Een homozygote Dab1−// is een potentiële nieuwe oorzaak van autosomaal recessieve aangeboren afwijkingen van de muizennier en urinewegen
Feb 28, 2022
Invoering
Yotari-mutante muizen, verkregen door spontane verwerving van een mutatie in het Dab1-gen, vertonen histologische afwijkingen in het centrale zenuwstelsel [1,2], die sterk lijken op die van reeler- (reelin//)-muizen, wat suggereert dat reelin en DAB1 behoren tot dezelfde signaalroute [1-4]. Er is gemeld dat de afwijkingen in de reelin/DAB1-route geassocieerd zijn met verschillende psychiatrische stoornissen [5-7]. Interessant is dat naast het centrale zenuwstelsel de aanwezigheid van DAB1- en reelin-eiwitten ook is bevestigd in het perifere zenuwstelsel en in sommige extraneurale weefsels. De aanwezigheid van DAB1 is gevonden in podocyten van muizen [8] en menselijke foetusnieren[9] terwijl reelin-expressie is gemeld tijdens de ontwikkeling van de muis en de menselijke foetus, evenals in sommige endotheelcellen langs bloedvaten bij de volwassen muis [9-11]. De canonieke reelin/DAB1-route kan verschillende stroomafwaartse eiwitten triggeren, waaronder NOTCH2-receptoren, die een cruciale rol spelen bij beslissingen over het lot van cellen en differentiatie tijdensnierontwikkeling [12-14]. NOTCH2-receptoren zijn vereist om proximale tubuli en podocyten te vormen [13], maar zodra de nefronrijping is bereikt, wordt deze route meestal tot zwijgen gebracht [15]. In acute omstandighedennierziekten,verhoogde expressie van NOTCH2 kan mogelijk bijdragen aan regeneratie, terwijl aanhoudende expressie causaal geassocieerd is met interstitiële fifibrose en glomerulosclerose [15]. Downregulatie van NOTCH-signalering kan autofagie sterk verminderen en podocytdifferentiatie tijdens de ontwikkeling veroorzaken [16].
Dientengevolge spelen disfunctionele podocyten een cruciale rol bij glomerulaire ziekte, vooral bij humaan idiopathisch nefrotisch syndroom [17,18] en bij minimal change nefrotisch syndroom (MCNS) [19]. Daarom handhaaft autofagie cellulaire homeostase onder normale fysiologische omstandigheden, terwijl het in pathologische omstandigheden kan evolueren naar autofagische dood [20]. Een veelgebruikte autofagie-biomarker is LC3B, een structureel eiwit van autofagosomale membranen [21]. Complexe overspraak tussen autofagie en apoptose draagt ook bij aan het behoud van de homeostatische balans als reactie op de micro-omgeving van de cel. Het is bekend dat apoptotische gebeurtenissen in aantal toenemen tijdensnierontwikkeling [22] en nemen sterk af zodra de rijping voorbij is, behalve in omstandigheden vannierbeschadiging[23]. Ontegenzeggelijk is apoptose een complex mechanisme dat wordt gereguleerd door het samenspel van verschillende routes, maar eindigt meestal met activering van caspase3 (CASP3), waarvan de activering een van de meest gebruikte markers is voor detectie van apoptose [23].
In dit rapport wilden we analyseren hoe Dab1-genfunctionele silencing-invloedenniermorfologie en de expressie en lokalisatie van reelin-, NOTCH2-, LC3B- en gesplitste CASP3-eiwitten in postnatale muizennieren. We nemen aan dat deze eiwitten tot expressie komen in de postnatale muisnier,en hun functionele samenspel draagt bij aan het behoud van hun structuur en functie. Bovendien, aangezien de aanwezigheid van DAB1 is bevestigd tijdens foetale menselijkenierontwikkeling [9], kan worden aangenomen dat de inactivatie ervan een stoornis kan veroorzaken in een breed spectrum van aangeboren afwijkingen van denieren urinewegen (CAKUT).
