Een nieuw, ataxisch muismodel van ataxia teleangiëctasie veroorzaakt door een klinisch relevante onzinmutatie (deel 2)

Neem voor meer informatie contact op metdavid.wan@wecistanche.com

3.0 Discussie

Door genotoxische stress te verhogen door de toevoeging van een secundaire hit aan de DDR-route, hebben we een nieuw muismodel gegenereerd dat de meest uitgebreide set AT-symptomen van elk model tot nu toe vertoont. Dit omvat ernstige en progressieve ataxie geassocieerd met cerebellaire atrofie en verstoringen van PN-eigenschappen, samen met een hoge incidentie van kanker en defecten in de ontwikkeling van immuuncellen. Samen omvatten deze comorbiditeiten de drie belangrijkste oorzaken van vroegtijdig overlijden inAT—elk bijdraagttot ongeveer een derde van de sterfgevallen. Hiervan is het invaliderende effect van ataxie het meest doordringend en wordt door patiënten en zorgverleners gerapporteerd als de grootste impact op hun kwaliteit van leven. Om deze reden is de aanwezigheid van ataxie en cerebellaire atrofie in dit nieuwe muismodel van groot belang, omdat het voor de allereerste keer een hulpmiddel biedt om niet alleen de mechanismen van neurologische disfunctie op te helderen, maar ook een kritisch nodig in vivo model om test de broodnodige AT-therapieën, zoals de read-through-verbindingen die we hier beschrijven. We vonden verschillende overeenkomsten tussen de algemene progressie van ataxie in de Atm3535; Aptx muizen enAT-patiënten. In klinische AT zijn motorische stoornissen waarneembaar op de leeftijd van ongeveer 2 jaar, wanneer ouders en artsen een verminderd vermogen om over te gaan van peuteren naar een soepele, reflexief gecoördineerde poort detecteren - helaas is er weinig bekend over motorische defecten in eerdere stadia als gevolg van de ziekten lage prevalentie en het huidige gebrek aan vroege diagnostische tests (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Patiënten leren meestal zonder hulp lopen en neurologische symptomen blijven de eerste 4 tot 5 levensjaren meestal stabiel (Rothblum-Oviatt et al. 2016). We vonden een vergelijkbare vroege progressie van motorische stoornissen in Atm735×R3x; Aptx^'-muizen, die vroege milde motorische gebreken op P8 (oprichtreflexdeficit) detecteren, gevolgd door een periode van relatieve stabiliteit, voorafgaand aan het begin van progressieve en ernstige ataxie die zich ontwikkelde na p210, waaronder veranderingen in het lopen, schrikreflex, tremor en bewegingsapparaat werkzaamheid. Uit deze bevindingen komen verschillende belangrijke vragen naar voren, waaronder of ATM en/of APTX een rol spelen in de neurologische ontwikkeling

cerebellum. Toekomstige studies gericht op de vroege fase van de aandoening zullen van cruciaal belang zijn om te begrijpen of het cerebellum zich normaal ontwikkelt voorafgaand aan disfunctie of dat ontwikkelingsstoornissen een eerste oorzaak zijn. We ontdekten ook, net als bij AT-patiënten, dat de ernst van de zich laat ontwikkelende ataxie variabel was, waarbij sommige muizen rondliepen met een onhandige, hoog oplopende achterklep (video 3) en andere bijna volledig bewogen via verdraaiing van de achterste romp ( Fig.1E en Video 4) (Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy en Lang 2018; Boder en Sedgwick 1958). Over het algemeen vonden we dat ATM?35×xR35×; Aptx-muizen ontwikkelden een visueel diepgaand en meetbaar progressief verlies in motorische coördinatie vergelijkbaar met dat waargenomen bij AT-patiënten, dat werd gered door expressie van ten minste één kopie van de Atm of Aptx get he. Het verlies van motorische coördinatie bij AT is toegeschreven aan cerebellaire degeneratie vanwege de relatief selectieve neuropathologie in de hersenen en de causale rol ervan in verschillende vormen van ataxie (Hoche et al.2012). Overeenkomend metbij patiëntneuroimaging-onderzoeken (Wallis et al.2007; Sahama et al.2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al.2013), we vinden die cerebellaire grootte in Atm735×R3× ; Aptx-muizen zijn aanvankelijk normaal, maar nemen geleidelijk af samen met veranderingen in de neurologische functie. Hoewel het verlies van cerebellair weefsel als een hoofdoorzaak van ataxie bij mensen wordt beschouwd, is het uit klinische gegevens onduidelijk of de ernst van de ataxie een goede voorspeller is van de mate van cerebellaire degeneratie die postmortaal wordt gevonden (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006 : Dineen et al.2020). In de geldautomaat?35×R35×; Aptx^-muizen vinden we duidelijke atrofie geassocieerd met het dunner worden van de Purkinje-neurondendrietlaag die voorafgaat aan de late, ernstige gedragstekorten. Onze histologische waarnemingen in de Atm?35xR35×; Aptx-muizen suggereren dat veranderingen in de cerebellaire functie zelf, in plaats van ernstig verlies van cerebellaire cellen, voldoende zijn om het ataxische fenotype te veroorzaken, consistent met de waarneming van gedragsdefecten voorafgaand aan significant PN-verlies in verschillende SCA's (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti et al. 2000; Clark et al. 1997; Jayabal et al. 2016). De reden waarom ATM- en APTX-deficiëntie nodig is om ataxie bij muizen te veroorzaken wanneer het verlies van een van beide voldoende is om ataxie bij mensen te veroorzaken, blijft onduidelijk. Een mogelijkheid is dat de knaagdierhersenen flexibeler compenserende routes of overtollige eiwitten kunnen gebruiken terwijl ze reageren op de 10-20k DNA-laesies die elke dag cellen beïnvloeden (Lindahl en Barnes 2000). Er bestaan ​​verschillende vormen van DNA-reparatie om deze uitdaging mogelijk aan te gaan, waaronder base-excisiereparatie (BER), nucleotide-excisiereparatie (NER),

