Acute dosisafhankelijke neuroprotectieve effecten van poly(pro-17 estradiol) in een muismodel van letsel door kneuzingen

Abstract

17 -Estradiol (E2) biedt neuroprotectie in preklinische modellen van ruggenmergletsel wanneer het systemisch wordt toegediend. Het doel van deze studie was om E2 langdurig lokaal op het gewonde ruggenmerg aan te brengen met behulp van poly(pro-E2) filmbiomaterialen.

Naarmate mensen meer te weten komen over ruggenmergletsels, beginnen we ons te realiseren welke impact dit heeft op de fysieke en mentale gezondheid van mensen. Hoewel ruggenmergletsels veel nadelige gevolgen kunnen hebben, kan de impact ervan op het geheugen gelukkig onder controle worden gehouden.

Eerst moeten we duidelijk maken wat een dwarslaesie is. Het ruggenmerg is een zenuw die wordt beschermd in de wervelkolom en die verantwoordelijk is voor het doorgeven van instructies van de hersenen naar verschillende delen van het lichaam. Als het ruggenmerg gewond raakt, verliezen sommige delen van het lichaam de goede verbinding met de hersenen, wat resulteert in de beweging van de ledematen, het gevoel en de autonome controle.

Ruggenmergletsels kunnen een zekere impact hebben op het geheugen van mensen, vooral in de vroege stadia van de revalidatie van patiënten met ruggenmergletsels. Ruggenmergletsels kunnen ervoor zorgen dat de aandacht, het werkgeheugen en het emotionele verwerkingsvermogen van een persoon verslechteren, wat het geheugenvermogen van een persoon zal beïnvloeden.

Deze negatieve effecten zullen echter geleidelijk afnemen naarmate patiënten een revalidatiebehandeling ondergaan. Patiënten kunnen hun geheugen verbeteren door deel te nemen aan geheugenspellen en andere cognitieve training. Tegelijkertijd is fysieke revalidatie ook bevorderlijk voor het herstel van de motorische en sensorische functies van het lichaam, waardoor de emotionele en cognitieve functies worden verbeterd.

We moeten patiënten met ruggenmergletsel aanmoedigen om actief deel te nemen aan de revalidatiebehandeling en door te gaan met revalidatietraining om de fysieke en mentale gezondheid te verbeteren. Geloof alstublieft dat patiënten met behulp van correcte cognitie en postoperatieve behandeling de impact van een dwarslaesie op het geheugen kunnen overwinnen en een actief leven kunnen blijven leiden. Het is duidelijk dat we het geheugen moeten verbeteren, en Cistanche kan het geheugen aanzienlijk verbeteren omdat Cistanche ook de balans van neurotransmitters kan reguleren, zoals het verhogen van de niveaus van acetylcholine en groeifactoren, die erg belangrijk zijn voor het geheugen en het leren. Bovendien kan Cistanche ook de bloedstroom verbeteren en de zuurstoftoevoer bevorderen, wat ervoor kan zorgen dat de hersenen voldoende voeding en energie krijgen, waardoor de vitaliteit en het uithoudingsvermogen van de hersenen worden verbeterd.

Klik op supplementen kennen om het geheugen te verbeteren

Na contusief ruggenmergletsel bij volwassen mannelijke muizen werden poly(pro-E2)-films subduraal geïmplanteerd en werd de neuroprotectie 7 dagen na het letsel en de implantatie beoordeeld met behulp van immunohistochemie. In deze onderzoeken verbeterden poly(pro-E2)-films de neuroprotectie bescheiden zonder de ontstekingsreactie te beïnvloeden. vergeleken met de gewonde controles.

Om de afgegeven dosis E2 te verhogen werden bolus-afgevende poly(pro-E2)-films vervaardigd door ongebonden E2 in de poly(proE2)-films op te nemen.

Vergeleken met de gewonde controlepersonen hebben bolusafgevende poly(pro-E2)-films echter niet significant de neuroprotectie verbeterd of de ontsteking beperkt op 7 of 21 dagen na het letsel. Toekomstig werk zal zich richten op de ontwikkeling van poly(pro-E2)-biomaterialen die in staat zijn om meer precies het vrijgeven van therapeutische doses E2.

