Geacyleerde fenylethanoïde oligoglycosiden met hepatoprotectieve activiteit van de woestijnplant Cistanche Tubulosa

voor meer informatie:Ali.ma@wecistanche.com

Toshio Morikawa et al

Abstract

Het methanolische extract van verse stengels vanCistanche tubulosa(Orobanchaceae) bleek hepatoprotectieve effecten te vertonen tegen door D-galactosamine (D-GalN)/lipopolysaccharide (LPS) geïnduceerde leverbeschadiging bij muizen. Uit het uittreksel, drie nieuwefenylethanoïdeoligoglycosiden, kankanosiden H1 (1), H2 (2) en I (3) werden samen met 16fenylethanoïde glycosiden(4-19) en twee geacyleerde oligosuikers (20,21). De structuren van 1-3 werden bepaald op basis van spectroscopische eigenschappen en chemisch bewijs. Onder de isolaten waren echinacoside (4, IC50=10,2 lM), acteoside (5, 4,6 lM), isoacteoside (6,5,3 lM), 20-acetylacteoside (8, 4,8 lM) en tubuloside A (10,8,6 M) remde door D-GalN geïnduceerde dood van hepatocyten. Deze vijf isolaten, 4 (31,1 lM), 5 (17,8 lM), 6 (22,7 lM), 8 (25,7 lM) en 10 (23,2 lM), en cistantubuloside B1 (11, 21,4 lM) verminderden ook TNF-a- geïnduceerde cytotoxiciteit in L929-cellen. Bovendien vertoonden de belangrijkste bestanddelen (4-6) in vivo hepatoprotectieve effecten bij doses van 25-100 mg/kg, PO.

Klik om bijwerkingen en Cistanche producten te cistanche

1. Inleiding

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) is een meerjarige parasitaire plant die groeit op wortels van Salvadora- of Calotropis-soorten en wordt verspreid in Noord-Afrika, Arabië en Aziatische landen.2Stammen vanCistanche tubulosaevenals hulp bij salsa en cistanche deserticola worden van oudsher gebruikt voor de behandeling van impotentie, steriliteit, spit en lichaamszwakte, evenals een bevorderend middel voor de bloedcirculatie.2,3 Eerder hebben verschillendefenylethanoïdes, iridoïden, monoterpenen en lignanen werden geïsoleerd uit het Chinees en PakistanCistanche tubulosa.2,4–9 In de loop van onze karakteriseringsstudies naar bioactieve bestanddelen in dit natuurlijke geneesmiddel, rapporteerden we eerder dat vijf iridoïden, kankanosiden A–D en kankanol, een monoterpeneglycoside, kankanoside E, tweefenylethanoïdeoligoglycosiden, kankanosiden F en G (23) en een geacyleerde oligosuiker, kankanose (21) werden geïsoleerd uit het methanolische extract van gedroogde stengels vanCistanche tubulosa.10,11 Bovendien bleken het methanolische extract en verschillende isolaten zoals echinacoside (4), acteoside (5), cistanoside F (20), 21 en kankanoside F vaatverwijdende effecten te vertonen, d.w.z. remmende effecten tegen geïnduceerde contracties. door noradrenaline in geïsoleerde thoracale aorta van ratten.11 In onze voortdurende onderzoeken naar bestanddelen in de plant, werd een methanolisch extract van verse stengels vanCistanche tubuli wasbleek een beschermend effect te vertonen op leverbeschadiging veroorzaakt door D-galactosamine (D-GalN)/lipopolysaccharide (LPS) bij muizen. Uit het methanolische extract hebben we drie nieuwefenylethanoïdeoligoglycosiden genaamd kankanosiden H1 (1), H2 (2) en I (3) samen met 16 fenylethanoïde glycosiden (4-19) en twee geacyleerde oligosuikers (20, 21). Dit artikel gaat over de isolatie en structurele opheldering van deze nieuwefenylethanoïdeoligoglycosiden (1-3). Structurele vereisten van de fenylethanoïde glycosiden voor de hepatoprotectieve activiteit worden ook besproken (Fig. 1)