trefwoorden:yotar; nierfunctie; postnatale ontwikkeling van de nieren; immunofluorescentiekleuring; transmissie elektronenmicroscopie
CISTANCHE ZAL DE NIER-/NIERFUNCTIE VERBETEREN
Materialen en methodes
MonsterverzamelingAls conventionele Dab1-mutanten gebruikten we yotari (Dab1/) muizen die eerder zijn beschreven door Howell et al. [24]. PCR-primers die werden gebruikt voor genotypering van de muizen waren yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT en CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, wildtype van Dab1-locus: GCCCTTCAGCATCACCATGCT en CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. C57BL/6N-muizen werden grootgebracht en in groepen gehuisvest in standaard polycarbonaatkooien (inclusief ten minste één van elk genotype) met ad libitum toegang tot voedsel en water in een temperatuurgecontroleerde (23 ± 2 ◦C) kamer met een 12 uur durende licht/ donkere cyclus. Op postnatale dagen 4, 11 en 14 (P4, P11 en P14) werden muizen diep verdoofd met pentobarbital en transcardiaal geperfuseerd gedurende 10 min met fosfaatbufferzoutoplossing (PBS, pH 7,2) en 4 procent paraformaldehyde (PFA ) in 0,1 M PBS.nierenwerden verwijderd en gefixeerd met 4 procent PFA in 0.1 M PBS 's nachts voor conventionele histologische analyses (hematoxyline-eosine (H&E), immunohistochemische en immunofluorescentiekleuring) en in een mengsel van 2 procent PFA plus 2,5 procent glutaaraldehyde (GA) voor elektronenmicroscooponderzoek. Na fifixatie werd weefsel voorbereid voor verder histologisch onderzoek, zoals we eerder hebben beschreven [25,26].
Immunoflfluorescentie en immunooperoxidasekleuringNa deparaffinisatie en rehydratatie werden coupes gedurende 20 min in de 0,01 M citraatbuffer (pH 6,0) in een waterstomer verwarmd en daarna afgekoeld tot kamertemperatuur. Blokkeerbuffer (ab 64226, Abcam, Cambridge, VK) werd gedurende 30 minuten aangebracht om niet-specifieke kleuring uit te sluiten. Secties werden vervolgens overnacht in een vochtige kamer geïncubeerd met primaire antilichamen (tabel 1). Na wassen in PBS werden secundaire antilichamen (Tabel 1) gedurende één uur aangebracht en opnieuw in PBS gewassen. Vervolgens werden kernen gedurende 2 minuten gekleurd met 4060 -diamidino-2-fenylindol (DAPI), gewassen in PBS en afgedekt. We hebben de preadsorptietest uitgevoerd zodat elk primair antilichaam werd gebruikt met het overeenkomstige peptide en hun combinatie op de secties toegepast. De resultaten toonden geen antilichaamkleuring. Bovendien werden controles uitgevoerd met weglating van het primaire antilichaam om niveaus van niet-specifieke binding van secundaire antilichamen te bepalen.
Voor immunoperoxidasekleuring werd polyklonaal konijnenanti-CASP3 (1:100 verdunningen, ab13847, Abcam, Cambridge, VK) als primair antilichaam gedurende één uur in een vochtige kamer aangebracht na de behandeling van de sectie met 0,1 procent H2O2. Na wassen in PBS werd secundaire detectie uitgevoerd met behulp van de link en streptavidineperoxidase, elk gedurende vijftien minuten (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) en diaminobenzidine (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), zorgvuldig gecontroleerd om overkleuring van de achtergrond te voorkomen. Kernen werden gekleurd met hematoxyline, gedurende 10 minuten in kraanwater gespoeld, kort gedehydrateerd in oplopende reeksen ethanoloplossingen en afgedekt.
Weefselvoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscoop (TEM)Na fixatie met een mengsel van 2 procent PFA en 2,5 procent GA in 0,1 M PBS gedurende 2 uur, werden de monsters gewassen met PBS en gedurende 2 uur nagefixeerd in een waterige oplossing van 2 procent osmiumtetroxide. Alle monsters werden tweemaal gewassen in PBS, gedehydrateerd in oplopende gradaties van ethanol en ingebed in Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Seriële secties (70 nm dikte) werden gesneden op een Ultracut UCT ultramicrotoom (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland) en gekleurd met 1 procent uranylacetaat en loodcitraat.