INVOERING

Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) is een invaliderende aandoening die in de Verenigde Staten elk jaar meer dan 18000 mensen treft,1 terwijl de mondiale prevalentie van dwarslaesie wordt geschat op tussen de 236 en 1009 per miljoen.2

Patiënten getroffen door dwarslaesie lopen ernstige neurologische gebreken op, waaronder verlies van gevoel, verminderde darm-/blaasfunctie en verlamming.3,4 De primaire impact op het ruggenmerg resulteert in neuronale dood op de plaats van het letsel, die verder wordt verergerd door verschillende secundaire letselcascades waarbij astrocyten en macrofagen betrokken zijn. .

Na verloop van tijd vormen deze astrocyten een gliaal litteken dat de uitbreiding van axonen voorbij de laesierand verhindert.5 Er zijn tot nu toe geen door de FDA goedgekeurde neuroprotectieve medicijnen voor de behandeling van dwarslaesie.

Onderzoek dat tientallen jaren heeft geduurd, heeft zich geconcentreerd op de systemische toediening van biomoleculen om neuronaal verlies als gevolg van secundair letsel te voorkomen en/of axonale regeneratie te bevorderen, wat uiteindelijk leidt tot herstel van verloren functie.6 Eén biomolecuul dat in preklinische modellen van dwarslaesie een grote belofte heeft getoond, is het vrouwelijke geslachtshormoon, 17 -estradiol(E2).

Toediening van E2 is in grote lijnen gunstig voor het centrale zenuwstelsel door het verminderen van ontstekingen, het verlichten van de reactiviteit van gliacellen, het beperken van oxidatieve stress en het verzachten van door glutamaat geïnduceerde excitotoxische neuronale dood. E2 verbetert het functionele herstel in verschillende knaagdiermodellen van SCI. 16,17 Interessant is dat systemische toediening van meerdere doses E2 sneller functioneel herstel induceert18,19 vergeleken met dieren die slechts één enkele dosis kregen.17

Omdat E2 het functionele herstel effectiever bevordert via regimes met meerdere doses, was ons doel om E2 stabiel lokaal op de plaats van het letsel af te geven (om eventuele afwijkende effecten te voorkomen) om problemen te omzeilen die voortkomen uit meerdere doseringen/systemische injecties van E2.

Daartoe hebben we een poly(prodrug) biomateriaalstrategie toegepast waarbij het natieve geneesmiddel (E2) eerst werd gefunctionaliseerd met reactieve allylgroepen en vervolgens werd gepolymeriseerd via foto-geïnitieerde thiol-een radicaaladditie met een flexibel oligo-(ethyleenglycol) dithiol, zoals eerder beschreven. .20 We verkregen polymeerketens met een hoog molecuulgewicht, die bestaan ​​uit een E2prodrug als de zich herhalende eenheid binnen het polymeer.

Bij hydrolytische afbraak laat het polymeer geleidelijk E2 vrij in de omringende media. De enige andere bijproducten die vrijkomen zijn kooldioxide en oligo(ethyleenglycol) (oEG) (Figuur 1). Poly(pro-E2)-ketens die tot films of microvezels zijn vervaardigd, kunnen in vitro E2 vrijgeven in nanomolaire concentraties op een tijdschaal van maanden tot jaren. .20

De E2 die vrijkomt uit deze poly(pro-E2)-scaffolds is bioactief, en deze scaffolds bevorderen neurotrofisme en neurobescherming in vitro door neuronen te beschermen tegen door waterstofperoxide geïnduceerde oxidatieve stress. Hier hebben we de poly (pro-E2) films toegepast in een muizenmodel van contusie SCI, onmiddellijk na verwonding, en hun neuroprotectieve vermogen in vivo beoordeeld.

Ons oorspronkelijke poly(pro-E2)-filmontwerp verhoogde de neuroprotectie acuut (7 dagen na het letsel) op de plaats van het letsel zonder de ontstekingsreactie te beïnvloeden. Omdat poly(pro-E2)-films nanogram E2 per dag afgeven, hebben we een andere afgiftestrategie ontwikkeld waarbij ongebonden E2 werd opgenomen in de poly(pro-E2)-matrix. Onze hypothese was dat de bolusafgifte van ongebonden E2 extra neuroprotectieve voordelen zou kunnen bieden.