2. Resultaten en discussie

2.1. Beschermende werking van methanolisch extract uit stengels vanCistanche tubulosaop leverbeschadiging veroorzaakt door D-GalN/LPS bij muizen

Verse stengels vanCistanche tubulosa(gekweekt in Urumqi, XinjiangProvince, China) werden geëxtraheerd met methanol onder terugvloeikoeling en een methanolisch extract (8,36 procent van de verse stengels). Zoals weergegeven in tabel 1, vertoonde het methanolische extract bij doses van 250-500 mg/kg, PO, een remmend effect op de toename van serumaspartaataminotransaminase (sAST) en alanineaminotransaminase (sALT), markers van leverbeschadiging, geïnduceerd door D- GalN/LPS bij muizen.

2.2. Chemische bestanddelen uit stengels vanCistanche tubulosa

Een methanolisch extract van de verse stengels vanCistanche tubulosawerd onderworpen aan Diaion HP-20 kolomchromatografie (H20?MeOH) om H20- en MeOH-geëlueerde fracties te geven (respectievelijk 5,63 procent en 2,73 procent). De met MeOH geëlueerde fractie werd onderworpen aan SiO2- en ODS-kolomchromatografieën en tenslotte HPLC om drie nieuwefenylethanoïdeoligoglycosiden, kankanosiden H1 (1, 0.0008 procent), H2 (2, 0,0001 procent) en I (3, 0,007 procent) samen met 16fenylethanoïde glycosiden, echinacoside2,11 (4, 0,45 procent), acteoside2,11 (5, 0,28 procent), isoacteoside2,11 (6, 0.0 41 procent), cis-acteoside12,13 (7, 0.0007 procent), 20-acetylacteoside2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 procent), decaffeoylacteoside14 (9, 0.0002 procent ), tubulo-zijde A2,11 (10, 0,013 procent), cistantubulosides B19 (11, 0,0020 procent), B29 (12,0,0003 procent), arenarioside15 (13, 0,0006 procent), wiedemanninoside C16 (14,0.0008 procent), cistantubuloside A9 (15, 0,0009 procent), syringalide A 30-OaL rhamnopyranoside4 (16, 0,0017 procent), campneosiden I17,18 (17,015 procent) en II17,18 (18 , 0,0005 procent), en salidroside11 (19, 0,0027 procent), en twee geacyleerde oligosuikers, cistanoside F11 (20, 0,0004 procent) en kankanose11 (21, 0,0004 procent).