Data-acquisitie en analyseDe analyse werd uitgevoerd met een epifluorescentiemicroscoop (Olympus BX51, Tokyo, Japan) uitgerust met een DP71 digitale camera (Olympus), een JEM 1400 transmissie-elektronenmicroscoop (JEOL, Tokyo, Japan) die werkte op 80 kV en gefotografeerd werd met een JEOL-lading- camerasysteem met gekoppeld apparaat (CCD) (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, VS) en ten slotte een helderveldmicroscoop (BX40, Olympus, Tokyo, Japan). Alle geanalyseerde afbeeldingen werden verwerkt met ImageJ-software en Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, VS). Per onderzochte groep gebruikten we drie tot vier dieren. Alles verzameldnierenwerden gesneden op 5 µm dikke secties, en maximaalnier length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, wat wijst op een uitstekende overeenstemming [27].
Statistische analyseEen tweezijdige t-test werd uitgevoerd om de verschillen in de gemiddelde diameter tussen PCT, DCT en G van wildtype- en yotari-dieren te analyseren. De diameter werd gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Het significantieniveau werd vastgesteld op p < 0.05.="" een="" tweeweg-anova-test="" gevolgd="" door="" tukey's="" meervoudige="" vergelijkingstest="" werd="" gebruikt="" om="" de="" verschillen="" in="" het="" percentage="" positieve="" cellen="" tussen="" pct,="" dct="" en="" glomeruli="" op="" alle="" tijdstippen="" te="" onderzoeken.="" het="" percentage="" positieve="" cellen="" werd="" uitgedrukt="" als="" het="" gemiddelde="" ±="" standaardfout="" van="" het="" gemiddelde="" (sem).="" het="" significantieniveau="" werd="" vastgesteld="" op="" p="">< 0,05.="" de="" analyse="" werd="" uitgevoerd="" in="" graphpad-software="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
Resultaten
Hematoxyline-eosinekleuring (H&E) en meting van de nierdiameterH&E-kleuring van midsagittale secties van denierenop alle onderzochte tijdstippen benadrukt de kleinenierfenotype van yotari-muizen vergeleken met wildtype (Figuur 1a). Bij 4P gemiddeldenierdiameter van yotari-dieren was ongeveer 55 µm dan ongeveer 75 µm. Bovendien was dit verschil op latere tijdstippen merkbaar door de tragere groei van denierenin yotari vergeleken met de progressieve groei van denierenbij wildtype dieren. Om te bepalen of de vermindering van de totaleniergrootte werd veroorzaakt door een afname van de grootte van het nefronsegment, namen we het gemiddelde van de diameter van PCT, DCT en G per groep. Er was inderdaad een afname van de gemiddelde diameter G, PCT en DCT in de yotari-groep in vergelijking met het wildtype (Figuur 1b, p <0.05). bovendien="" onthulde="" h="" &="" e-kleuring="" een="" dunnere="" cortex="">nierbekkenextensie bij yotari-dieren en licht diffuus verwijde DCT bij 14P. De basisstructuur en het patroon van glomerulaire rijping zijn hetzelfde in beide onderzochte diergroepen.
Beschrijvende histologische analyse op basis van TEM-microfoto'sOp microfoto's verkregen door TEM, vertoonden glomeruli van wildtype muizen het typische uiterlijk van alle delen van de fifiltratiebarrière, die normaal ontwikkeld en herkenbaar waren (Figuur 2a). Podocyten, voetprocessen en steeltjes van podocyten, fifiltratiespleten, glomerulaire basaalmembranen en het capillaire lumen met het gefenestreerde endotheel waren gemakkelijk te onderscheiden (Figuur 2a). Aan de andere kant, in de glomeruli van yotari-muizen, kon progressieve schade aan de podocyten met uitwissing van het voetproces en gebrek aan fifiltratiespleten worden waargenomen (Figuur 2b-d). Deze ultrastructurele veranderingen werden in totaal waargenomennierenonderzocht en omvatte de meeste onderzochte glomeruli. Er werden geen afwijkingen opgemerkt in de PCT of DCT van yotari-muizen dan wildtype dieren (Figuur 2e-h). In de PCT waren celinterfaces slecht gedefinieerd vanwege de onregelmatigheid van celmembranen en celinterdigitatie met hun buren. Het cytoplasma was overvloedig, met goed onderscheiden kernen, langwerpige mitochondriën, basale infoldingen en veel buisvormige putjes tussen microvilli, die een borstelrand vormden bij het apicale membraan. Hogere vergroting onthulde het apicale oppervlak van PCT-epitheelcellen die lange microvilli bevatten om de borstelrand en nauwe verbindingen tussen de luminale celgrenzen van naburige tubulaire epitheelcellen te vormen (Figuur 2e, f). Aan de andere kant bevatte het apicale oppervlak van DCT-epitheelcellen enkele korte microvilli en talrijke blaasjes (Figuur 2g, h).