Poly(pro-E2)-films gaven E2 op een burst-wijze vrij, gevolgd door aanhoudende afgifte van E2 uit het polymeer bij lagere concentraties. Immunohistologische kleuring beoordeelde neuronen, astrocyten en macrofagen / microglia die aanwezig waren op de plaats van het letsel acuut (7 dagen na het letsel) en chronisch (21 dagen na het letsel) na dwarslaesie in de aanwezigheid van deze bolus-afgevende poly (pro-E2) films.

RESULTATEN EN DISCUSSIE

Poly(pro-E2)-films geven E2 vrij in nanomolaire concentraties, bevorderen de neuronale uitgroei uit het dorsale wortelganglion en beschermen neuronen tegen door waterstofperoxide geïnduceerde oxidatieve stress in vitro.20 De hier gepresenteerde studie probeert het vermogen van poly(pro-E2) te bepalen. films om in vivo neuroprotectie te bieden met behulp van een muizenmodel van contusie SCI.

Een matige kneuzing SCI werd geïnduceerd bij volwassen mannelijke muizen, en onmiddellijk na het letsel werden poly (pro-E2) films direct boven het letsel geplaatst (Figuur 2A). Om ervoor te zorgen dat de poly(pro-E2)-films na implantatie op hun plaats bleven, werden poly(pro-E2)-films geladen met rhodamine B geïmplanteerd in de ruggenmerg van gewonde dieren. Zeven dagen na de implantatie werden de ruggengraat verzameld en in beeld gebracht met behulp van een lichtmicroscoop (Figuur 2B). Bij alle dieren bleven de geïmplanteerde, met rhodamine B geladen poly(pro-E2)-films op hun plaats, waardoor het implantatieprotocol werd gevalideerd.

Om het vermogen van poly(pro-E2)-films om neuroprotectie te bieden en ontstekingen te verlichten te testen, werden poly(pro-E2)-films (zonder rhodamine B) geïmplanteerd na een verwonding door een ruggengraatcontusie, en de ruggenmergen werden 7 dagen na verwonding en implantatie verzameld. Er werden longitudinale secties (10 μm dik) gesneden, gecentreerd rond het epicentrum van de verwonding, en immuungelabeld om neuronen en macrofagen in het ruggenmerg zichtbaar te maken (Figuur 3).

Secties werden gelabeld voor NeuN om de neuronale aanwezigheid te beoordelen, en kwantitatieve analyse van de kleuring onthulde dat de poly (pro-E2) films het NeuN-positieve gebied rond het epicentrum van de verwonding aanzienlijk vergrootten in vergelijking met de gewonde controles die geen filmimplantaten ontvingen (Figuur 3A; p=0.0002). Aanvullende kleuring voor axonen met behulp van NFH (neurofilament heavy chain) onthulde ook het acute neuroprotectieve effect van de geïmplanteerde poly (pro-E2) films (Figuur 3B; p=0.0017).

We hebben waargenomen dat deze verandering in neuroprotectie niet te wijten was aan een verandering in de apoptose (caspase 3) op de plaats van het letsel (ondersteunend figuur S1; p=0.9966). Kleuring voor geactiveerde macrofagen (CD68) bracht ook geen enkel effect aan het licht. significante verschillen tussen de met poly(pro-E2) film behandelde dieren en de onbehandelde dieren (Figuur 3C; p= 0.7207).

Alles bij elkaar verhogen poly(pro-E2)-films de neuroprotectie op bescheiden wijze acuut zonder de ontstekingsreactie te veranderen. Poly(pro-E2)-films verhoogden de neuronale dichtheid acuut met bijna 20%, maar de films hadden geen duidelijke ontstekingsremmende effecten (gebaseerd op de kwantificering van het gebied dat wordt ingenomen door de geactiveerde macrofagen) (Figuur 3).

Dit gebrek aan vermindering van ontstekingen kan erop wijzen dat de ontstekingsremmende en neuroprotectieve doses E2 verschillend zijn en dat beide niet werden bereikt met de huidige filmformulering.20 We veronderstelden dat het verhogen van de E2-afgifte uit de poly(pro-E2)-films de ontsteking acuut zou kunnen verminderen. en een robuustere neuroprotectieve respons mogelijk maken.