2.3. Structuren van kankanosiden H1 (1), H2 (2) en I (3)

Kankanoside H1 (1) werd verkregen als een wit poeder met negatieve optische rotatie (½a-24D-45.3 in MeOH). Het IR-spectrum vertoonde absorptiebanden bij 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{107}}70 en 1040 cm 1 toe te schrijven aan hydroxylen, estercarbonylen, etherfuncties, en aromatische ringen. De FABMS-spectra met positieve en negatieve ionen van 1 vertoonden quasimoleculaire ionenpieken bij respectievelijk m/z 835 (M plus Na) plus en m/z 811 (MH), en de molecuulformule werd bepaald als C37H48O20 door positieve ion FABMS-meting. De 1H- en 13C-NMR-spectra van 1 (CD3OD, tabellen 2 en 3), die werden toegewezen door verschillende NMR-experimenten,19 toonden signalen die toewijsbaar zijn aan twee methyleenverbindingen [d 2,70(2H, m, H2-7), 3,66 , 4,07 (1H elk, beide m, H2-8)], ortho- en meta-gekoppelde ABC-type aromatische protonen [d 6,52 (1H, dd, J=1,8,7,8 Hz, H{ {50}}), 6,65 (1H, d, J=1,8 Hz, H-2), 6,67 (1H, d, J=7,8 Hz,H{{62 }})], twee bD-glucopyranosylgroepen [d 4,29 (1H, d, J=7,8 Hz, terminaal-Glc-H-1), 4,54 (1H, d, J {{76 }},2 Hz, inner-Glc-H-1)] en aa-L-rhamnopyranosylgroep [d 1,06 (3H, d, J=6},0 Hz, Rha-H{{89 }}),4.80 (1H, br s, Rha-H-1)] samen met een acetylgroep [d 1.98(3H, s)] en een trans-p-coumaroylgroep {een trans-olefine [d 6,34,7,67 (1H elk, beide d, J=16,0 Hz, H-8 en 7)] en ortho-gekoppelde A2B2-type aromatische protonen [d 6,80, 7,46 (2H elk , beide d,J=8,7 Hz, H-3,5 en 2,6)]}. Connectiviteiten tussen de oligoglycoside- en acylgroepen in 1 werden gekarakteriseerd door een HMBC-experiment, dat lange-afstandscorrelaties liet zien tussen de volgende proton- en koolstofparen: inner-Glc-H-1 en C-8 (dC71.9 ); inner-Glc-H-2 [d 4.88 (1H, dd-achtig)] en de acetylcarbonylkoolstof (dC 171.4); inner-Glc-H-4 [d 5,08 (1H, dd, J=9,6, 9,6 Hz)] en de p-coumaroylcarbonylkoolstof (dC 168,2); Rha-H-1 en inner-Glc-C-3 (dC 80.5); en terminal-Glc-H-1 en inner-Glc-C-6 (dC69.3) (Fig. 2). Ten slotte maakte alkalische hydrolyse van 1 met 5 procent kaliumhydroxide (KOH) trans-p-coumarinezuur vrij, dat werd geïdentificeerd door HPLC-analyse, samen met een gedeacyleerd product. Het gedeacyleerde product werd achtereenvolgens behandeld met 1,0 M zoutzuur (HCl) om L-rhamnose en D-glucose vrij te maken, die werden geïdentificeerd door HPLC-analyse met behulp van een optische rotatiedetector.10,11 Zo werd de structuur van kankanoside H1 opgehelderd als {{181 }}(3,4-dihydroxyfenyl)ethyl OaL-rhamnopyranosyl-(1- 3)-[bD-glucopyranosyl-(1-6)]-2-O-acetyl{{196 }}O-trans-p-coumaroyl-bD-glucopyranoside (1).

Kankanoside H2 (2) werd geïsoleerd als een wit poeder met negatieve optische rotatie (½a 25 D 52,4 in MeOH). De molecuulformule C37H48O20 bleek dezelfde te zijn als die van 1 door FABMS-meting met hoge resolutie positieve ionen. De spectroscopische eigenschappen van 2 waren zeer vergelijkbaar met die van 1, behalve signalen vanwege de cis-p-coumaroylgroep [d 5,79, 6,95 (1H elk, beide d, J=12,8 Hz, H{{ 22}} en 7), 6,76, 7,73 (2H elk, beide d, J=8,7 Hz, H-3,5 en 2,6)]. Verder onthulde het HMBC-experiment op 2 ook vergelijkbare modi van correlaties op lange afstand als die gedetecteerd voor 1 tussen de volgende proton- en koolstofparen: inner-Glc-H-1 [d 4.51 (1H, d, J {{44 }},8 Hz)] en C-8 (dC 72,0); inner-Glc-H-2 [d 4.88 (1H, m)] en de acetylcarbonylkoolstof (dC 171.4); inner-Glc-H-4 [d 4,98 (1H, dd, J=9,6, 9,7 Hz)] en de p-coumaroylcarbonylkoolstof (dC 166,7); Rha-H-1 [d 4,77 (1H, d, J=1,4 Hz, Rha-H-1)] en inner-Glc-C-3 (dC 80,7 ); en terminal-Glc-H-1 [d 4.28 (1H, d, J=7.8 Hz)] en inner-Glc-C-6 (dC 69.4) (Fig. 2) . Door de afbraakstudie gaf 2 cis-p-coumarinezuur en twee dezelfde suikers als die verkregen in het geval van 1. Bijgevolg werd de structuur van kankanoside H2 opgehelderd als 2-(3,4- dihydroxyfenyl)ethyl OaL-rhamnopyranosyl-(1-3)- [bD-glucopyranosyl-(1-6)]-2-O-acetyl-4-O-cis-p-coumaroyl- bD-glucopyranoside (2).