Figuur 2. Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM)-microfoto's van wildtype en yotarinierenGlomeruli van wildtype dieren (a) vertoonden een normaal ontwikkelde fifiltratiebarrière met gefenestreerd endotheel (E) van het capillair (C), basaalmembraan (BM), podocyten (P) met steeltjes (PE) en fifiltratiespleten (FS ). In denierenvan yotari-dieren, uitwissen van de steeltjes en gebrek aan fifiltratiespleten konden worden opgemerkt (sterretjes, b-d). Er werden geen afwijkingen opgemerkt in de proximale ingewikkelde tubuli (PCT) of distale ingewikkelde tubuli (DCT) van yotari-muizen in vergelijking met de wildtype dieren (e-h). In de PCT was het cytoplasma overvloedig, met goed onderscheiden kernen (N), langwerpige mitochondriën (M), basale infoldings (BI) en veel buisvormige putjes (TP) tussen microvilli, die een borstelrand (BB) vormden aan de apicaal membraan (e,f). Hogere vergroting onthulde het apicale oppervlak van PCT-epitheelcellen die lange microvilli bevatten om de borstelrand en tight junctions (TJ) te vormen tussen de luminale celgrenzen van naburige tubulaire epitheelcellen (e, f). Aan de andere kant bevat het apicale oppervlak van DCT-epitheelcellen weinig korte microvilli en talrijke blaasjes (g, h). De schaalbalk in afbeeldingen (a–d) en inzetstukken (e–h) is 1 µm; de schaalbalk in afbeeldingen (e–h) is 2 µm.
Lokalisatie en colokalisatie van Reelin en DAB1Reelin werd zwak tot expressie gebracht met milde tot matige reactiviteit (Tabel 2) in de glomeruli en DCT van alle onderzochte dieren op alle waargenomen tijdstippen (p <0.05, figuur="" 3a).="" alleen="" in="" de="" pct="" van="" yotari-muizen="" was="" het="" percentage="" positieve="" cellen="" significant="" hoger="" dan="" bij="" wildtype="" dieren="" (p=""><0,05, figuur="" 3a).="" in="" de="" glomerulaire="" cellen="" was="" de="" lokalisatie="" van="" kleuring="" perinucleair,="" terwijl="" het="" in="" de="" pct="" en="" dct="" verspreid="" was="" door="" het="" cytoplasma="" (figuur="" a,="">
afbeelding 4. Immunofluorescentiekleuring van postnatale yotarinierenmet reelin-marker (a) en dubbele immunofluorescentiekleuring van postnataal wildtypenierenmet DAB1 en reelin-markeringen (b). ( a, b ) Nucleair DNA DAPI-kleuring samengevoegd met DAB1 en reelin-immunofluorescentie wordt parallel weergegeven (samenvoegen). De waargenomen tijdstippen waren P4, P11, P14. Expressie van de onderzochte markers in de glomeruli (G), proximale gekronkelde tubuli (PCT) en distale gekronkelde tubuli (DCT) is gemarkeerd met de pijlen, terwijl sterretjes de expressie van de reelin in de extracellulaire matrix (a) aangeven. Invoegingen tonen de meest prominente uitdrukking in de afbeelding. DAPI-nucleaire kleuring onthulde een slechte colokalisatie van DAB1 en reelin, meestal in de DCT (pijlpunt). Schaalbalk is 20 µm en verwijst naar alle afbeeldingen.