Om de dosis E2 die acuut vrijkomt te verhogen, werden de poly(pro-E2)-films zodanig gemodificeerd dat de bolus E2-afgifte onmiddellijk na implantatie zou plaatsvinden. Na de bolusafgifte van E2 zou de afbraak van het polymeer volgen, waardoor E2 in dezelfde concentratie als voorheen vrijkwam. Het hierboven beschreven experiment werd herhaald met behulp van deze bolusafgevende poly(pro-E2)-films, en neuroprotectie en ontsteking werden 7 dagen na het letsel (dpi) beoordeeld.

In plaats van een bijkomend voordeel vergrootten de bolusafgevende poly(pro-E2)-films echter het NeuN-positieve gebied niet significant in vergelijking met de gewonde, onbehandelde controles (Figuur 4A; p=0.6770). De bolus-afgevende poly(proE2)-films verhoogden de CD68-expressie, maar de toename was niet statistisch verschillend (p= 0.1780).

Toenemende trends in gliale reactiviteit en microgliale ontsteking werden ook waargenomen in de aanwezigheid van de bolus-afgevende poly(pro-E2) films als gevolg van de toename van de expressie van GFAP (astrocyten) en Iba1 (microglia); deze stijgingen waren echter niet statistisch groter dan wat werd waargenomen bij de gewonde, onbehandelde controles (respectievelijk p=0.3233 en p=0.3053). Alles bij elkaar genomen verbeterden bolus-afgevende poly(pro-E2) films de neuroprotectie niet, en werden de reactiviteit van astrocyten en de aanwezigheid van macrofagen/microglia niet verminderd zoals aanvankelijk werd verondersteld.

Omdat er geen verschillen werden waargenomen tussen gewonde, onbehandelde dieren en gewonde, met bolus afgevende poly(proE2) film behandelde dieren op het acute tijdstip van 7 dpi, werd een chronisch tijdstip geselecteerd voor verder onderzoek, aangezien de poly(pro-E2) films kan E2 langdurig vrijgeven.20 Het hierboven beschreven experiment werd herhaald met de bolus-releasing poly(pro-E2) films, maar de dieren werden chronisch beoordeeld bij 21 dpi (Figuur 5).

Ruggenmerg werd gelabeld voor dezelfde celtypen als eerder vermeld. Na analyse was er een trend in de richting van een toename van de oppervlaktefractie van NeuN bij de bolus-afgevende poly(pro-E2)film-geïmplanteerde dieren vergeleken met de gewonde, onbehandelde dieren (Figuur 5A; p=0.0897) Bovendien werden trends waargenomen waarbij bolusafgevende poly(pro-E2)-films de gebiedsfractie van CD68- en GFAP-expressie verminderden in vergelijking met gegevens van onbehandelde, gewonde controledieren (Figuur 5B, C; p=0.0859 en p=0.2780).

Geen van de trends was echter statistisch verschillend. Aan de andere kant vertoonden Iba1-gelabelde weefselcoupes van met bolus afgevende poly(pro-E2) behandelde dieren een verhoogde expressie vergeleken met gegevens van onbehandelde, gewonde controles (p < 0.0001). Uit ons eerdere werk blijkt dat poly(pro -E2) films gegoten op dekglaasjes van 15 mm x 15 mm geven ongeveer 266 ng E2 per dag vrij, wat zich vertaalt naar ongeveer 2 ng E2 per dag uit de hier gebruikte films (1 mm x 1,8 mm). De bolusafgevende poly(pro-E2)-films geven acuut na implantatie nog eens 40 µg ongebonden E2 vrij.

Onderzoek dat zich richt op het gebruik van E2 in SCI-modellen bij knaagdieren toont aan dat een lage dosis oestrogeen (10 ug/kg), intraveneus toegediend, de reactieve gliose verzwakt en neuroprotectie biedt, terwijl het ontstekingsgebeurtenissen verzacht, apoptose remt en de angiogenese verhoogt.21 Omgekeerd hebben hoge, systemische doses oestrogeen schadelijke effecten, waaronder een verhoogd aantal diepe veneuze trombose en kanker22,23 en de ontwikkeling van vrouwelijke fysieke kenmerken bij mannen. Dit is opmerkelijk omdat het grootste deel van het E2-onderzoek zich heeft gericht op het systemisch toedienen van E2, hetzij intraveneus, hetzij intraperitoneaal.

