2.6. Expressie van caspase-3 en caspase-6

Glycoside van cistanche kan ook de activiteit van SOD in hart- en leverweefsels verhogen en het gehalte aan lipofuscine en MDA in elk weefsel aanzienlijk verminderen, waardoor verschillende reactieve zuurstofradicalen (OH-, H₂O₂, enz.) door OH-radicalen. Cistanche-fenylethanoïdeglycosiden hebben een sterk wegvangend vermogen van vrije radicalen, een hoger reducerend vermogen dan vitamine C, verbeteren de activiteit van SOD in spermasuspensie, verminderen het gehalte aan MDA en hebben een zeker beschermend effect op de functie van het spermamembraan. Cistanche-polysacchariden kunnen de activiteit van SOD en GSH-Px in erytrocyten en longweefsels van experimenteel senescente muizen veroorzaakt door D-galactose verbeteren, evenals het gehalte aan MDA en collageen in long en plasma verminderen en het gehalte aan elastine verhogen, hebben een goed wegvangend effect op DPPH, verlengt de tijd van hypoxie bij senescente muizen, verbetert de activiteit van SOD in serum en vertraagt ​​de fysiologische degeneratie van de longen bij experimenteel senescente muizen Met cellulaire morfologische degeneratie hebben experimenten aangetoond dat Cistanche het goede antioxiderende vermogen heeft en heeft het potentieel om een ​​medicijn te zijn om huidverouderingsziekten te voorkomen en te behandelen. Tegelijkertijd heeft echinacoside in Cistanche een aanzienlijk vermogen om DPPH-vrije radicalen op te vangen en heeft het het vermogen om reactieve zuurstofsoorten op te vangen en door vrije radicalen veroorzaakte collageenafbraak te voorkomen, en heeft het ook een goed herstellend effect op schade door anionen door vrije radicalen van thymine.

Klik hier om Cistanche Tubulosa te kennen voor antioxidanten

【Voor meer informatie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

TgAPP-muizen vertoonden een toename in caspase{0}} genexpressie (Figuur 8C1, H1), die significant en meer dan 30 procent was in vergelijking met de hippocampi van WT-muizen (Figuur 8H1; p < 0,05). Wat caspase-6-expressie betreft, werden geen verschillen waargenomen tussen transgene en niet-transgene muizen (Figuur 8C2, H2).

Behandelingen met quercetine en rutine waren in staat de caspase{{0}} mRNA-niveaus in de hippocampus op een statistisch significante manier te verlagen (Figuur 8H1; p < 0.05), met remmingspercentages van ongeveer 17 procent en 27 procent voor respectievelijk vrouwelijke en mannelijke muizen. In de hersenschors werden alleen significante verschillen waargenomen bij de behandeling met rutine bij mannen (Figuur 8C1; p < 0,05).

Over behandelingen met caspase-6, quercetine en rutine hadden geen statistisch significant effect in de cortex of de hippocampus (Figuur 8C2, H2), hoewel in laatstgenoemde caspase-6 bij TgAPP-mannetjes de neiging vertoonde afnemen (Figuur 8H2).

2.7. Ontstekingsmarkeringen

De verkregen resultaten voor genexpressie van de inflammatoire mediatoren IL-1, TNF- en IFN- worden getoond in Figuur 9.

In de TgAPP was er een significante toename in IL{0}} genexpressie van ongeveer 20 procent in de cortex en hippocampus bij beide geslachten in vergelijking met WT-muizen (Figuur 9C1, H1; p < 0,05). Wat betreft TNF-, hoewel hogere mRNA-niveaus worden getoond in TgAPP, zijn ze niet statistisch significant in WT-muizen (Figuur 9C2, H2). Wat IFN- betreft, was er een toename van ongeveer 30 procent in de expressie ervan bij mannen, wat alleen statistisch significant was in de cortex (Figuur 9C3; p < 0,05).

Behandelingen met quercetine en rutine, zowel bij vrouwen als bij mannen, waren in staat de IL{{0}}-expressie in de hersenschors en de hippocampus te verminderen in vergelijking met controle-TgAPP-muizen (Figuur 9C1, H1; p < {{8 }}.05), waarbij waarden worden verkregen die vergelijkbaar zijn met die van WT-muizen, en met name lager in de hippocampi van mannelijke muizen (Figuur 9H1; p < 0,05).

Het algehele effect van beide flavonoïdebehandelingen op IL{0}}-expressie werd niet waargenomen met TNF- noch met INF-. Aldus ondergingen TgAPP-mannetjes, na behandeling met quercetine, een significante afname in hippocampale TNF- (Figuur 9H2; p < 0.05) en in corticale IFN-expressie (Figuur 9C3; p < 0,05).

2.8. Beoordeling van degenererende neuronen en hun projecties

Er werden geen kenmerkende tekenen van neurodegeneratie waargenomen op de leeftijd waarop de transgene TgAPP-muizen werden getest, vergeleken met WT-muizen, noch vertoonden behandelingen met quercetine en rutine gedurende 4 weken enige verandering in vergelijking met TgAPP (Figuur S1, aanvullende gegevens).