Er was bijna geen immuunreactiviteit van DAB1 in glomeruli en PCT van wildtype dieren op P4, terwijl het percentage positieve cellen met milde reactiviteit (Tabel 2) significant toenam op P11 en P14 (p < 0.05,="" figuur="" 3b).="" in="" de="" dct="" werd="" dab1="" meestal="" tot="" expressie="" gebracht="" in="" de="" apicale="" en="" laterale="" delen="" van="" celmembranen="" (figuur="" 4b)="" met="" een="" sterke="" reactiviteit="" (tabel="" 2).="" het="" percentage="" positieve="" cellen="" was="" significant="" hoger="" dan="" in="" eerdere="" structuren,="" ongeveer="" 60="" procent="" (figuur="" 3b),="" vooral="" in="" de="" macula="" densa="" (figuur="" 4b).="" er="" was="" bijna="" geen="" colokalisatie="" van="" de="" dab1="" en="" reelin="" behalve="" in="" de="" dct="" van="" wildtype="" dieren="" op="" p14="" (pijlpunt,="" figuur="" 4b).="" biomoleculen="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" van="" 14="" figuur="" 4.="" immunoflfluorescentiekleuring="" van="" postnatale="">nierenmet reelin-marker (a) en dubbele immunofluorescentiekleuring van postnataal wildtypenierenmet DAB1 en reelin-markeringen (b). ( a, b ) Nucleair DNA DAPI-kleuring samengevoegd met DAB1 en reelin-immunofluorescentie wordt parallel weergegeven (samenvoegen). De waargenomen tijdstippen waren P4, P11, P14. Expressie van de onderzochte markers in de glomeruli (G), proximale gekronkelde tubuli (PCT) en distale gekronkelde tubuli (DCT) is gemarkeerd met de pijlen, terwijl sterretjes de expressie van de reelin in de extracellulaire matrix (a) aangeven. Invoegingen tonen de meest prominente uitdrukking in de afbeelding. DAPI-nucleaire kleuring onthulde een slechte colokalisatie van DAB1 en reelin, meestal in de DCT (pijlpunt). Schaalbalk is 20 µm en verwijst naar alle afbeeldingen. Er was bijna geen immuunreactiviteit van DAB1 in glomeruli en PCT van wildtype dieren op P4, terwijl het percentage positieve cellen met milde reactiviteit (Tabel 2) significant toenam op P11 en P14 (p <0,05, figuur="" 3b).="" in="" de="" dct="" werd="" dab1="" meestal="" tot="" expressie="" gebracht="" in="" de="" apicale="" en="" laterale="" delen="" van="" celmembranen="" (figuur="" 4b)="" met="" een="" sterke="" reactiviteit="" (tabel="" 2).="" het="" percentage="" positieve="" cellen="" was="" aanzienlijk="" hoger="" dan="" in="" eerdere="" structuren,="" ongeveer="" 60="" procent="" (figuur="" 3b),="" vooral="" in="" de="" macula="" densa="" (figuur="" 4b).="" er="" was="" bijna="" geen="" colokalisatie="" van="" de="" dab1="" en="" reelin="" behalve="" in="" de="" dct="" van="" wildtype="" dieren="" op="" p14="" (pijlpunt,="" figuur="">
Ruimtelijke en temporele expressiepatronen van NOTCH2 en LC3BHet percentage NOTCH{{0}}positieve cellen was minder dan 20 procent in de glomeruli van beide dierlijke genotypen op alle waargenomen tijdstippen. Alleen bij P14 was het percentage positieve cellen significant hoger in de glomeruli van yotari-dieren dan wildtype dieren (p <0,05, figuur="" 3c).="" de="" kleurintensiteit="" was="" mild="" tot="" matig="" (tabel="" 2),="" meestal="" perinucleair="" gelokaliseerd="" (figuur="" 5a-f).="" in="" de="" pct="" en="" dct="" van="" beide="" dierlijke="" genotypen="" nam="" het="" percentage="" positieve="" cellen="" in="" de="" loop="" van="" de="" tijd="" toe.="" op="" p14="" was="" het="" percentage="" positieve="" cellen="" significant="" hoger="" in="" pct="" en="" dct="" van="" yotari-dieren="" dan="" pct="" en="" dct="" van="" wildtype="" dieren="" (p=""><0,05, figuur="" 3c).="" signaalintensiteit="" op="" alle="" waargenomen="" tijdstippen="" was="" mild="" tot="" matig="" (tabel="" 2)="" en="" verspreid="" over="" het="" cytoplasma="" (figuur="" 5a-f).="" figuur="" 5.