Kankanoside I (3) werd ook geïsoleerd als een wit poeder met negatieve optische rotatie (½a- 25D-62.2 in MeOH). De moleculaire formule, C35H46O18, werd bepaald door positieve en negatieve FABMS- en HRFABMS-metingen. De spectroscopische eigenschappen van 3(CD3OD, Tabellen 2 en 3) waren superponeerbaar op die van echinacoside (4), behalve voor signalen vanwege het aglycondeel {{twee methylenen {d 2.95 (2H, dd, J=7). 3, 7,8 Hz, H2-7), [3,79 (1H, m), 4,10 (1H,dt, J=16,9, 7,3 Hz), H{{32} }]}, monogesubstitueerde aromatische protonen [d7.18 (1H, m, H-4), 7,26-7,28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. Alkalische hydrolyse van 3 met 5% KOH vrijgemaakt transcafeïnezuur, en het gedeacyleerde product werd achtereenvolgens behandeld met 1,0 M HC1 om L-rhamnose en D-glucose vrij te maken. Ten slotte werden de verbindingen van de acylgroep en de suikergroepen in 3 opgehelderd door het HMBC-experiment, zoals weergegeven in figuur 2. Op basis van het bovengenoemde bewijsmateriaal werd de structuur van kankanoside I opgehelderd als 2-fenylethyl OaL- rhamnopyranosyl-(1-3)-[bD-glucopyrano-syl-(1-6)]-4-O-trans-caffeoyl-bD-glucopyranoside (3)

2.4. Effecten van chemische bestanddelen van de stengels van Cistanche tubulosa op D-GalN-geïnduceerde cytotoxiciteit in primaire gekweekte muizenhepatocyten

Het is bekend dat D-GalN/LPS-geïnduceerde leverbeschadiging zich ontwikkelt via immunologische reacties.19 Dit type leverbeschadiging komt naar verluidt in twee vormen voor. Ten eerste wordt de gevoeligheid voor TNF-a door uitputting vanuridinetrifosfaat in hepatocyten verhoogd door D-GalN. Ten tweede worden pro-inflammatoire mediatoren, zoals NO en TNF-a, vrijgemaakt uit LPS-geactiveerde macrofagen (Kupffer's cellen). Apoptose van hepatocyten door TNF-a zou een belangrijke rol spelen bij door D-GalN/LPS geïnduceerde leverbeschadiging.20

In onze eerdere onderzoeken naar leverbeschermende stoffen uit natuurlijke geneesmiddelen, hebben we gerapporteerd dat verschillende bestanddelen uit Hovenia Dulcis,21 Bupleurum scorzonerifolium,22,23 Curcuma zedoaria,24–26Angelica furcijuga,27,28 Betula sativum,30 Salacia reticulata,31 Tilia argentea,32 Anastatica hierochuntica,33 Panax notoginseng,34 Cyperus longus,35 Erycibe expansa,36Camellia sinensis,37 Sedum sarmentosum,38,39 Sinocrassula indica,40Hedychium coronarium,41 en Piper chaba42,43 vertoonden hepatoprotectieve effecten op de leverbeschadiging/LPS geïnduceerd door D-GalN bij muizen en/of platyphylla var. japonica,29 Pisum-remmend effect op D-GalN-geïnduceerde cytotoxiciteit in primaire gekweekte hepatocyten. Aangezien het methanolische extract van de stengels vanCistanche tubulosatoonde hepatoprotectieve effecten op D-GalN/LPS-geïnduceerde leverbeschadiging bij muizen (vide ante), het remmende effect van de bestanddelen op D-GalN-geïnduceerde cytotoxiciteit in primaire gekweekte muizenhepatocyten werd onderzocht met behulp van de 3-(4,{ {6}}dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test. Zoals weergegeven in Tabel 4, echinacoside (4, IC50=10,2 lM), acteoside (5, 4,6 lM), isoaceteoside (6, 5,3 lM), 20-acetylacteoside (8, 4,8 lM), tubulosiden A (10,8,6 M) en B11 (22, 14,6 M), en kankanoside G11 (23, 14,8 M) vertoonden een sterke activiteit. Hun activiteiten waren groter dan die van commerciële silybine (38,8 lM),33–43 als positieve controle.44,45 De structurele vereisten van defenylethanoïde glycosiden for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 µM)]; (2) het aglycon met de 3,4-dihydroxygroep vertoonde een sterkere activiteit dan dat met de 4-hydroxygroep (6 > 23); (3) de 60-ObD-glucopyranosylgroep verminderde de activiteit (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" het="" 8-obd-glucopyranosyl-deel="" met="" de="" 40-o-caffeoylgroep="" vertoonde="" een="" sterkere="" activiteit="" dan="" dat="" met="" de="" 60-o-caffeoylgroep="" (5="6," 8=""> 22 ); en (5) introductie van de 20-O-acetylgroep verminderde de activiteit (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 M, gegevens niet getoond). Deze verbindingen bleken dus geen invloed te hebben op de overproductie van NO en TNF-a van LPS-geactiveerde macrofagen.