Klik hier voor meer informatie over Cistanche

evenals homologe en niet-homologe eindverbinding (HEJ en NHEJ, respectievelijk), waarbij ATM en APTX allemaal betrokken zijn (Chou et al.2015; Caglayan et al.2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee en Walker 2017). het geval dat een tekort aan ATM of APTX alleen niet voldoende invloed heeft op de gezondheid van de cellen tijdens de relatief korte levensduur van de muis, en dus het elimineren van beide eiwitten noodzakelijk is om voldoende accumulatie van DNA-schade te bereiken om zich gedurende deze tijdsperiode te manifesteren. Deze mogelijkheid wordt versterkt door het feit dat ATM en APTX verschillende biochemische eigenschappen en functionele rollen hebben in de reactie op DNA-schade, en daarom zou een tekort aan beide naar verwachting een grotere impact hebben op de stabiliteit van het genoom (dwz verhoogde genotoxische stress). Onze bevinding dat twee genoomstabiliteitsroute-eiwitten nodig zijn om neurologische defecten bij muizen te induceren, suggereert sterk dat het verlies van ATM's wielewaal bij DNA-herstel, in plaats van potentiële functies in oxidatieve stresssignalering, mitofagie of mitochondriale functie die de cerebellaire defecten veroorzaken ( Shiloh 2020). Alternatieven kunnen echter niet volledig worden uitgesloten, aangezien APTX, net als ATM, is waargenomen in de mitochondriën van hersencellen, waarvan wordt aangenomen dat het de verwerking van mitochondriaal DNA ondersteunt (Meagher en Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Dit nieuwe muismodel biedt een nieuw hulpmiddel om deze mogelijkheden te verkennen en mechanistisch te definiëren hoe het verlies van ATM en APTX uiteindelijk cerebellaire disfunctie veroorzaakt. De biofysische verstoringen die zijn waargenomen in PN's die zijn geregistreerd met de AtmR35XR35X; Aptx-muizen worden op dezelfde manier gevonden in verschillende andere muismodellen van ataxie. Dit omvat veranderingen die we hebben waargenomen in PN-ingangsweerstand, membraancapaciteit en AP-drempel en -breedte, die ook zijn beschreven in muismodellen van SCA zoals 1, 3 en 7 (Stoyas et al.2020; Shakkottai et al.2011; Dell 'Orco et al.2015). Bovendien correleert de progressieve vermindering van de PN-actiepotentiaal-afvuurfrequentie die we rapporteren positief met de ontwikkeling van ataxie in de AtrnR35XR35X; Aptx-muizen worden gerapporteerd in een groot aantal ataxische muismodellen, waaronder SCA's 1, 2, 3,5, 6 en 13, evenals enkele episodische vormen (zie recensie (Cook, Fields en Watt 2021)). Gezien de significante overlap in PN-verstoringen die worden waargenomen bij veel verschillende ataxies veroorzaakt door verschillende cellulaire defecten, is het herstellen van PN AP-vuurfrequenties beschouwd als een brede therapeutische benadering. Het blijft echter onduidelijk of verminderde PN-vuren een oorzakelijke factor is van ataxie. Bovendien suggereert experimenteel bewijs dat veranderingen in PN-activiteit in feite een algemene reactie kunnen zijn om homeostase te handhaven tijdens aanhoudende ziektegerelateerde verslechtering van PN-fysiologie (Dell'Orco et al.2015). Er zijn dus voortdurende inspanningen nodig in alle cerebellaire ataxie om de genetische, moleculaire en cellulaire verstoringen veroorzaakt door ziekte te koppelen aan de specifieke veranderingen in cerebellaire neurale signalering die uiteindelijk de ataxie genereren. Van groot belang bij deze inspanning zal zijn om te bepalen of ziekteverwekkende cerebellaire defecten ataxie gewoonlijk of differentieel veroorzaken door een verlies van cerebellaire functie (bijv. verlies van coördinerende signalen tijdens beweging), of door een dominant-negatief effect (bijv. verstoring van de stroomafwaartse neurale circuits met abnormale neurale outputpatronen). Uiteindelijk, hoewel een gemeenschappelijke therapeutische strategie om cerebellaire ataxie aan te pakken de grootste impact zou hebben, kan uiteindelijk een gerichte benadering die de verschillende genetische en moleculaire oorzaken van cellulaire disfunctie aanpakt, nodig zijn om met succes een effectief therapeutisch middel te ontwikkelen. Het mechanistische verband tussen een tekort aan DNA stabiliteitseiwitten zoals ATM en APTX en PN-disfunctie is verre van duidelijk. Onze resultaten suggereren dat het effect van ATM- en APTX-verlies op PN's intrinsiek is, aangezien we geen veranderingen vinden in de presynaptische eigenschappen van granulecellen of bewijs van hun cellulair verlies (geen verandering in GCL-dikte). Bovendien, hoewel we verschillen in korte termijn plasticiteit van inferieure olivary inputs in ATM- en APTX-deficiënte PN's en wildtype hebben waargenomen, wijzen deze resultaten waarschijnlijk op een verstoring in Ca2*-homeostase, mogelijk via verlagingen in Inositol 1,4,5- expressie van trifosfaatreceptor 1 (ltpr1), vergelijkbaar met die waargenomen in SCA's 1,2 en 3 muismodellen evenals ATM-deficiënte muizen (Kim et al.2020; Chen et al.2008; Demirci et al.2009; Shakkottai et al.2011). Hoewel dit een veelbelovende weg biedt voor toekomstig onderzoek en vergelijking, is het tot nu toe onduidelijk, zelfs voor de SCA's, of veranderingen in Ca²*-homeostase de oorzakelijke factor is of gewoon een ander symptoom of zelfs compenserende reactie van zieke of gestoorde PN's (Dell 'Orco et al.2015). In het immuunsysteem is ATM betrokken bij het herstel van DNA-breuken die van nature optreden tijdens genherschikking van antigeenreceptorgenen in B- en T-celprecursoren, een fenomeen dat cruciaal is voor de diversiteit van de antigeenreceptor (LG en TCR) van deze cellen. dat vindenT-celde verhoudingen in het bloed aanzienlijk worden verminderd, komt overeen met eerdere studies bij mensen en AT-knockout-muizen (Schubert, Reichenbach en Zielen 2002; Hathcock et al.2013; Chao, Yang en Xu 2000; Barlow et al.1996). Deze vermindering van T-cellen in de periferie correleert waarschijnlijk met een defect in zowel cellulaire als humorale immuniteit. Belangrijk is dat we vonden dat expressie van één kopie van het ATM-gen voldoende is om CD4-plus-tekorten in het bloed te herstellen, wat aangeeft dat therapieën die in staat zijn om gedeeltelijke ATM-expressie te herstellen, therapeutische werkzaamheid zouden hebben. Hoewel we de ontwikkeling van B-cellen in dit artikel niet hebben beoordeeld, is het waarschijnlijk dat soortgelijke conclusies van toepassing zijn op dat proces gezien hun mechanistische overeenkomsten (Marshall et al. 2018). Zoals verwacht is de vermindering van T-cellen in perifeer bloed gecorreleerd met een gebrekkige ontwikkeling van thymocyten. In de thymus vonden we twee belangrijke defecten. Eén, voornamelijk veroorzaakt door APTX-deficiëntie, manifesteert zich als een defect in de DN3-naar-DN4-overgang die samenvalt met vroege herschikking van de TCR-locus. Het andere defect, voornamelijk veroorzaakt door ATM-deficiëntie, correleert met verminderde progressie van dubbel-positieve CD4*CD8 naar enkel-positieve cellen, voornamelijk CD4'-thymocyten. Hoewel de APTX-bevinding verrassend was, omdat de deficiëntie (AOA 1) niet geassocieerd is met immuundeficiënties, is bekend dat APTX interageert met TCR-genherschikkingseiwitten, waaronder XRCC4 (Clements et al. 2004). Toekomstige studies gericht op het definiëren van de rol van APTX in end-joining-mechanismen tijdens TCR-genherschikking zullen zijn:

belangrijk, en de mogelijkheid dat alternatieve eindverbindingsmechanismen, zoals het gebruik van microhomologieën, verantwoordelijk zijn voor het ontbreken van een immuundeficiëntie bij afwezigheid ervan, moet verder worden onderzocht (Bogue et al. 1997). De overlevingskansen van Atm?35×/R35×; Aptx'mice is aanzienlijk langer dan eerdere AT-muismodellen. Ter vergelijking: de eersteBIJ KOmuismodel gerapporteerd door Barlow et al. stierf meestal binnen 2-4 maanden na de geboorte aan thymomen (Barlow et al. 1996). De verminderde overlevingskansen van kanker in deze en vele andere knock-out AT-muismodellen is waarschijnlijk genetisch bepaald, aangezien is aangetoond dat de achtergrondstam die de mutatie herbergt significante effecten heeft op de prevalentie en overlevingskansen van kanker, met A/J en C57BL/6

achtergronden met een significant verhoogde overlevingskans ten opzichte van de BALBC- en 129S-stammen (Genik et al. 2014). Het feit dat onze ATM-deficiënte muizen zijn gemaakt op een C57BL/6-achtergrond ligt waarschijnlijk ten grondslag; dat de Aptx*t-muizen geen ataxie ontwikkelen, het is hun relatief lange levensduur. Aangezien de ATM35xR35×; onwaarschijnlijk dat de vroege dood in AT KO-muizen de waarneming van een ataxisch fenotype verhindert dat zich anders bij deze muizen zou ontwikkelen. Het is echter niet bekend of de C57BL/6-achtergrond veerkracht biedt voor het ontwikkelen van ataxie, zoals bij kanker. Het definiëren van de genetische of mogelijk epigenetische factoren die de ernst van de ziekte beïnvloeden, zou mogelijkheden kunnen bieden voor toekomstige therapeutische ontwikkeling. Gezien de globale aard van de ATM- en APTX-nulmutatie in ons muismodel, kunnen we niet helemaal uitsluiten dat extra-cerebellaire defecten ook kunnen bijdragen aan het ernstige ataxische fenotype, en dus toekomstig onderzoek buiten het cerebellum in de voorhersenen, hersenstam, ruggenmerg , en zelfs spieren zullen moeten worden uitgevoerd. Binnen het cerebellum vonden we enkele anatomische verschillen in de PN-vuureigenschappen in verschillende regio's van het cerebellum, maar we hebben geen regionale verschillen in ML-breedte of PN-dichtheid gedetecteerd. Er zijn echter uitdagingen bij het gebruik van regionale anatomie als een groeperingsfactor in het cerebellum, aangezien de fysieke plooien van het weefsel niet noodzakelijk correleren met de grenzen van functionele, moleculaire expressie of fysiologische eigenschapsdomeinen die zijn beschreven (Apps en Hawkes 2009 ; Tsutsumi et al. 2015; Gao, van Beugen en De Zeeuw 2012; Zhou et al. 2014). Experimenten gericht op het onderzoeken van de omvang van cerebellaire defecten binnen deze domeinen zullen belangrijk zijn in toekomstige studies en vergeleken met de anekdotische rapporten van anatomische verschillen bij AT-patiënten (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover en Huff 1976; Amromin, Boder, en Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan en Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare en Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Terwijl we twee mogelijke stadia in de progressie van ataxie detecteren in de Atm735wR35x; Aptx-muizen, ontwikkelt het latere stadium van ernstige ataxie zich op volwassen leeftijd bij muizen, in vergelijking met het begin van de kindertijd bij mensen. Dit kan het gebruik ervan in sommige neurologische ontwikkelingsstudies beperken. Ook moet bij de interpretatie van toekomstige experimenten zorgvuldig rekening worden gehouden met het feit dat dit nieuwe model nulmutaties in twee genoomstabiliteitsgenen tegelijkertijd tot expressie brengt, een situatie die niet is gedetecteerd bij menselijke patiënten met AT of AOA1. Ten slotte was het een uitdaging om vast te stellen waar, wanneer en hoe ATM-deficiëntie cerebellaire pathologie en ataxie veroorzaakt, aangezien eerdere ATM-deficiënte muizen over het algemeen de karakteristieke kenmerken missen die nodig zijn om cellulaire en moleculaire tekorten causaal te koppelen aan het ataxische fenotype. Er zijn meerdere veelbelovende onderzoekspistes gedefinieerd, waaronder die gericht op het neuronale niveau, waar ATM betrokken is bij oxidatieve stresssignalering (Chen et al. 2003) en synaptische functie (Li et al. 2009; Vail et al. 2016), zoals evenals de gliafunctie, waar recent bewijs suggereert dat gliale pathologie een leidende factor kan zijn in cerebellaire pathologie (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al.2016; Petersen, Rimkus en Wassarman 2012; Weyemi et al.2015). Dit nieuwe diermodel biedt een nieuw hulpmiddel om mechanistische hypothesen te testen over hoe ATM-deficiëntie cerebellaire pathologie en ataxie veroorzaakt. Bovendien kan dit model vooral dienen als een kritisch preklinisch hulpmiddel voor het testen van eerder voorgestelde therapeutische kandidaten (Browne et al.2004; Chen et al.2003) en onze eigen SMRT-verbindingen (Du et al. 2013). De ernstige beperkingen van het ontbreken van een geschikt preklinisch model voor therapeutische testen, vooral voor zeldzame aandoeningen zoals AT en AOA1, kunnen niet genoeg worden benadrukt.