Gezien de veiligheidsproblemen bij het systemisch gebruik van hoge doses E2, is het belangrijk om de E2-concentratie te optimaliseren voor lokale afgifte aan het gewonde ruggenmerg om bijwerkingen te voorkomen. Tot nu toe heeft slechts één onderzoek E2 uit een biomateriaal geleverd door nanodeeltjes te gebruiken om focaal E2 af te geven (2,5 ug of 25 ug). Het vrijkomen uit nanodeeltjes verminderde de ontsteking snel acuut in een ratmodel van contusie SCI.9 Het ontbreken van een statistisch significante respons in onze gegevens (figuren 4 en 5) kan te wijten zijn aan een onbalans in de hoeveelheid E2 die we lokaal aan het ruggenmerg afleveren. er wordt te veel E2 (40 µg) acuut vrijgegeven, terwijl er chronisch heel weinig (2 ng) vrijkomt.

Hoewel wat we uit deze gegevens waarnemen bescheiden trends zijn, benadrukt deze studie het belang van E2-dosering om neuroprotectie in vivo te bevorderen. Het verlagen van de initiële dosering van E2 en het aanpassen van de afbraakkinetiek van het poly(pro-E2) biomateriaal zou dit probleem kunnen helpen verlichten en mogelijk betere neuroprotectieve resultaten opleveren.

Hoewel deze studie uitsluitend bij mannen werd uitgevoerd, is het van cruciaal belang om het effect van deze poly(pro-E2) films bij beide geslachten te beoordelen om een ​​geldig translationeel potentieel voor dit biomateriaal vast te stellen. Onderzoek heeft aangetoond dat verhoogde oestrogeenniveaus bij vrouwen na dwarslaesie gedeeltelijk verantwoordelijk kunnen zijn voor hun verbeterde functionele resultaten vergeleken met mannen.24 Omdat er een verhoogde oestrogeenaanwezigheid is bij vrouwen, moet elke biomateriaalstrategie waarbij oestrogeen wordt gebruikt rekening houden met dit verhoogde niveau en het materiaal aanpassen. de afgiftekinetiek dienovereenkomstig om ervoor te zorgen dat de toegediende dosering hetzelfde blijft voor mannen en vrouwen.

METHODEN

Fabricage van poly(pro-E2)-films.

Het poly(pro-E2) polymeer P1 werd gesynthetiseerd en gekarakteriseerd zoals eerder in detail beschreven.20 Het polymeer heeft een gewichtsgemiddeld molecuulgewicht van MW ~ 80 kDa en een dispersiteit van ± 3, volgens gelpermeatiechromatografie (GPC). Poly(pro-E2)films werden vervaardigd door het polymeer op te lossen in chloroform (5 gew.%/gew; polymeer/chloroform), de oplossing te druppelgieten op glazen dekglaasjes van 15 mm x 15 mm (100 μl oplossing per dekglaasje) en deze achter te laten een nacht onder vacuüm drogen (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Om poly(pro-E2)-films met ongebonden E2 te maken, werden films vervaardigd door ongebonden E2 (Abcam, Cambridge, MA) toe te voegen aan de polymeeroplossing (0.0625 gew.%/gew; E2/chloroform) vóór het druppelgieten de oplossing op de dekglaasjes. Vóór implantatie werden de dekglaasjes met films gedurende 30 minuten gesteriliseerd met behulp van ultraviolette (UV) straling en werden de films van de dekglaasjes gepeld in een steriele bioveiligheidskast. De poly(pro-E2)-films werden vervolgens in stukken van 1 mm x 1,8 mm gesneden, geschikt voor implantatie in een volwassen muis, zoals hieronder beschreven.

Kneuzing van het ruggenmerg en implantatie van poly(pro-E2)-films.

Alle chirurgische en postoperatieve zorgprocedures werden goedgekeurd door Rensselaer PolytechnicInstitute en de Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC). Om een ​​kneuzing SCI te veroorzaken, werden volwassen mannelijke C57BL/6-muizen (10- tot 12-week oud), gekocht bij Jackson Laboratory (voorraadnr. 000664; Bar Harbor, ME), verdoofd met een intraperitoneale injectie. van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg). De ruggen van de dieren werden geschoren en aseptisch bereid met behulp van 70% ethanol en betadine.