2.9. Expressie van ionotrope glutamaatreceptoren

Er werden geen significante verschillen gevonden in receptorexpressie, waarbij de verkregen waarden voor de controle-TgAPP-muizen werden vergeleken met die verkregen voor de WT-muizen. Er waren ook geen opmerkelijke effecten op de expressie van deze ionotrope receptoren in de aanwezigheid van behandeling met quercetine of rutine (tabel S5, aanvullende gegevens).

3. Discussie

Het doel van onze huidige studie was om de impact van twee flavonoïden, quercetine en rutine, in de eerste stadia van AD-pathogenese te beoordelen, ongeacht hun effect op neurodegeneratie en / of cognitieve functie. De cortex en de hippocampus waren de gebieden van de hersenen die werden geanalyseerd, aangezien zij de meest aangetaste hersenstructuren zijn bij AD. Er moet rekening mee worden gehouden dat quercetine en rutine werden toegediend via een geformuleerd dieet dat een van de twee flavonoïden bevatte, om in een AD-diermodel de inname van een gezond menselijk dieet met een actief ingrediënt na te bootsen.

Met name de transgene APPswe in de C57B6-muis hadden een significante invloed op de GSH/GSSG-ratio, MDA-niveaus, antioxidant-enzymcapaciteit, APP-expressie, BACE1-activiteit en caspase-3- en IL-1-expressie. Hoewel APP-mutaties bij mensen over het algemeen resulteren in typische AD, zijn ze voornamelijk gekoppeld aan uitsluitend amyloïde pathologie in APP-transgene muizen en is er geen merkbare neurodegeneratie [14,15], aangezien er geen karakteristieke tekenen werden waargenomen in onze transgene muizen TgAPP, in tegenstelling tot de WT-muizen (aanvullende gegevens, figuur S1). Door tegenkleuring met 40 -6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) van hippocampale neuronen konden we de nucleaire morfologie observeren, aangezien deze verbinding een fluorescerende kleurstof is voor nucleïnezuren. We hebben geen gefragmenteerde of lobulaire kernen waargenomen, typisch apoptotisch; evenmin hebben we opmerkelijke verschillen waargenomen bij het vergelijken van de histologische secties van de hippocampus van de transgene controlelijn TgAPP met betrekking tot de WT-secties; evenmin hebben we enige verschillen waargenomen tussen de quercetine- en rutinebehandelingen met betrekking tot de controle-TgAPP-muizen.

In het panel van te analyseren AD-biochemische kenmerken, hebben we ons primair gericht op het bepalen van de GSH/GSSG-ratio op elk van de twee flavonoïde diëten, aangezien uitputting van GSH-niveaus een van de belangrijkste vroege biochemische markers in AD vertegenwoordigt [16,17 ] en is waargenomen tijdens de pathogenese en ziekteprogressie. Meting van de GSH-waarden in de hersenen [18] en, meer recentelijk, de GSH-waarden in het bloed [19] zijn veelbelovend als diagnostische markers voor de vroege stadia van AD. Bovendien zijn er ook pogingen gedaan om endogene GSH-voorraden aan te vullen door zichzelf of hun voorlopers [20-22]. In onze studie werd een afname van het cellulaire reducerende vermogen (GSH/GSSG) waargenomen bij de TgAPP-muizen met betrekking tot WT-dieren, zowel bij mannetjes als vrouwtjes, en in beide hersengebieden. In de cortex en de hippocampus van zowel WT- als TgAPP-muizen was de GSH/GSSG-ratio lager bij mannen dan bij vrouwen. Quercetine- en rutinediëten verhoogden de GSH/GSSG-ratio aanzienlijk in vergelijking met onbehandelde TgAPP-muizen, en deze toename was meer uitgesproken in de hippocampus. De veranderingen in GSH- en GSSG-niveaus en GSH/GSSG-ratio na behandeling met quercetine of rutine van mannen, met betrekking tot toenemende redoxkracht, waren prominenter dan bij vrouwen. De resultaten van onze bepalingen kunnen een belangrijke basis onthullen die ten grondslag ligt aan seksegerelateerde verschillen in Tg2576-muizen in de gevoeligheid voor de oxidatieve schade van macromoleculen aan de ene kant, aangezien het glutathionsysteem een ​​veelzijdig reductiemiddel is in meerdere biologische functies, en in de impact van preventieve flavonoïde diëten bij het herstellen van de fysiologische status aan de andere kant. Zoals we in deze discussie zullen zien, hebben we de toename van de GSH/GSSG-ratio ingesteld als de hoofdas die de reeks effecten die in de TgAPP-muizen worden waargenomen, zou kunnen verklaren.