4.0 Materialen en methoden

4.1 Ethische verklaring

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de National Institutes of Health. Alle dieren werden behandeld volgens de goedgekeurde protocollen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bij The Lundquist Institute (31374-03,31773-02) en UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3} }). Het protocol is goedgekeurd door het Comité voor de ethiek van dierproeven van het Lundquist Institute (verzekeringsnummer: D16-00213). Alles werd in het werk gesteld om pijn en lijden tot een minimum te beperken door waar nodig ondersteuning te bieden en ethische eindpunten te kiezen.

4.2Muizen

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>T-mutatie gevonden in een grote populatie van Noord-AfrikanenBIJpatiënten using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), het repliceren van de menselijke AT PTC). De genomische allelen werden vervolgens gekloond in een aangepaste versie van de NorCOMM-targetingvector voor zoogdieren met behulp van een 3-way Gateway Reaction (Bradley et al. 2012). De resulterende richtvectoren werden geëlektroporeerd in C2 ES-cellen (C57BI / 6N, afgeleid in A. Nagy lab, Toronto, Canada) en met succes gerichte klonen werden geïdentificeerd door selectie met G418 (Gertsenstein et al.2010). Integratie van de gemuteerde targetingcassette in de Atm-genlocus werd bevestigd door Southern blot en door sequencing van PCR-producten om de aanwezigheid van de Atm PTC-mutatie, foutloze targeting in de Atm-locus en foutvrije functionele componenten van de

vector (gegevens niet getoond). Positieve ES-klonen werden gebruikt voor blastocyst-injectie om de transgene lijnen te verkrijgen. Het transgene allel bevatte een floxed humane beta-actine promotor-deltaTK1-Neo cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(Fig.1A). Genotypering van de twee Atm-lijnen werd uitgevoerd door gebruik te maken van de volgende primers bij Tm 62 graden: Atm-gen-voorwaartse (F)-primer:5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; en Atm-gen reverse(R)primer: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', waardoor een wild-type allelproduct van 151 bp of gericht allelproduct van 241 bp werd gecreëerd (Fig. 1A, 1B). Atmn35~ en Atm035×v waren teruggekruist met C57Bl/6J-muizen gedurende 9 generaties (99,2 procent isogeen) voorafgaand aan cryopreservatie en daaropvolgende herderivaat met behulp van C57BI/6J-surrogaatmoeders. Atm735× en Atm?35x en Atm 35×/Q35× waren fokkers verkregen van F1 broer of zus Atm35 en Atm835X plus muizen. AtmR35×k35×: beide bleken vruchtbaar. Aptx knock-out (Aptx)-muizen werden gecreëerd en aan Dr. Mathews geleverd als embryo's van Dr. McKinnon (Ahel et al.2006), en vervolgens teruggewonnen via C57Bl/6J-surrogaatmoeders. Aptx'-muizen bevinden zich op een gemengde achtergrond van C57Bl/6 en 129. ATM35k35; Aptx-muizen van verschillende wildtype, heterozygote en homozygote combinaties werden gemaakt van Atm35X; Aptxt-fokkers werden gegenereerd door Atm?35×R35- en Aptx^-muizen te kruisen. Eén cohort van dubbele mutante en overeenkomstige controlemuizen werd gebruikt in de longitudinale gedragsstudie voor ganganalyses en SHERPA-testen (Fig. 2, 3). Meerdere extra cohorten van op leeftijd afgestemde dubbele mutant- en controlemuizen werden gebruikt voor elektrofysiologische, immunohistologische en verticale pooltestexperimenten (figuren 4, 7). Immunologische en eiwitexpressie-experimenten werden uitgevoerd met muizen die waren gefokt uit de oorspronkelijke AtmR35x en Atm35x afgeleide muizen (Fig. 5, 6 en 8). Genotypering werd uitgevoerd op oorweefselmonsters van P8-11-muizen. Real-time PCR-methoden uitgevoerd door Transnetyx Inc. werden gebruikt om het genotype van elk dier te bepalen. Dieren werden identificeerbaar gemaakt via teentatoeages die tegelijkertijd met een oorbiopsie werden gegeven. Unieke primers voor Atm35x en Atm35x werden gekwantificeerd en gebruikt om wildtype, heterozygote en homozygote muizen te identificeren (hierboven vermeld). Aptx'en Aptx*"-primers werden gebruikt om hun genotypen te bepalen.

4.3 Diergezondheid

Dieren werden gewogen via een digitale weegschaal op P8, 45, 120,210,400. De sterfte van dieren werd geregistreerd als de dag waarop ze dood werden aangetroffen, of op de dag van euthanasie waarop de dieren een humaan eindpunt bereikten (dier dat niet in staat was zichzelf te herstellen in de jaren 60, significante haarmatten die wijzen op gebrek aan zelfverzorging of overmatig leed zoals opgemerkt door de dierenarts personeel). Dierlijke karkassen werden onmiddellijk na overlijden ingevroren en postmortale necropsieën werden in batches uitgevoerd. De vermoedelijke doodsoorzaak werd naar beste vermogen vastgesteld in samenwerking met de stafdierenarts (Dr. Catalina Guerra) door visuele inspectie van de inwendige organen. Sommige muizen werden gekannibaliseerd of per ongeluk weggegooid door personeel van het vivarium en werden

daarom bestempeld als "vermist". Muizen zonder waarneembare visuele doodsoorzaak werden als "onbepaalbaar" bestempeld. waarschijnlijke doodsoorzaken (bijv. vergrote lever, urinewegblokkade) werden als "anders" bestempeld.