Na plaatsing van het dier op een verwarmingskussen dat op 37 graden werd gehouden, werden de huid- en spierlagen geopend om de wervelkolom bloot te leggen, en werd een dorsale laminectomie uitgevoerd op de thoracale negende (T9) wervel om het ruggenmerg bloot te leggen. Een matige (75 kdyn) kneuzingSCI werd op dit niveau geïnduceerd met behulp van een Infinite Horizons-impactor (Precision Systems and Instrumentation, Lexington, KY).

Nadat hemostase was bereikt, werd de dura geopend (Figuur 2) en werd een poly(pro-E2)-film of een bolusafgevende poly(pro-E2)-film (1 mm x 1,8 mm) onder de dura en boven het ruggenmerg geplaatst, waardoor de plaats van het letsel. Bij controledieren werd de dura geopend maar werden de poly(pro-E2)-films niet geïmplanteerd. De spierlagen werden vervolgens gesloten met steriele hechtingen en de huid werd gesloten met steriele metalen wondklemmen.

De muizen kregen 2 ml steriele zoutoplossing subcutaan geïnjecteerd en werden teruggebracht naar hun kooien en op een glaasjesverwarmer geplaatst die een nacht op 37 graden was ingesteld. Om een ​​goede hydratatie te garanderen en infecties te voorkomen, werden de muizen gedurende de eerste 5 dagen na het letsel (dpi) dagelijks subcutaan geïnjecteerd met 1-2 ml steriele zoutoplossing en Gentocin (1 mg/kg). Gedurende de duur van de experimenten werden de blazen twee keer per dag handmatig tot expressie gebracht. Alle dieren werden onder conventionele omstandigheden gehuisvest in een licht-donkercyclus van 12-uur met ad libitum toegang tot voedsel en water.

Weefsel oogsten.

Op de aangegeven eindtijdpunten van 7 of 21 dpi werden de muizen geïnjecteerd met een lethale dosis ketamine/xylazine (1,5 x chirurgische dosis) en transcardiaal geperfuseerd met 0.1 Mfosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,4) gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7,4). De ruggenmerg werd verwijderd, 2 uur nagefixeerd in 4% PFA en vervolgens overnacht overgebracht naar 0.2M fosfaatbuffer (PB; pH 7,4).

De ruggengraat werd gedurende 48 uur bij 4 graden tegen cryoprotectie gehouden in 30% sucrose en vervolgens geblokkeerd in segmenten van 10 mm, gecentreerd rond de plaats van het letsel, met de dorsale kolommen naar boven gericht. Deze secties werden ingebed in een Tissue-Tek-medium met optimale snijtemperatuur (VWR International, Radnor, PA) en snel ingevroren op droogijs. Alle ruggenmergen werden in secties verdeeld op 10 μm op een Microm HM505E-cryostaat, geplaatst op ColorFrost Plus-glaasjes (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), en vervolgens bewaard bij -20 graden totdat het werd gebruikt voor immunokleuring.

Immunohistochemie en kwantificering.

De objectglaasjes werden gedurende 1 uur ontdooid op een objectglaasjeswarmer en vervolgens driemaal gespoeld in 0.1 MPBS. De endogene peroxidase-activiteit werd uitgedoofd door de objectglaasjes gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen in 6% H2O2 verdund in methanol. Na driemaal wassen in 0,1 M PBS werden de coupes geïncubeerd met 4% BSA en 0,1% Triton X-100 in 0,1 M PBS gedurende 1 uur gevolgd door incubatie gedurende de nacht van de primaire antilichamen bij 4 graden of RT (Tabel 1).

De objectglaasjes werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met geschikte gebiotinyleerde secundaire antilichamen (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Om het gebonden antilichaam zichtbaar te maken, werden de objectglaasjes gedurende 1 uur geïncubeerd met Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) en gedurende 10 minuten ontwikkeld met ImmPACT3,3'-diaminobenzidine (DAB) of Vector SG-substraat (Vector Laboratories).

De coupes werden gedehydrateerd door middel van opeenvolgende incubaties van 2 x 2 minuten in 70% en 90% ethanol, 2 x 3 minuten in 100% ethanol, gevolgd door 3 x 3 minuten in Histoclear, en uiteindelijk afgedekt met Permount (ThermoFisher Scientific). Voor de kwantificeringsanalyse werden zes secties per dier, met een onderlinge afstand van 100 μm in het gewonde ruggenmerg, gebruikt.