Onlangs is voorgesteld dat de GSH/GSSG-verhouding, in plaats van simpelweg te functioneren als een redoxbuffer, in plaats daarvan zou werken als een belangrijk regulerend mechanisme, waardoor eiwitten hun oorspronkelijke conformatie en functionaliteit kunnen bereiken door de thiol-disulfidebalans van de cellulaire proteoom. Kortom, het glutathionsysteem ontstaat als essentieel voor het behoud van een gezond proteoom, wat aantoont dat verstoring van de glutathion-redoxhomeostase (dwz genetisch of farmacologisch) de eiwitaggregatie verhoogt als gevolg van verstoringen in de werkzaamheid van autofagie [23]. Daarom kunnen strategieën gericht op het handhaven van glutathion-redox-homeostase therapeutisch potentieel hebben bij ziekten die verband houden met eiwitaggregatie, zoals AD. Nauw verwant aan het behoud van het proteoom is de ubiquitine-proteasoomafbraakmachine, die betrokken is bij de pathogenese van AD. Het proteasoom degradeert selectief meerdere substraten die cruciaal zijn bij het handhaven van neuronale homeostase, inclusief het katabolisme van geoxideerde en geaggregeerde eiwitten. BACE1 ondergaat alomtegenwoordigheid en het is aangetoond dat het blokkeren van de ubiquitine-proteasoomroute de afbraak van BACE1 remt en bijgevolg leidt tot een verhoogde productie van BACE1-enzymatische activiteit, meer splitsingsproduct C99 en toename van zowel A 1-40 als A { {8}} in neuronale en niet-neuronale cellen [10]. Onze eerdere studies hebben aangetoond dat zowel flavonoïden, quercetine als rutine, verschillende signaalroutes en moleculaire netwerken beïnvloeden die geassocieerd zijn met de modulatie van de proteasoomfunctie in neuroblastoomcellen [9]. Bovendien is aangetoond dat neuronen aangevuld met gereduceerd glutathion (GSH) de proteasoomactiviteit herstelden en aggregaatvorming verminderden [11] aangezien de proteasoomfunctie redoxstatus-gereguleerd is [24]. Daarom is de toename van de GSH/GSSG-verhouding die de dieren ervaren bij het volgen van een quercetine- of rutinedieet consistent met de modulatie van het proteasoom door quercetine en rutine, zoals eerder ex vivo aangetoond.

Zoals eerder vermeld, leidt redox-onbalans tot sterk oxidatief gemodificeerde eiwitten die de neiging hebben zich op te hopen en aggregaten te vormen, wat resulteert in proteasoomstoornissen [25]. Dus, gezien de cruciale rol van oxidatieve stress in de pathogenese van AD, werden biomarkers van oxidatieve stress, waaronder lipideperoxidatie (MDA-niveaus) en antioxidant-enzymen, beoordeeld in de cortex en hippocampus in de TgAPP- en WT-muizen. SOD, CAT, GR en GPx zijn de belangrijkste antioxiderende enzymen die werken tegen vrije zuurstofradicalen en het metabolisme van vrije radicalen in het lichaam reguleren en een rol spelen in het systeem voor het opruimen van vrije radicalen, waarbij de cellen in het lichaam worden beschermd tegen lipideperoxidatie . In onze studie werd, als gevolg van APP-overexpressie, een algemene afname van antioxiderende enzymactiviteiten waargenomen bij TgAPP-muizen in vergelijking met WT-muizen, wat statistisch significant is voor CAT. Consistent met verlaagde GSH-niveaus, was de lipideperoxidatie significant verhoogd in de TgAPP-muizen. Hoewel de bron van oxidatieve stress bij AD bij de mens zeer complex en multifactorieel is, lijkt de amyloïde-pathologie die bij muizen is ontwikkeld voldoende om het pathologische proces op gang te brengen dat leidt tot verhoogde oxidatieve stress in de hersenen [26]. Met rutine behandelde dieren ervoeren een toename van CAT-activiteit in de cortex en GR-activiteit in de hippocampus, zowel bij mannetjes als vrouwtjes. Alleen dieren die met rutine werden behandeld, ervoeren veranderingen in genexpressie van CAT en GR in de cortex en de hippocampus bij zowel mannetjes als vrouwtjes en GPx in de hippocampi van vrouwtjesmuizen. In deze context is aangetoond dat verschillende natuurlijke verbindingen de overspraak tussen de proteasoom- en redoxregulatie beïnvloeden. Nauwkeuriger gezegd, quercetine is een bekende Nrf2-activator [27] die antioxiderende eigenschappen vertoont door de proteasoomfunctie te stimuleren, een verhoogde weerstand tegen oxidatieve stress te bevorderen en een langere levensduur van de cellen te verlenen [28].