4.4 Gedrag

Alvorens een gedragstest uit te voeren, werden muizen gedurende ~ 20 minuten geacclimatiseerd aan de gedragssuite. Muizen werden op verschillende tijdstippen van de dag getest, in overeenstemming met hun dagelijkse cyclus. Een reeks gedragstests werd uitgevoerd op naïeve dubbelmutante muizen van de aangegeven genotypen op verschillende tijdstippen, afhankelijk van het gedrag, maar in hetzelfde cohort muizen. De reeks tests omvatte de Catwalk Gait-beoordeling (P45, 120,210, 400) en een subset van de SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College en Royal-London-Hospital Phenotype Assessment (SHERPA)-tests (P30 en 400). Deze tests werden uitgevoerd door de UCLA Behavioural Core. Dubbele mutant- en controlemuizen werden bovendien onderzocht op de Vertical Pole-test. Alle gedragsapparaten werden tussen elke proefpersoon afgeveegd met ethanol (70 procent).

Ganganalyse

We gebruikten een Noldus Catwalk Gait-analysesysteem dat is ontworpen om semi-automatisch de gang van muizen te meten en analyseren tijdens normaal lopen. In het kort, de beweging van muizen over een gang met glazen bodem is video opgenomen vanuit een centrale positie. Pootafdrukken worden in de video gemarkeerd door de lichte verlichting over het glazen loopplatform. Elke muisstap binnen een video wordt vervolgens semi-automatisch gedetecteerd met Catwalk XT (Noldus). Een run voor elke muis bestaat uit 3 proeven van consistente ambulatie over het bewaakte platform. Alleen consistente proeven worden geaccepteerd en muizen kunnen tot 10 pogingen doen om 3 conforme proeven in beide richtingen over de gang te voltooien. Compliant proeven werden gedefinieerd als die met beweging over het platform van minder dan 5 s lang en met niet meer dan 60 procent snelheidsvariatie. Eenmaal op het platform geplaatst, renden muizen over het algemeen heen en weer zonder dat de experimentator gevraagd werd.

Verticale paal

Muizen worden aan de bovenkant van een 80 cm hoge bout geplaatst met hun neus naar beneden en achterpoten zo dicht mogelijk bij de bovenkant. Muizen worden onmiddellijk vrijgelaten en de tijd begon onmiddellijk na plaatsing.

De tijd wordt gestopt wanneer de eerste voorpoot het oppervlak onder de paal raakt. De natuurlijke voorkeur van een muis is om onmiddellijk van de paal af te klimmen, en ze krijgen tot 60 seconden om de paal te doorkruisen, anders worden ze van de paal geholpen. Een niet-voltooide proef krijgt automatisch een tijd van 30 seconden, aangezien 95 procent van de muizen die niet binnen 30 seconden zijn afgedaald, nog steeds op de paal zaten bij de 60-markering. Gedragstests van SHIRPA werden uitgevoerd door de Gedragskern van de Universiteit van Californië, Los Angeles op P30

en P400. Alle parameters worden gescoord om een ​​kwantitatieve beoordeling te geven. waardoor de resultaten zowel in de tijd als tussen verschillende laboratoria kunnen worden vergeleken. Elke muis werd achtereenvolgens getest op alle gedragingen binnen een tijdspanne van ~20-min voordat hij naar de volgende muis ging. De onderzoeker was blind voor het dierlijke genotype. De screening werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (Rogers et al. 1997).

Gedragsobservatie

Het primaire scherm biedt een gedragsobservatieprofiel en de beoordeling van elk dier begint met het observeren van ongestoord gedrag in een kijkpot (10 cm diameter) gedurende 5 minuten. Naast het gescoorde gedrag van lichaamshouding, spontane activiteit, ademhalingsfrequentie en tremor, registreert de waarnemer alle gevallen van bizar of stereotiep gedrag en convulsies, dwangmatig likken, zelfdestructief bijten en retropulsie (achteruit lopen) en indicaties van ruimtelijke desoriëntatie.

Arena-gedrag

Daarna wordt de muis overgebracht naar de arena (30 cm x 50 cm) voor het testen van overdrachtsopwinding en observatie van normaal gedrag. De arena is gemarkeerd in een raster van 10 x 10 cm² vierkanten om de locomotorische activiteit binnen een periode van 30 s te meten. Terwijl de muis actief is in de arena, worden metingen van schrikreactie, gang, bekkenhoogte en staarthoogte geregistreerd.

Rugleuning

Het dier wordt in rugligging vastgehouden om autonoom gedrag vast te leggen. Tijdens deze beoordeling werden grijpkracht, lichaamstoon, oorschelpreflex, hoornvliesreflex, teenknelpunt, draadmanoeuvre en hartslag geëvalueerd.

Balans en oriëntatie

Ten slotte werden verschillende metingen van de functie van het vestibulaire systeem uitgevoerd. De oprichtreflex, contactoprichtreflex en negatieve geotaxistests werden uitgevoerd. Tijdens deze procedure werden vocalisatie, urineren en algemene angst, prikkelbaarheid of agressie geregistreerd.