De immunogelabelde secties werden afgebeeld met behulp van een Axioplan 2-beeldmicroscoop uitgerust met een AxioCam digitale camera en AxioVision versie 4.8.2-software (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Duitsland) en een 5x-objectief.

Het aantal positieve pixels in elk van de secties werd geteld met behulp van MIPAR-beeldanalysesoftware (MIPAR, Worthington, OH) om de procentuele positieve oppervlaktefractie per sectie te berekenen. Het gemiddelde percentage positieve oppervlakte van de zes secties per dier werd voor elk van de vlekken berekend en gerapporteerd.

Statistische analyse.

Alle gegevens worden gerapporteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de GraphPad Prism 9 Statistical Software (GraphPad Software, San Diego, CA). In alle experimenten werden per groep 5 à 6 dieren gebruikt, afkomstig uit ten minste twee verschillende dierpartijen. Om de verschillen tussen de controle- en poly(pro-E2)-filmgroepen te testen, werd de Student's t-test (figuren 3, 4 en 5) gebruikt. De significantie werd vastgesteld op p Kleiner dan of gelijk aan 0.05.

Aanvullend materiaal

Raadpleeg de webversie op PubMed Central voor aanvullend materiaal.

DANKWOORD

De auteurs danken Wenmin Lai voor haar hulp bij de muisoperaties.

Financiering

Dit werk kreeg steun van Craig H. Neilsen Foundation Fellowship (Grant 468116) en Paralyzed Veterans of America Research Foundation Fellowship (Grant 3171) aan MKG en van NIH R01 (Grant NS092754) en New York State Spinal Cord Injury Review Board Institutional Support Grant C32245GG aan RJG Al het dierenwerk werd uitgevoerd met hulp van de Neuroscience Department Surgical Core van de Ohio State University, ondersteund door NINDS Grant P30NS104177.

REFERENTIES

(1). Nationaal statistisch centrum voor ruggenmergletsel. (2020) Feiten en cijfers over ruggenmergletsel in aGlance, Universiteit van Alabama in Birmingham, Birmingham, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J en Brown D (2011) Een mondiale kaart voor traumatische epidemiologie van ruggenmergletsel: naar een levende gegevensopslagplaats voor letselpreventie. Ruggenmerg. 49, 493-501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Ruggenmergletsel - verleden, heden en toekomst. Journal of Spinal CordMedicine 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ en Wilson DA (2010) Over de gehele staat onderzoek naar medisch begeleide gezondheidsproblemen van personen met ruggenmergletsel. J. Ruggenmergmed. 33 (3), 221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J en Miller JH (2004) Regeneratie voorbij het gliallitteken. Nat. Ds. Neurosci. 5 (2), 146–156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK en Banik NL (2013) Ruggenmergletsel: een overzicht van de huidige therapie, toekomstige behandelingen en fundamentele wetenschappelijke grenzen. Neurochem. Res. 38, 895-905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M en Beyer C (2018) Oestrogeen verzwakt de lokale inflammasoomexpressie en -activering na ruggenmergletsel. Mol. Neurobiol. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG en Yune TY (2018) Oestrogeen verlicht neuropathische pijn veroorzaakt door ruggenmergletsel door remming van microglia en astrocytenactivering. Biochim. Biofysiek. Acta, Mol. Basis dis. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A en Banik N (2015) Nanodeeltjes-oestrogeen in ruggenmergletsel van ratten veroorzaakt snelle ontstekingsremmende effecten in plasma, hersenvocht en weefsel.J. Neurotrauma 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK en Banik NL (2010) Oestrogeenbehandeling na letsel bij chronische ruggenmergletsel verbetert de bewegingsfunctie bij ratten. J. Neurosci. Res. 88 (8), 1738–1750. [PubMed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H en Akaike A (2001) Niet-genomische antiapoptotische signaaltransductie door oestrogeen in gekweekte corticale neuronen. J.Neurosci. Res. 64 (5), 466–475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK en Banik NL (2003) Oestrogeen als neuroprotectief middel bij de behandeling van ruggenmergletsel. Ann. NY Acad. Wetenschap 993.125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com