Weefselspecifieke expressie van BACE1 is van cruciaal belang voor normale APP-verwerking en de ontregeling ervan kan een rol spelen bij de pathogenese van AD. BACE1 komt voornamelijk tot expressie in hippocampale neuronen, de cortex en de cerebellaire granulaire laag [10]. Opgemerkt moet worden dat eerdere studies hebben aangetoond dat Zweedse gemuteerde APP-transgene muizen significant verhoogde hersenniveaus van A hadden bij een stabiele toestand [29], wat suggereert dat BACE1 een essentiële rol speelt in de amyloïdogene route in AD-pathogenese en een goed therapeutisch doelwit is. voor AD-behandeling. In onze studie hebben we een significante vermindering van de BACE1-activiteit waargenomen bij behandelingen met quercetine en rutine, wat zou kunnen bijdragen aan de afname van A-afzetting bij muizen. We stellen dat meer dan alleen werken als BACE1-remmers van het enzym, quercetine en rutine, een vermindering van de BACE1-activiteit zou kunnen veroorzaken die verband houdt met een toename van de verhouding GSH / GSSG, gebaseerd op de hypothese van het verbeteren van het herstel van proteasoomactiviteit. In die zin is bekend dat het richten van BACE1-remmers op de -splitsingsplaats van APPswe (Zweedse mutatie) plaatsvindt voordat het het plasmamembraan bereikt, terwijl APPwt (Wild-type) wordt verwerkt in een vroeg endosoom dat zijn oorsprong vindt op het celoppervlak. Daarom is BACE1 dat APPwt splitst soms gebonden aan de BACE1-remmer op het celoppervlak vóór APP-verwerking, maar het enzym dat APPswe verwerkt is dat niet [30]. Het is om deze reden dat de afwijkende lokalisatie van APPswe-verwerking de potentie van quercetine en rutine als BACE1-remmers aanzienlijk zou kunnen verlagen. We zijn dus meer geneigd te ondersteunen dat de afname van de BACE-activiteit in dit in vivo model niet zozeer te wijten is aan de remming van het enzym, maar aan de toename van de GSH/GSSG-ratio. In ieder geval zou de verminderde BACE1-activiteit geïnterpreteerd kunnen worden als een vermeende poging om de -amyloïdeproductie in de TgAPP-muizen te verminderen. Wat betreft het meest opmerkelijke effect van quercetine en rutine in de hippocampus op BACE1-activiteitsverzwakking, is het vermeldenswaard dat de cortex een significant hogere neuronendichtheid heeft dan de hippocampus [31], en selectieve verslechtering van het proteasoom in AD pathologisch fenotype maakt de cortex kwetsbaarder en aangetast dan de hippocampus [32].

Na het bepalen van het effect van de behandelingen op de BACE1-enzymactiviteit, waren we geïnteresseerd in het evalueren van de expressie ervan. Vreemd genoeg werden er geen significante verschillen in BACE1-expressie gevonden tussen TgAPP-muizen in vergelijking met WT-muizen, en er werden geen merkbare veranderingen waargenomen bij behandeling met quercetine of rutine. Daarom lijkt het erop dat de toename van de activiteit van het BACE1-enzym niet gepaard gaat met een toename van de expressie. In dit verband is het opmerkelijk dat Apelt et al. [14] vond een toename in corticale BACE1-activiteit bij Tg2576-muizen in de leeftijd tussen 9 en 13 maanden, terwijl het expressieniveau van BACE1-eiwit en mRNA niet veranderde met de leeftijd. Bovendien is er bewijs gevonden dat ondersteunt dat fibrillair amyloïde A 1-42., in plaats van oplosbaar amyloïde A 1-42, de BACE1-eiwitexpressie kan opwaarts reguleren, en dus kunnen kleine wijzigingen in de verhouding van amyloïde isovormen amyloïde aggregaatconformaties en celbeschadiging moduleren [ 33]. De afwezigheid van verandering in BACE1-expressie na een toename van de activiteit die we hebben gevonden, kan dus de prevalentie verklaren van oplosbaar amyloïde A 1-42 ten opzichte van de fibrillaire amyloïde A 1-42 isovorm in ons muismodel TgAPP.