Gebruikt materiaal

1. Duidelijk plexiglas arena (geschatte interne afmetingen 55x33 x18 cm). Op de vloer van de arena is een plexiglas plaat gemarkeerd met 15 vierkanten (11 cm). Een stijve horizontale draad (3 mm diameter) is over de rechterachterhoek bevestigd, zodat de dieren de zijkanten niet kunnen raken tijdens de draadmanoeuvre. Een raster (40x 20 cm) met een maaswijdte van 12 mm (ongeveer) is over de breedte van de doos bevestigd voor het meten van de staartophanging en het grijpkrachtgedrag. 2. Als kijkpot werd een doorzichtige cilinder van plexiglas (15 x 11 cm) gebruikt. 3. Eén roostervloer (40x 20 cm) met mazen van 12 mm waarop kijkpotten staan.4. Vier cilindrische roestvrijstalen steunen (3 cm lengte x 2,5 cm diameter) om roosters van de bank te tillen. 5. Een vierkante (13 cm) roestvrijstalen plaat voor het overbrengen van dieren naar de arena. 6. Knip lengtes van 3/0 Mersilk vast in de tang voor cornea- en oorschelpreflextesten 7. Een plastic deuvelstaaf werd geslepen tot een potloodpunt om speekselvloed en bijten te testen.8. Een pincet voor dissectieapparatuur, gebogen met fijne punten (125 mm pincet, Philip Harris Scientific, Cat. No. D46-174), voor de teenknelpunt. 9.Een stopwatch.10. Een IHR Click-box wordt gebruikt om de schrikreacties te testen. De Click Box genereert een korte toon van 20 kHz bij 90 dB SPL wanneer hij 30 cm boven de muis wordt gehouden. Neem contact op met Prof. KP Steel, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11.Een liniaal.12.Een doorzichtige plexiglasbuis van 30 cm met een inwendige diameter van 2,5 cm voor de contactoprichtende reflex.4.5 Elektrofysiologie Bereiding van een acute cerebellaire schijf Er werden schattige parasagittale schijfjes van 300 m dik gemaakt uit het cerebellum van experimentele en controlemuizen van nestgenoten door gepubliceerde methoden te volgen (Hansen et al., 2013). Kort gezegd, de kleine hersenen werden snel verwijderd en ondergedompeld in een ijskoude extracellulaire oplossing met de samenstelling van (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 glucose, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla en 1 NaHzPOa, pH 7,4 wanneer vergast met 5 procent CO-/95 procent O2. Cerebella werden parasagittaal doorgesneden met behulp van een vibratoom (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Duitsland) en aanvankelijk geïncubeerd bij 35 graden gedurende -30 min, en vervolgens geëquilibreerd en bewaard bij kamertemperatuur tot gebruik. Extracellulaire elektrofysiologie Extracellulaire en intracellulaire opnames werden verkregen van Purkinje-neuronen (PN's) in plakjes die constant werden geperfuseerd met een extracellulaire oplossing met carbogen-bubbels en die op 37°C (extracellulair) of 32°C (intracellulair) ± 1°C werden gehouden (zie hierboven). Cellen werden gevisualiseerd met DIC-optica en een 40x-objectief voor onderdompeling in water (NA 0.75) met behulp van een Zeiss Examiner-microscoop. Glazen pipetten met een weerstand van ~ 3 MQ (model P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) werden gevuld met extracellulaire oplossing en in de buurt van PN-axonheuvels geplaatst om actiepotentiaal-geassocieerde capacitieve stroomtransiënten in spanningsklemmodus te meten met de pipetpotentiaal gehouden op 0 mV. Voor opnames met hele cel-patchklem werden pipetten gevuld met een intracellulaire oplossing (mM): 140 maanden (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 Fosfocreatine (triszout), 1 EGTA, 4 Mg -ATP, 0,4 Na-GTP.100 μM Picrotoxine (Sigma) werd toegevoegd om remmende GABAegerische synaptische inputs te blokkeren. Gegevens zijn verkregen met behulp van

een MultiClamp 700B-versterker op 20 of 100 kHz in spannings- of stroomtangmodus, Digidata 1440 met pClamp10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en gefilterd op 2 tot 4 kHz. De serieweerstand lag meestal tussen de 10 en 15 MQ. Serieweerstand werd gecompenseerd met 80 procent alleen voor kortdurende plasticiteitsexperimenten. Voor extracellulaire opnames werden in totaal 20 tot 45 PN's geregistreerd van voor elk dier in alle genotypen, geslachten en leeftijdsgroepen. Opnamen werden verdeeld over zowel de mediaal-laterale als de rostrocaudale as van het cerebellum. Alleen cellen met een "gezond" uiterlijk (laag contrast van celgrenzen) en een regelmatige, ononderbroken vuursnelheid werden onderzocht. Tijdens de analyse bleken enkele cellen lacunes in het vuren van meer dan 2 seconden te hebben, en deze cellen werden uit de analyse geëlimineerd, omdat dit type vuren wordt geassocieerd met 'ongezond' zijn. Dubbel gemuteerd weefsel verschilde kwalitatief niet in uiterlijk onder DIC-microscopie voorafgaand aan opnames, noch was het aantal "ongezonde" cellen groter dan dat van andere genotypen (7 procent versus 4 tot 11 procent van alle cellen over controle-genotypen op P400). Ruimtelijke vergelijking van neurale activiteit werd verkregen door opname van seriële secties in de flocculus, laterale (2"d of 3'), tussenliggende (6" of 7e) en mediale (11" of 12t) plakjes. Lagere aantal plakjes werden gebruikt in de jongere leeftijdsgroepen (P45 en 110) om ongeveer overeen te komen met de relatieve positionering van opnames over leeftijdsgroepen. 0-3 opnames werden gemaakt van elke lob in elk plakje, afhankelijk van weefselkwaliteit en gezondheid. Elke opname duurde {{29} }minuut 3 tot 5 muizen werden gebruikt voor elke leeftijdsgroep en de onderzoeker was blind voor het genotype, de leeftijd en het geslacht.

Intracellulaire opnames werden verkregen van PN's in ofwel lobule IIl of VIl van het mediale cerebellum (dwz vermis); er werden geen statistische verschillen in eigenschappen waargenomen tussen lobben.