="" immunofluorescentiekleuring="" van="" postnataal="" wildtype="" en="">nierenmet NOTCH2 en LC3B markers en immunoperoxidase kleuring met gesplitste caspase3 (CASP3) marker. (a-f) Nucleair DNA DAPI-kleuring wordt samengevoegd met NOTCH2 en LC3B. De waargenomen tijdstippen waren P4, P11, P14. Expressie van de NOTCH2- en LC3B-markers in de glomeruli (G), proximale ingewikkelde tubuli (PCT) en distale ingewikkelde tubuli (DCT) is gemarkeerd met de pijlen. Vooral sterke LC3B-reactiviteit kan worden waargenomen in de Bowman-capsule van rottende glomeruli (asterisk, e). Invoegingen tonen de meest prominente uitdrukking in de afbeelding. CASP3 werd slecht uitgedrukt in alle waargenomen tijdstippen. De enige significante expressie was in de glomeruli van yotari-muizen op P14 (pijlen). Schaalbalk is 20 µm en verwijst naar alle afbeeldingen. Biomoleculen 2021, 11, 609 9 van 14 3.4. Ruimtelijke en temporele expressiepatronen van NOTCH2 en LC3B Het percentage NOTCH2-positieve cellen was minder dan 20 procent in de glomeruli van beide dierlijke genotypen op alle waargenomen tijdstippen. Alleen bij P14 was het percentage positieve cellen significant hoger in de glomeruli van yotari-dieren dan wildtype dieren (p <0,05, figuur="" 3c).="" de="" kleurintensiteit="" was="" mild="" tot="" matig="" (tabel="" 2),="" meestal="" perinucleair="" gelokaliseerd="" (figuur="" 5a-f).="" in="" de="" pct="" en="" dct="" van="" beide="" dierlijke="" genotypen="" nam="" het="" percentage="" positieve="" cellen="" in="" de="" loop="" van="" de="" tijd="" toe.="" op="" p14="" was="" het="" percentage="" positieve="" cellen="" significant="" hoger="" in="" pct="" en="" dct="" van="" yotari-dieren="" dan="" pct="" en="" dct="" van="" wildtype="" dieren="" (p=""><0,05, figuur="" 3c).="" signaalintensiteit="" op="" alle="" waargenomen="" tijdstippen="" was="" mild="" tot="" matig="" (tabel="" 2)="" en="" verspreid="" over="" het="" cytoplasma="" (figuur="">
Figuur 5. Immunoflfluorescentiekleuring van postnataal wildtype en yotarinierenmet NOTCH2 en LC3B markers en immunoperoxidase kleuring met gesplitste caspase3 (CASP3) marker. (a-f) Nucleair DNA DAPI-kleuring wordt samengevoegd met NOTCH2 en LC3B. De waargenomen tijdstippen waren P4, P11, P14. Expressie van de NOTCH2- en LC3B-markers in de glomeruli (G), proximale ingewikkelde tubuli (PCT) en distale ingewikkelde tubuli (DCT) is gemarkeerd met de pijlen. Vooral sterke LC3B-reactiviteit kan worden waargenomen in de Bowman-capsule van rottende glomeruli (asterisk, e). Invoegingen tonen de meest prominente uitdrukking in de afbeelding. CASP3 werd slecht uitgedrukt in alle waargenomen tijdstippen. De enige significante expressie was in de glomeruli van yotari-muizen op P14 (pijlen). Schaalbalk is 20 µm en verwijst naar alle afbeeldingen.
In de glomeruli en DCT van beide dierlijke genotypen nam het percentage LC3B-positieve cellen in de loop van de tijd toe (p <0.05, figuur="" 3d).="" op="" p11="" en="" p14="" was="" het="" percentage="" positieve="" cellen="" significant="" hoger="" in="" de="" glomeruli="" van="" yotari-dieren="" dan="" de="" glomeruli="" van="" wildtype="" dieren="" (p=""><0.05, figuur="" 3d).="" in="" de="" glomeruli="" van="" yotari-dieren="" was="" de="" kleurintensiteit="" meestal="" matig="" tot="" sterk="" (tabel="" 2)="" in="" de="" perinucleaire="" en="" nucleaire="" ruimte="" (figuur="" 5a-f),="" op="" alle="" waargenomen="" tijdstippen,="" terwijl="" in="" de="" glomeruli="" van="" wildtype="" muizen="" de="" intensiteit="" was="" meestal="" matig="" (tabel="" 2).="" pct="" van="" yotari="" en="" wildtype="" dieren="" bevatte="" ongeveer="" 20="" procent="" positieve="" cellen="" op="" alle="" waargenomen="" tijdstippen="" (p=""><0,05, figuur="">
Gesplitste CASP-3 ExpressieEr was bijna geen uitdrukking van de geactiveerde CASP-3 in denierenvan wildtype dieren op alle waargenomen tijdstippen. In de PCT en DCT van yotari-muizen waren verschillende individuele cellen CASP-3-positief (Figuur 3e). Alleen in de glomeruli van yotari-nieren op P14 (Figuur 5e) nam het percentage positieve cellen significant toe in vergelijking metnierenvan wildtype muizen (p < 0.05, figuur 3e).