Na de bepaling van genexpressie van de enzymen die betrokken zijn bij APP-verwerking, evalueerden we het effect van quercetine en rutine op het enzym-secretase dat betrokken is bij de niet-amyloïdogene verwerking van APP. We hebben ons gericht op ADAM10 omdat het de fysiologisch belangrijkste constitutieve isovorm van -secretase is. ADAM10 gaat de vorming van neurotoxische oligomere A-plaques tegen door APP binnen het A-domein te splitsen om sAPP- en C-terminale fragmenten (-CTF) te produceren [34,35]. Hoewel de veranderingen in ADAM10-expressie die in ons onderzoek werden gevonden niet statistisch significant waren, werd een lichte afname in ADAM10-expressie waargenomen bij TgAPP-muizen ten opzichte van WT-muizen. Vooral de behandeling met rutine vertoonde de neiging om de ADAM10-genexpressie te verhogen in beide hersengebieden die werden bestudeerd. Postine et al. [36] toonde aan dat de opwaartse regulatie van wildtype ADAM10 in de hippocampus van een AD-muismodel de sAPP-secretie medieerde, wat leidde tot de remming van het genereren van A-plaques. Het effect van quercetine is bestudeerd in een door aluminiumchloride geïnduceerd AD-rattenmodel dat een significante verbetering van de -secretase (ADAM10 en ADAM17) in de hippocampus laat zien in vergelijking met onbehandelde ratten. Dit geeft aan dat quercetine het potentieel bezit om de niet-amyloïdogene route te verhogen door de activering van -secretase-genen [37]. Preklinische gegevens versterken de hypothese dat het verbeteren van de sAPP-niveaus in de hersenen een potentiële strategie is om AD-gerelateerde symptomen te verbeteren en synaptische tekorten te verminderen. ADAM10 en BACE1 strijden om de APP-splitsing, daarom zou het versterken van ADAM10-activiteit de vorming van neurotoxisch amyloïde kunnen remmen. Bovendien kan sAPP de activering van de stress-JNK-signaleringsroute voorkomen, wat leidt tot de activering van door NF-KB geïnduceerde fosforyleringsactiviteit, wat leidt tot proteasoomafbraak [38]. Daarom wordt de vorming en accumulatie van ziektegerelateerde eiwitaggregaten aanzienlijk verminderd en wordt de cellulaire proteasoomactiviteit verbeterd, waardoor bewijs wordt geleverd voor een functie van sAPP bij de regulatie van proteostase [39]. Bovendien is aangetoond dat sAPP specifiek de synthese van glutamaat-AMPA-receptoren en het transport ervan opwaarts reguleert [40]. In onze studie hebben we onderzocht of de lichte toename van ADAM10-expressie na behandeling met rutine enige invloed uitoefent op glutamaterge synaptische transmissie. Zoals getoond in de sectie Aanvullende gegevens, werden er geen significante effecten op de expressie van deze ionotrope receptor waargenomen bij diëten met quercetine en rutine, mogelijk als gevolg van een zwakke toename van ADAM10-expressie, wat niet voldoende is voor de opregulatie van de AMPA-receptor (aanvullende gegevens , Afbeelding S2 en Tabel S5).

Er moet rekening worden gehouden met het feit dat in-vitro-onderzoeken een grote verscheidenheid aan ADAM10-substraten hebben aangetoond [41], en daarom kunnen ongewenste effecten die worden verkregen door niet-specifieke ADAM10-targeting worden gevonden bij kankerproliferatie, celadhesie, promotie van T-cel/NK-celprecursor en ontsteking, etc. [42]. Om deze beperking te omzeilen, stelt onze studie een strategie voor die erop gericht is de afgifte van sAPP meer fysiologisch te bevorderen. Deze benadering zou gebaseerd kunnen zijn op een langdurige inname van een actief ingrediënt (quercetine of rutine), dat wordt geconsumeerd via een gezond menselijk dieet. Er zijn echter verdere studies nodig om erachter te komen of de toename van ADAM10 dosisafhankelijk is van flavonoïden en of de mogelijke gunstige effecten opwegen tegen de vermeende bijwerkingen.

Wat betreft de expressie van APPswe: hoewel de insertie van het menselijke APP-transgen in het muizengenoom garandeert dat APPswe vanaf de geboorte tot overexpressie wordt gebracht, is gerapporteerd dat APP-mRNA- en eiwit-hippocampusniveaus significante fluctuaties vertonen tijdens de ontwikkeling van dieren, wat maximaal is wanneer muizen zijn asymptomatisch (1-maand oud) en afnemend wanneer volledige symptomatologie optreedt [43]. Ondanks dit probleem was de APP-expressie zowel in de cortex als in de hippocampus significant hoger in vergelijking met die van WT-muizen in ons onderzoek. Verdere behandeling met quercetine of rutine was in staat om deze expressie significant te verminderen voor zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, in beide delen van de hersenen. Deze bevindingen komen overeen met die gerapporteerd door Augustin et al. [44] die een gestandaardiseerd extract van Ginkgo biloba (Egb761), rijk aan flavonolen zoals quercetine, bestudeerde in 4-maanden oude vrouwelijke TgAPP-muizen, waarbij hij verlaagde APP-mRNA- en eiwitniveaus aantrof. Rekening houdend met het feit dat opwaartse regulatie van APP-translatie in Tg2576-muizen plaatsvindt in de prodromale en vroege symptomatische stadia [45], is het waarschijnlijk dat herstel van APP-translatie door quercetine of rutine kan hebben plaatsgevonden in onze TgAPP-muizen en, waarschijnlijk, in een vroeg stadium. symptomatisch stadium, wat resulteert in een verlaging van corticale en hippocampale niveaus van APP, BACE1-activiteit en caspase{10}}-activering.