Analyses

Spontane actiepotentiaal interstimulus-intervallen werden gedetecteerd en geanalyseerd met behulp van standaard en aangepaste routines in ClampFit (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) en Excel (Microsoft). In het bijzonder werden actiepotentialen gedetecteerd met drempelwaarden en werden piekstatistieken (dwz frequentie en intervallengte) bepaald met behulp van aangepastlgorProroutines(TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/). De variatiecoëfficiënt van het gemiddelde inter-spike-interval (CV) en het mediane inter-spike-interval (CV2=2 ISIn plus 1-ISInl/(ISIn plus 1 plus ISIn)) werden berekend in Excel met aangepaste macro's. Standaard membraaneigenschappen werden geanalyseerd met behulp van lgorPro. RM werd bepaald door het gemiddelde te nemen van 3 spanningsspoorreacties op een -5 mV-stappuls van een -80 mV-houdpotentiaal en de resulterende stroomafbuiging te meten tussen 900 en 1000 ms na het begin. De membraantijdconstante werd gemeten door een enkele exponentiële aan te passen aan de initiële vervalfase van 90 procent tot 10 procent van de piek. CM werd berekend door de membraantijdconstante te delen door de RM.sEPSC-gebeurtenissen die werden geregistreerd over een 1- minuut en gedetecteerd en gemeten met Neuroexpress (v21.1.13). Parallelle en klimmende vezelaxonen werden gestimuleerd met behulp van theta-glaselektroden (WPI) en een TTL-gestuurde stimulusisolator (ISO-Flex, AMPI). Opgeroepen EPSC-amplituden en vervaltijdconstanten (1 exp. voor parallelle en 2 exp. voor klimmende vezels) werden geanalyseerd met behulp van aangepaste routines in lgorPro. Actiepotentialen werden onderzocht als onderdeel van een set van 1 s stroominjecties tussen -500 en 2250 pA (250 pA-stappen) met een houdstroom aangepast om een ​​~70 mV-potentiaal te behouden. Actiepotentiaalgolfvormen werden gemeten met behulp van custom

routines in lgorPro. De actiepotentiaaldrempel werd gedefinieerd als de eerste membraanspanning waarbij de eerste afgeleide 30 mV/ms overschreed (Zhu et al.2006).

4.6 Onderzoek van cerebellaire atrofie

Cerebellaire grootte Onmiddellijk na verwijdering van de hersenen van de schedel, werd een dorsaal beeld van de hele berg verkregen. Beelden werden vervolgens verwerkt met behulp van Fiji (NIH). De afmetingen van de voorhersenen en het cerebellum werden bepaald door hun 2-dimensionale ruimte te schetsen en vervolgens de oppervlakte te berekenen. We normaliseerden voor mogelijke verschillen in de totale hersengrootte door de resultaten van het cerebellum te delen door de grootte van de voorhersenen om een ​​relatieve cerebellum-tot-voorhersenen-verhouding te produceren. De onderzoekers waren blind voor het genotype van het dier. Immunohistochemie Op de respectieve onderzoekseindpunten (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0), mannelijke en vrouwelijke muizen van alle genotypen vertegenwoordigd in deze studie werd verdoofd met isofluraan en onderging transcardiale perfusie met fosfaatgebufferde zoutoplossing gevolgd door 4 procent (w/v) gebufferde paraformaldehyde (PFA) en vervolgens ontleed om de hersenen te extraheren. Beelden van de hele hersenen werden onmiddellijk na het verwijderen van de hersenen uit de schedel genomen en de hersenen werden vervolgens 24 uur ondergedompeld in 4 procent PFA en vervolgens gedurende 72 uur cryobeschermd in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,05 procent azide en 30 procent sucrose. uur en bewaard bij 4 graden tot verder gebruik. Het cerebellum werd gescheiden van de voorhersenen en parasagittale coupes met behulp van een glijdende microtoom "Microm HM 430, Thermo Scientific" ingesteld op een sectie met een dikte van 40 m. Cerebellumcoupes werden verzameld in een reeks van zes en bewaard in TBS-AF (TBS met 30 procent sucrose, 0,05 procent natriumazide en 30 procent ethyleenglycol) bij 4 graden of -20 graden tot verder gebruik. Voor immunofluorescentievisualisatie van Purkinje-neuronen, cerebellumsecties van zowel Atm*; Aptx*t en ATM?35×R35×; Aptx^(n=5 per genotype) werden driemaal 5 minuten in TBS gewassen en vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geblokkeerd in 15% normaal geitenserum, gevolgd door vrij zwevende incubatie in anti-calbindine D van konijn of muis -28k (1:1000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een rondschudapparaat. Secties werden vervolgens driemaal gedurende 5 minuten met TBS gewassen, gevolgd door vrij zwevende incubatie in geit-anti-konijn of muis Alexa Fluor 488 (1:1000) gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur op een rondschudapparaat. Na incubatie van secundair antilichaam werden secties drie keer gedurende 5 minuten in TBS gewassen, vervolgens gemonteerd en afgedekt met Fluoromount-G met DAPI. Voor sommige secties werden bovendien anti-gesplitste Caspase -3 (1:200) en anti-CD68 (1:400) antilichamen parallel met Calbindin onderzocht met behulp van een Alexa Fluor 647 (1:500) secundair antilichaam. Dia's werden gescand met Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver.2020) op een Zeiss-microscoop uitgerust met een ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) met behulp van een 2,5, 10,20,40 of 63x objectief en afbeeldingen vastgelegd met een Hamamatsu CMOS-camera (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus). Om het aantal calbindine-reactieve cellen in elke lob in de resulterende afbeeldingen te kwantificeren, gebruikten we Stereo Investigator om willekeurig 2 lijnen te tekenen met een lengte van 300 tot 500 μm in elke lob en handmatig het totale aantal PN's over de lengte geteld binnen de 40 um-dikte van het weefselplakje onder 40x vergroting. 2D-dichtheid (# PN's / (lineaire lengte * 40 um-dikte)) van de twee monsters per lobule gemiddeld voor verdere vergelijking tussen lobules en dieren. Calbindine-positieve PN-dendrietbreedten werden gemeten op een vooraf gedefinieerde locatie in lobule VI van elk dier in 25 of 40 um dikke weefselcoupes onder 20x vergroting. Dendritische breedten van de primaire en secundaire takken werden gemeten op de middellijn tussen de PN-cellichamen en de rand van de moleculaire laag. Per coupe werden tussen 7 en 13 dendrieten gemeten, één coupe per dier. Voor somatische PN-metingen werd Stereo Investigator gebruikt om willekeurig PN's te selecteren die over de gehele mediale sectie waren verdeeld onder een vergroting van 20x. De gemiddelde PN-breedte per dier werd bepaald door het gemiddelde te nemen van de resultaten over 3 seriële secties (16 tot 37 PN's per sectie). PN-breedten werden gemeten loodrecht op de PN-laag of op de uittredende dendriet als deze meer dan een paar graden scheef stond. De breedte van de moleculaire laag en de cellaag van de korrel (gevisualiseerd met respectievelijk Calbindin- en DAPI-kleuringen) werd bepaald in Stereo Investigator door het gemiddelde te nemen van twee breedtemetingen op vooraf gedefinieerde locaties voor elke lob, ongeveer halverwege de lengte van elke lob onder een vergroting van 2,5x. CD68 positiviteit in de cerebellaire secties werd gekwantificeerd door het totale procentuele oppervlak van CD68 plus positieve kleuring over de gehele mediale cerebellaire sectie te meten. 10x gestikte afbeeldingen werden gedrempeld naar de negatieve controle en gekwantificeerd met ImageJ, één sectie per dier. Om het percentage Calbindin-positieve PN's te kwantificeren dat positief was voor gesplitst Caspase-3, hebben we PN's over het hele cerebellum geteld met behulp van Stereo Investigator. Drie, 20x vergroting gestikte beelden per dier werden onderzocht en de resultaten werden gemiddeld. De drempel voor Caspase-3-positiviteit werd vastgesteld op basis van controlecoupes die waren gekleurd met alleen de secundaire antilichamen. Voor niet-fluorescerende histologische analyse, 25-um-dikke, vrij zwevende weefselcoupes op positief geladen objectglaasjes en 's nachts aan de lucht gedroogd. Het weefsel werd tweemaal gedurende 5 minuten gewassen in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), daarna achtereenvolgens gekleurd met 0,1 procent hematoxyline in 95 procent ethanol gedurende ~ 25 seconden en 0,5 procent eosine in 95 procent ethanol gedurende ~ 3 seconden en daarna gewassen in dubbel gedestilleerd water. elke vlek. Het weefsel werd vervolgens gedurende 1 minuut gedehydrateerd in 95 procent ethanol, 100 procent ethanol en 100 procent xyleen, en vervolgens afgedekt met Permount. Dia's werden afgebeeld met behulp van een kleurencamera (Q Imaging, MBF Biosciences) op dezelfde Zeiss-microscoop en MBF-acquisitiesoftware. Experimenteerders waren blind voor het muizengenotype waarin secties werden onderzocht, en de volgorde van onderzoek was tussengevoegd voor alle histologische metingen.