Discussie
Niermorfogenese en ontwikkeling zijn complexe processen die nauwkeurig worden gecoördineerd door het samenspel van een groot aantal genen. Aangeboren afwijkingen van denieren urinewegen (CAKUT) zijn de meest voorkomende geboorteafwijking die 23 procent van al dergelijke defecten uitmaakt en de belangrijkste oorzaak is van eindstadiumnierziektebij kinderen [28,29]. Aandoeningen van één gen kunnen de primaire bron van CAKUT zijn, en tot nu toe is een mutatie in meer dan 20 genen geïdentificeerd als de oorzaak van CAKUT [30]. Omdat ons vorige werk een geweldige expressie van DAB1 liet zien tijdens een normale foetale mensnierontwikkeling [9], gingen we ervan uit dat DAB1 een belangrijke rol zou kunnen spelen tijdens zoogdierennierontwikkeling. Om onze hypothese te bewijzen, onderzochten we deniermorfologie en expressiepatronen van reelin, NOTCH2, LC3B en geactiveerde CASP3-eiwitten in Dab1-knockout-muizen.
CISTANCHE ZAL NIER/NIERENPIJN VERBETEREN
Door de yotari-muizen snijdennierenonthulde een dunnere cortex en een aanzienlijk kleiner gemiddeldenieren PCT-, DCT- en G-diameters vergeleken met wildtype dieren. de afname vanniergrootte veroorzaakt door onvoldoende nefron-gift staat bekend als:nierhypoplasie, een van de meest voorkomende CAKUT-aandoeningen, die vatbaar is voor hypertensie bij volwassenen en chronische nierziekte [31]. Bovendien onthulden de microfoto's die met de TEM zijn gemaakt, dat yotari-muizen prominente schade aan de podocyten vertoonden met uitwissing van het voetproces en een gebrek aan fifiltratiespleten. Na de verwonding ondergaan podocyten het proces van uitwissing waarbij ze hun structuur verliezen, wat leidt tot een vermindering van hun fifiltratiebarrièrefunctie [32]. Alle vormen van nefrotisch syndroom, evenals focale segmentale glomerulosclerose (FSGS), worden gekenmerkt door defecten in de structuur of functie van de podocyt [33].
Onze huidige studie toonde de hoogste expressie van DAB1 aan de apicale en laterale delen van celmembranen van de DCT, terwijl REELIN meestal verspreid was door het cytoplasma van de PCT. Op de onderzochte tijdstippen werden geen morfologische veranderingen waargenomen in tubuli van yotari-muizen, maar verder onderzoek is nodig om de rol van DAB1 in tubulo-interstitiële compartimenten op te helderen. Er was af en toe een colokalisatie van de DAB1- en REELIN-eiwitten, meestal in de DCT. Deze bevindingen volgen ons eerdere werk met betrekking tot de expressie van deze twee eiwitten tijdens de foetale mensnierontwikkeling [9]. Dit kan erop wijzen dat DAB1 en reelin vergelijkbare rollen hebben bij mens en muisnierendoor enkele van de stroomafwaartse routes te activeren, zoals Crk-, MAPK- en PI3K/Akt/mTOR-signaalcascades [34–36]. Onze gegevens onthulden ook verhoogde reelin-expressie in de glomeruli van yotari-muizen. Interessant is dat een eerdere studie heeft aangetoond dat DAB1-fosforylering en verhoogde reelin-expressie in de glomeruli gepaard gaan met hypertensie, proteïnurie en podocytbeschadiging bij de met Ang II geïnfuseerde ratten [10].
Bovendien onthulde immunofluorescentiekleuring een verhoogde expressie van NOTCH2-receptoren in de glomeruli van P14 yotari-muizen. Het is bekend dat de expressie van NOTCH2 wordt gedownreguleerd zodra de rijping van nefron is bereikt, behalve in de omstandigheden vannierbeschadigingen,zoals diabetische nefropathie en FSGS [15,37]. Muizen met het door Adriamycine geïnduceerde nefrotisch syndroom vertoonden ook verhoogde expressie van geactiveerd NOTCH2, wat fifibrose verbetert [38]. Op de onderzochte tijdstippen merkten we geen verhoogde fifibrose op, maar het blijft om de exacte rol van de tot expressie gebrachte NOTCH2 in de postnatale yotari op te helderennieren.Verdere observatie of fifibrotische veranderingen optreden in de latere stadia zou nodig zijn. Er zijn echter al enkele bevindingen die suggereren dat het kortetermijneffect van verhoogde NOTCH2-activering geassocieerd is met een sterk overlevingsvoordeel voor gewonde podocyten, dat verloren gaat in langetermijnmodellen, zoals diabetische nefropathie [39].