Bovendien is elders gemeld dat er bij Tg2576-muizen (bij afwezigheid van neuronaal verlies) een toename is in caspase-3-activering in de hippocampus [46], zoals gevonden in ons onderzoek, bij het begin van geheugenstoornis. , samen met een vermindering van dendritische stekels vóór de afzetting van extracellulair amyloïde [46]. Er zijn aanwijzingen voor niet-apoptotische rollen voor caspasen in het zenuwstelsel zonder neuronale dood [47], en caspase-3-activiteit is gelokaliseerd in dendritische stekels waar het de calcineurinespiegels kan verhogen. Op zijn beurt wordt gedacht dat de defosforylering van de GluR1-subeenheid van AMPA-achtige receptoren, veroorzaakt door calcineurine, resulteert in postsynaptische disfunctie. Onze waarden van caspase-3-expressie, als gevolg van transgenese, komen overeen met die verkregen door andere onderzoekers die een toename in caspase-3-expressie rapporteerden op het niveau van dendritische stekels in de hippocampus van TgAPP-muizen [48]. Aangezien APP drie verschillende splitsingsplaatsen bevat voor caspase-3 in zijn aminozuursequentie, waarvan er twee zich bevinden op het niveau van het extracellulaire domein en één in het intracellulaire C-terminale deel van de APP-staart [49], hydrolyse van APP door caspase-3 kan de proteolytische verwerking van APP veranderen ten gunste van de amyloïdogene route [50], wat leidt tot de afgifte van een cytotoxisch C-terminaal afgeleid peptide met een lengte van 31 aminozuren (C31), voor voorbeeld [51]. Dit suggereert dat, aangezien caspase-3 de amplificatie van de afgifte van toxische fragmenten uit APP kan mediëren, het verlagen van caspase-3-expressie door quercetine of rutine de klaring van geaggregeerd eiwit mogelijk kan maken. Bovendien hebben we, zoals eerder vermeld, de invloed onderzocht van zowel de toename als de afname van caspase-3-expressie in glutamaterge synaptische transmissie, gebaseerd op het vermogen van door calcineurine geactiveerd caspase-3 om de GluR1-subeenheid te defosforyleren van AMPA-receptoren op postsynaptisch niveau. Deze moleculaire modificaties veranderen glutamaterge synaptische transmissie en neuronale plasticiteit op het niveau van dendritische stekels in de hippocampus [48]. Theoretisch zou farmacologische remming van caspase-3-activiteit in TgAPP-muizen de AD-achtige fenotypes kunnen redden van een mechanisme dat synaptisch falen veroorzaakt. Ondanks de toename in caspase-3-expressie in onze TgAPP-muis, vonden we echter geen significante verschillen in AMPA-receptorexpressie in vergelijking met die in WT-muizen, zoals eerder vermeld. Het kan zijn dat de veranderingen in caspase-3-expressie niet prominent genoeg zijn om significante wijzigingen in AMPA-receptorexpressie te veroorzaken (aanvullende gegevens, figuur S2 en tabel S5).

Wat betreft de waarden van caspase-6-expressie, werden er geen significante verschillen gevonden tussen TgAPP- en WT-muizen. Activering van caspase-6 is geïdentificeerd als een belangrijke bemiddelaar van neuronale stress die belangrijke cytoskeletale eiwitten (Tau en -tubuline) splitst, waardoor de ubiquitine-proteasoomafbraak van verkeerd gevouwen eiwitten wordt verstoord, en verschillende actine-regulerende postsynaptische dichtheid eiwitten [52]. De ongewijzigde expressie van caspase -6 in ons onderzoek komt overeen met de afwezigheid van karakteristieke tekenen van neurodegeneratie op de leeftijd waarop deze transgene muizen werden geëvalueerd, vergeleken met de WT-muizen (aanvullende gegevens, figuur S1).