4.7 Flowcytometrie-metingen

Flowcytometrie-analyse van bloed- en thymuscellen werd uitgevoerd door kleuring met specifieke anti-muis-antilichamen - CD4, CD8, CD3, CD44 en CD25. In het kort werden volbloedmonsters （50 gekleurd met behulp van fluorescent-gelabelde antilichamen, vervolgens werden rode bloedcellen gelyseerd met behulp van BD-lyseringsoplossing terwijl levende witte bloedcellen werden gekleurd met behulp van een levensvatbaarheidskleuring. Thymi werden mechanisch gedissocieerd. 1 tot 2 miljoen thymuscellen werden op dezelfde manier gekleurd met behulp van specifieke antilichamen voor CD4, CD8, CD44 en CD25. Analyse van immunologisch gekleurde witte bloedcellen of thymusmonsters werd uitgevoerd met behulp van FACS ARIA l en gegevens werden geanalyseerd met FlowJo-software zoals eerder gerapporteerd (Sanghez et al. 2017).

4.8 Westerse BIOS

Eiwitextracten (cellen/weefsels) werden gehomogeniseerd in radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysisbuffer (150 mM NaCl, 1 procent Nonidet P-40 [NP-40],0 0,5 procent deoxycholaat,0,1 procent SDS,50 mM Tris, pH 8,0) met proteaseremmers (10 ug/ml AEBSF,10 ug/ml leupeptine,5 ug/ml pepstatine,5 ug/ml chymotrypsine, 10 ug/ml aprotinine). De eiwitextracten werden gesoniceerd en vervolgens gepelleteerd door centrifugatie bij 13 000 rpm gedurende 15 minuten bij 4°C. BCA-eiwittest werd gebruikt om eiwitconcentraties te kwantificeren. Monsters die gelijke hoeveelheden eiwit van 50 tot 100 ug per baan bevatten, werden gescheiden met behulp van 4 tot 12 procent gradiënt TGX prefab gels BioRad en vervolgens overgebracht door TransBlot Semi-Dry BioRad-systeem met behulp van Nitrocellulose-overdrachtspakket. Overgedragen blots werden gekleurd door Ponceau S-kleuring voor gelijke eiwitbelading, vervolgens gewassen en geblokkeerd met 5% magere droge melk in TBST gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Primaire antilichamen werden een nacht bij 4 graden onder schudden geïncubeerd. Blots werden onderzocht op de volgende antilichamen: ATM (D2E2) konijn mAb celsignalering, bij 1:1000 verdunning, -actine (D6A8) konijn mAb celsignalering, GAPDH (D16H11) konijn mAb celsignalering gevolgd door de geschikte mierikswortelperoxidase-geconjugeerde ( HRP)secundair Anti-konijn, Anti-muis gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Na meerdere wasbeurten met TBST werd eiwitexpressie gedetecteerd door Radiance Plus-chemiluminescentiesubstraat met behulp van de Azure c400 en de BioRad ChemiDoc-beeldvormingssystemen. Densitometrische analyse van de ATM werd uitgevoerd met behulp van ImageJ. Experimenten werden uitgevoerd met 2 technische en 2-3 biologische replica's zoals aangegeven.

4.9 Statistische beoordeling

Het aantal dieren dat voor elke groep werd gekozen, was gebaseerd op a priori power-analyses met GPower v3.1 op basis van een grootte van 0.5, power van 0.8 en effectgroottes geschat op basis van voorlopige gegevens of eerdere studies. We gebruikten zowel parametrische (1-en 2-way ANOVA) voor normaal verdeelde en niet-parametrische (Kruskal Wallace) statistische methoden voor intervalgegevens om te testen op verschillen tussen groepen, gevolgd door paarsgewijze meervoudige vergelijkingstests zoals aangegeven in de tekst. Uitschieters voor immuungegevens in Fig. 6 en 7 werden uitgesloten via de ROUT-methode (Q=2 procent ). De specifieke analyses die voor elke dataset zijn gebruikt, worden vermeld in elke figuurlegenda. Voor alle figuren: ns niet significant,*p Kleiner dan of gelijk aan 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">