onderzochten we vervolgens verschillen in pro-inflammatoire cytokineniveaus , waaronder l6, Il1- , l1- en Cxcl10, na ontstekingsactivering. Hoewel WT- en Gaplinc KO-niveaus hetzelfde zijn op zowel het transcript (Fig. 4B) als het eiwitniveau (SI Appendix, Fig. S18A-C), is de grootte van de verandering veel lager (Fig. 4C), wat suggereert dat deze verminderde vouw verandering kan een rol spelen bij het voorkomen van de gevoeligheid van Gaplinc KO-muizen voor LPS. geïnduceerde endotoxische shock.

Samen met de ongebreidelde productie van cytokines. een ander klinisch aspect van endotoxische shock dat tot sterfte kan leiden, is de vorming van bloedstolsels in de kleinere bloedvaten, wat leidt tot multi-orgaanfalen (16.17). Om dit aan te pakken, analyseerden we het serum van met LPS ip. behandelde muizen om verschillen in coagulatie te beoordelen. Met behulp van een geactiveerde partiële tromboplastinetijd (a) -test die de tijd tot stolselvorming meet, vinden we dat WT-muizen een significant langere tijd vertonen in vergelijking met Gaplinc KO-muizen na LPS-uitdaging (Fig. 4D). Langdurige aPTT-tijden suggereren dat WT-muizen al coagulatie hebben ondergaan en de belangrijkste coagulatiefactoren hebben uitgeput, zodat op het moment van testen, beginnen met stolling en meten, de tijd tot stolselvorming wordt verlengd. De gegevens suggereren dat verschillen in overleving na LPS-uitdaging te wijten zijn aan WT-muizen die een verhoogde stolling ondergaan, wat leidt tot uiteindelijk orgaanfalen en overlijden.

Vervolgens probeerden we mechanisch te begrijpen hoe Gaplinc dit effect bemiddelt. Eerst bevestigden we de lokalisatie en analyseerden we Gaplinc-niveaus in zowel de cytoplasmatische als nucleaire compartimenten van BMDM's door qPCR. Vergelijkbaar met menselijke GAPLINC. muis Gaplinc was voornamelijk cytoplasmatisch (ST Appendix, Fig. S19). Vervolgens hebben we een gemodificeerde uitgebreide identificatie van RNA-bindende eiwitten (ChIRP) uitgevoerd, gekoppeld aan massaspectrometrie en kleine RNA-sequencing, aangezien eerder is aangetoond dat GAPLINC interageert met micro-RNA's (18). We hebben geen interacties waargenomen met eerder geïdentificeerde doelen (SIAppendix, Fig. S20).

Omdat we geen directe bindingspartner konden identificeren, hebben we ons gericht op de geconserveerde functie tussen mensen en muizen, met name de geconserveerde genen die werden beïnvloed in onze menselijke GAPLINC kd en muis Gaplinc KO-onderzoeken, waarvan de meeste NF-kB-regulatoren zijn (Fig. 4E). ). De meest voorkomende vorm van NF-KB geactiveerd door LPS is het p65:p50-heterodimeer, en zeven van de negen geconserveerde genen zijn directe p65-doelen(19). We gebruikten native RNA-immunoprecipitatie (RIP) en toonden aan dat er geen directe interactie is tussen Gaplinc en p65 (S7 Appendix, Fig. S21). In de klassieke NF-kB-signaleringsroute bevinden de p6:p50-subeenheden zich in het cytosol en zijn gebonden tot remmende I-kB- in rustende cellen. Na activering wordt I-KB- afgebroken, waardoor p65:p50 zich naar de kern kan verplaatsen en doelwitgenen kan activeren (20). In WT en Gaplinc-KO BMDM's hebben we de afbraak van I-kB- gemeten met behulp van Western blot en geen verschillen gevonden (Fig. 4F). Vervolgens vergeleken we de totale p65-niveaus in BMDM's. In onze RNA-Seg-gegevens zijn p65 (RelA) -transcriptniveaus in zowel de basale als LPS-gestimuleerde omstandigheden voor WT- en Gaplinc-KO BMDM's vergelijkbaar (SI-bijlage, figuur S22). Toen we echter de totale p65-eiwitniveaus door Western-blot vergeleken, vonden we significant verhoogde p65-niveaus in Gaplinc-KO-cellen in vergelijking met WT (Fig. 4G). Dit suggereert dat Gaplinc de totale p65-niveaus op translationeel niveau reguleert. Bovendien hebben we p65-niveaus in de cytoplasmatische en nucleaire compartimenten beoordeeld en ontdekten dat nucleair p65 meer voorkomt in Gaplinc-deficiënte cellen in vergelijking met WT (Fig. 4H). Gecombineerd suggereren deze gegevens een mechanistische rol voor GAPLINC bij het voorbereiden van de activering van kritieke IRG's.

Discussie

Hier hebben we GAPLINC geïdentificeerd als een geconserveerd cytosolisch tot expressie gebracht IncRNA bij mensen en muizen dat functioneert om inflammatoire genexpressie te beheersen door regulatie van NF-xB. In vergelijking met gerapporteerde cytosolische IncRNA's die de translationele efficiëntie beïnvloeden door eiwitexpressie of ribosoomassemblage te moduleren (21-23), vinden we dat Gapline cytosolisch bijdraagt ​​aan het translatievermogen van p65; het mechanisme van interactie, direct of indirect, moet echter nog worden bepaald. Onze bevindingen bieden inzicht in hoe een functioneel geconserveerd IncRNA de immuunrespons reguleert en bieden mogelijkheden voor onderzoek voor de ontwikkeling van therapieën voor endotoxische shock.