Een duidelijke toename van neuro-inflammatoire mediatoren is waargenomen bij AD-patiënten, voornamelijk rond seniele plaques [53-55]. Astrocyten zijn de belangrijkste leverancier van GSH aan microglia en neuronen. Tijdens chronische ontsteking en oxidatieve stress geven astrocyten toxische ontstekingsmediatoren en vrije radicalen vrij, waardoor de activering van microglia en neurodegeneratie wordt versneld [56]. Het is vermeldenswaard dat verminderde intracellulaire glutathion verband houdt met de activering van de ontstekingsroutes, p38 MAP-kinase, Jun-N-terminale kinase (JNK), NF-KB, in menselijke microglia en astrocyten [57]. In dit verband hebben we besloten om de niveaus van IL-1, IFN- en TNF- in ons diermodel te kwantificeren en het effect van quercetine en rutine daarop te bepalen. Zoals bekend bevordert ontsteking een gebrekkige verwerking van A-peptide en APP, waardoor A-peptide-aggregatie wordt bevorderd en op zijn beurt de A-reactiviteit wordt gewijzigd [58]. In onze studie hebben we dus waargenomen dat TgAPP-muizen verhoogde mRNA-niveaus van de pro-inflammatoire mediatoren IL-1 , TNF- en IFN- hadden, in vergelijking met WT-muizen, wat aantoont dat overexpressie van APPswe neuro-inflammatoire cascades zou kunnen veroorzaken. het triggeren van een reeks moleculaire routes in glia en neuronen, die de ontstekingsreactie zouden activeren. Quercetine en rutine waren in staat de IL-1-genexpressie te verzwakken bij zowel mannen als vrouwen en de bestudeerde hersengebieden. Verschillende bewijzen ondersteunen het ontstekingsremmende effect dat wordt uitgeoefend door quercetine op CZS-niveau, aangezien het de activering van transcriptiefactoren kan remmen, zoals de nucleaire factor-kappa B (NF-KB) [59], betrokken bij de inductie van iNOS, en verminder daarom de afgifte van mediatoren zoals IL-1 , TNF- en IFN- [60]. Met betrekking tot de impact van GSH op de ontstekingsreactie moet worden opgemerkt dat GSH betrokken is bij het handhaven van optimale cytokineniveaus op een zodanige manier dat de expressie van pro-inflammatoire cytokines (TNF-, IL-1 en IL -6) zijn verhoogd als gevolg van GSH-uitputting, terwijl de expressie van ontstekingsremmende cytokines (dwz IL-10) ongewijzigd bleef. Deze GSH-homeostase-verandering vindt plaats als gevolg van opregulatie in NF-KB- en JNK-signaleringsroutes, wat de haalbare apoptotische route naar neuronale celdood zou kunnen zijn [61]. In onze studie zou neerwaartse regulatie van NF-KB door quercetine en rutine een plausibel mechanisme kunnen zijn om de GSH/GSSG-homeostase te herstellen en daarmee de oorzaak van de balans tussen pro-inflammatoire en ontstekingsremmende cytokines. Ten slotte, aangezien de BACE1-promotor een NF-KB-bindingsplaats heeft, vergemakkelijkt de door ontsteking geïnduceerde activering van NF-KB de opwaartse regulatie van BACE1-expressie en verhoogt vervolgens de A-productie [62]. Dus als neerwaartse regulatie van NF-KB optreedt bij diëten met quercetine en rutine, zou de BACE1-activiteit afnemen als gevolg van de afgifteregulatie van pro-inflammatoire en niet ontstekingsremmende cytokines.

4. Materiaal en methoden

4.1. Experimentele dieren

Een transgene muis (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) die de Zweedse dubbele mutatie van humaan amyloïde precursoreiwit (hAPP) tot expressie brengt, werd gebruikt als het diermodel van experimenteel AD [14]. De muis is een knock-in heterozygote lijn die de menselijke A PP695-isovorm tot expressie brengt met de dubbele Zweedse mutatie (K670N/M671L; Lys670→Asn en Met671→Leu) onder de controle van de hamster-prioneiwitpromotor [63]. Als resultaat vertoont deze muis niveaus van humaan amyloïde-precursoreiwit (A PP), zes keer hoger dan die van de A PP-niveaus van een muis. Bovendien vertoont deze muis hogere niveaus van A 40 en A 42. A-afzettingen beginnen op de leeftijd van 9 maanden [63]. Binnen de hippocampus en cortex van Tg2576 is APPswe-transgenexpressie voornamelijk neuronaal [64].

Als negatieve controle werden wildtype (WT) muizen uit dezelfde kolonie [65,66] gebruikt. De Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) muizenkolonie werd in ons laboratorium ontwikkeld uit Tg2576 heterozygote mannetjes en wildtype vrouwtjes. De transgene ouders werden geschonken door Dr. Diana Frechilla van de afdeling Neurowetenschappen van het Centrum voor Toegepast Medisch Onderzoek aan de Universiteit van Navarra (Pamplona, ​​Spanje) [67].

De dieren werden gehuisvest in afzonderlijk geventileerde kooien en gehouden bij 22-24 ◦C op een 12- uur licht/donker-cyclus bij een luchtvochtigheid van 50-60 procent. Dierprotocollen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Complutense Universiteit van Madrid en waren volledig in overeenstemming met de Europese Richtlijn 2010/63/betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en de Spaanse wetgeving inzake dierenwelzijn ( Koninklijk Besluit 53/2013, 1 februari 2013).

4.2. Genotyperingsanalyses van muizen

Transgeniciteit werd binnen 30 dagen na de geboorte bepaald door middel van een staartbiopsie. Genotyperingsanalyses van dieren werden uitgevoerd met PCR. Gezien het feit dat Tg2576 (TgAPP) een heterozygote lijn is, werd het insertiegen (PrP, van prioneiwit) gebruikt als een positieve reactiecontrole. Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit muizenstaarten die waren gedigereerd met proteïnase K (0.1 µg/µL) in NID-buffer (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM MgCl2, 0,05 procent gelatine, 0,45 procent NP-40 en 0,4 procent Tween 20) bij 56 ◦C gedurende 3 uur en geschud. DNA-fragmenten werden geprecipiteerd met isopropanol en gewassen met 70 procent ethanol. DNA-precipitaten werden opgelost in 30 µl TE-buffer (10 mM Tris-1 mM EDTA). De zuiverheid en concentratie van DNA werden bepaald bij 260 en 280 nm.