Hogere LC3B-expressie in de glomeruli van P11- en P14-yotari-muizen weerspiegelde waarschijnlijk een accumulatie van de autofagosomen in de podocyten. Om duidelijk te laten zien dat autofagie versneld was. Het is noodzakelijk om de verhouding van LC3-II- en LC3-I-eiwitexpressies te analyseren. Onder normale omstandigheden is autofagie noodzakelijk voor normaalnierfunctie[40], vooral in podocyten. Vanwege hun beperkte capaciteit voor celdeling en vervanging, vertonen ze een hoog basaal niveau van autofagie [41]. Ondanks deze bevindingen is een verhoging van de LC3B-expressie gemeld bij verschillende glomerulaire ziekten [42-44], voornamelijk in verband met uitwissing van het voetproces en de ontwikkeling van het nefrotisch syndroom, zoals waargenomen bij voorwaardelijke knock-outmuizen met proreninereceptor [45,46]. Al deze onderzoeken suggereren een beschermende rol van verbeterde autofagie bij pathologische aandoeningen, verder ondersteund door de bevindingen van door Adriamycine geïnduceerde nefropathie, waarbij autofagie wordt geactiveerd om te beschermen tegen podocytbeschadiging [43], evenals bij leeftijdsafhankelijke glomerulaire ziekte waar het vertraagt de progressieve functionele achteruitgang van denierfunctie[40]. Analyse van de mensnierbiopsieën toonden ook bewijs van verhoogde autofagie in verband met uitwissing van het voetproces bij verschillende glomerulaire ziekten, waaronder minimal change nefrotisch syndroom (MCNS), dat een van de meest voorkomende oorzaken is van idiopathisch nefrotisch syndroom [19]. In de omstandigheden van diabetische nefropathie en door lipopolysaccharide geïnduceerde acutenierbeschadiging,het verbeteren van autofagie met sommige therapieën door remming van de PI3K/AKT/mTOR-route verbetert de nierfunctie [47,48]. Al deze bevindingen impliceren dat autofagie een onmisbare cytoprotectieve rol speelt voor stress-adaptatie bijnierbeschadiging, en de modulatie ervan kan een veelbelovende therapeutische strategie zijn, hoewel autofagie onder bepaalde omstandigheden ook schadelijk kan zijn en tot celdood kan leiden.
CISTANCHE ZAL NIER-/NIERSTORING VERBETEREN
Behalve de verhoging van autofagie, kon ook een verhoogd niveau van apoptose worden waargenomen in de glomeruli van P14 yotari-muizen. Autofagie voorkomt meestal apoptose, maar onder specifieke pathologische omstandigheden kan het ook een tegengesteld effect hebben op de overleving van cellen door apoptose te versterken en te bevorderen [42]. Na de geboorte, apoptose in denierenis sterk verminderd, behalve in de omstandigheden vannierbeschadiging,zoals idiopathisch nefrotisch syndroom, dat bijdraagt aan de ontwikkeling van de ziekte [23]. mogelijke nieuwe oorzaak van autosomaal recessieve aangeboren afwijkingen van denieren urinewegen. Echter, de hoofdrol van DAB1 tijdens:nierontwikkeling blijft onduidelijk. Bovendien vertoonden deze muizen afwijkingen aan het voetproces en een verhoogd niveau van reelin, NOTCH2, LC3B en gesplitste CASP3-eiwitten in de glomeruli, wat kan leiden tot glomerulaire verwondingen, zoals nefrotisch syndroom, dat in verband met hypoplasie een mogelijke doodsoorzaak kan zijn van deze dieren tijdens het spenen. Om deze hypothese te bevestigen, is het noodzakelijk om aanvullende informatie te verstrekken over bloeddruk en andere klinische laboratoriumparameters, zoals niveaus van serumcreatinine, albumine en eiwitten.