De PrP- en APP-genen werden geamplificeerd door PCR. Sequenties van primers die werden gebruikt om de transgene muizen te screenen waren als volgt: PrP forward: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP omgekeerd: GTGGATACCCCTCCCCCAGCCTAGACC; APP omgekeerd: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. De stappen van de PCR-reactie waren als volgt: denaturatie bij 94 ◦C gedurende 90 s, 39 cycli bij 60 ◦C gedurende 60 s en 72 ◦C gedurende 90 s, daarna uiteindelijke verlenging bij 72 ◦C gedurende 7 minuten.

In alle gevallen werden negatieve controles (zonder DNA-schimmel) en positieve controles van het APP-gen overwogen. De verkregen PCR-producten werden gescheiden door elektroforese in 1,5 procent agarosegels in 0.5X TBE (Tris-Boraat-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) buffer bij 70 V (constante spanning) en vervolgens afgebeeld door kleuring met GelRood (Millipore).

4.3. Dierlijke behandelingen

TgAPP-muizen en wildtype nestgenoten, beide 6-7 weken oud met een aanvankelijk lichaamsgewicht van 16,2 ± 0,8 g, werden gerandomiseerd in de volgende vier groepen (n=8/groep): ( a) Onbehandelde TgAPP; (b) Met quercetine behandeld TgAPP; (c) met rutine behandeld TgAPP; en (d) onbehandeld wildtype. Omdat zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden bestudeerd, werden twee reeksen groepen opgericht. Op de leeftijd van 45 weken begonnen de muizen gedurende 4 weken met quercetine of rutine te worden behandeld.

Quercetine (3,30,40,5,7-pentahydroxyflavon) en rutinehydraat (quercetine-3-O-rutinosidehydraat) waren meer dan of gelijk aan 95 procent zuiver en gekocht bij Sigma–Aldrich. Elk van de flavonoïden werd opgenomen in een standaarddieet (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Spanje) in een concentratie van 200 ppm, overeenkomend met een inname van 30 mg flavonoïde/kg lichaamsgewicht/dag. De onbehandelde muizen kregen uitsluitend het niet-aangevulde standaarddieet. Diëten en water werden verstrekt voor ad libitum inname.

4.4. Voorbereiding van hersenweefsel voor biochemische en histologische assays

Aan het einde van de behandeling werden muizen 's nachts gevast, werden ze geëuthanaseerd met behulp van cervicale dislocatie en werden de hele hersenen snel verwijderd. De hersenen werden gespoeld in een zoutoplossing van 4 ◦C en het arachnoïde membraan werd voorzichtig verwijderd. Vervolgens werden de hippocampus en cortex geïsoleerd. Monsters werden onmiddellijk bewaard bij -80 ◦C tot verder gebruik.

De volledige hersenen van sommige dieren werden gebruikt voor het verkrijgen van histologische secties, waarvoor, eenmaal geëuthanaseerd met behulp van cervicale dislocatie, de hersenen werden ingevroren door onderdompeling in isopentaan bij -80 ◦C. Onmiddellijk daarna werden coronale secties van de hersenen (30 µm dik) gemaakt van de bulbus olfactorius tot het cerebellum, 120 µm uit elkaar in een cryostaat (Leica CM1850, Nussloch, Duitsland). De hele procedure werd uitgevoerd bij −20 ◦C. Histologische secties werden verzameld op objectglaasjes en bij -80 ◦C bewaard tot analyse (zie aanvullende methoden).

4.5. Glutathion

Voor glutathiontesten werden cerebrale cortex- en hippocampusmonsters gehomogeniseerd in een redox-quenchingbuffer -5 procent trichloride-azijnzuur (RQB -5 procent TCA) (eerder 15 minuten met N2 geborreld op ijs) bij een concentratie van 25 mg/ml (w/v). Monsters werden geresuspendeerd door sonicatie gedurende 10 seconden, vervolgens gecentrifugeerd bij 12,{8}}× g gedurende 10 minuten bij 4 ◦C, en supernatanten werden verzameld.

Vervolgens werden in het verkregen supernatant spectrofluorometrische methoden gebruikt om GSH- en GSSG-niveaus te bepalen met behulp van de o-ftaalaldehyde-methode, beschreven door Senft et al. [68]. GSH- en GSSG-waarden werden gecorrigeerd voor spontane reactie bij afwezigheid van een biologisch monster. In beide gevallen werden supernatanten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd en daarna werd de fluorescentie gemeten met behulp van een FLUOSTAR-microplaatlezer (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Duitsland), met het excitatiefilter ingesteld op 360 nm (bandbreedte 5 nm). en het emissiefilter ingesteld op 460 nm (bandbreedte 5 nm). De concentratie van GSH en GSSG in elk monster werd geïnterpoleerd uit bekende GSH-standaarden. Concentraties van zowel GSH als GSSG werden uitgedrukt als nmol GSH/mg eiwit, wat de berekening van de glutathion-redoxverhouding GSH/GSSG mogelijk maakte.

De overblijvende pellets werden gevortext totdat ze volledig waren opgelost in 240 µl 0,1 M NaOH om de eiwitconcentratie te meten met de bicinchoninezuur (BCA)-methode, waarbij runderserumalbumine als standaard werd gebruikt.

【Voor meer informatie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】