2.5. Effecten van de chemische bestanddelen op door TNF-a geïnduceerde cytotoxiciteit in L929-cellen

Om de effecten van de bestanddelen op de gevoeligheid van hepatocyten voor TNF-a te verduidelijken, werd door TNF-a geïnduceerde afname van de levensvatbaarheid van L929-cellen een TNF-a-gevoelige cellijn48 onderzocht met behulp van de MTT-assay. Zonder testmonsters was de levensvatbaarheid van de cellen verminderd tot ca. 60 procent na incubatie van de cellen met 20 ng/ml TNF-a gedurende 44 uur vergeleken met het geval zonder TNF-a. Zoals weergegeven in Tabel 5, echinacoside (4, IC50=31,1 lM), acteoside (5, 17,8 lM), isoaceteoside (6, 22,7 lM), 20-acetylacteoside (8, 25,7 lM), tubuloside A (10,23,2 M) en cistantubuloside B1 (11, 21,4 M) remden de afname van de levensvatbaarheid van de cellen, en hun activiteiten bleken groter dan die van piperine42,43 en silybine. De structurele vereisten van defenylethanoïde glycosiden for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 M)]; en (5) introductie van de 20-O-acetylgroep verminderde de activiteit (8 < 5,="" 22="">< 6).="" deze="" vereisten="" waren="" vergelijkbaar="" met="" die="" waargenomen="" in="" het="" vorige="" hoofdstuk="" met="" betrekking="" tot="" de="" remmende="" effecten="" op="" d-galn-geïnduceerde="" cytotoxiciteit="" in="" primair="" gekweekte="">

Deze in vitro bevindingen suggereren de volgende mogelijke werkingsmechanismen voor het hepatoprotectieve effect van de bestanddelen van stengels van:Cistanche tubulosa: (i) afname van door D-GalN geïnduceerde cytotoxiciteit (4-6, 8, 10, 22 en 23), en (ii) afname van door TNF-a geïnduceerde cytotoxiciteit (4-6, 8, 10 en 11) .

2.6. Beschermende effecten van echinacoside (4), acteoside (5) en isoacteoside (6) tegen leverbeschadiging veroorzaakt door D-GalN/LPS-muizen en hun werkingsmechanisme

Ten slotte onderzochten we het effect van principalfenylethanoïde glycosiden, echinacoside (4), acteoside (5) en isoacteoside (6) op de door D-GalN/LPS geïnduceerde leverbeschadiging bij muizen. Zoals getoond in tabellen 6 en 4-6 remde significant de toename van sAST en sALT geïnduceerd door D-GalN/LPS bij muizen bij doses van 25-100 mg/kg, PO. Aan de andere kant had 4-6 geen invloed op de overproductie van TNF-a uit LPS-geactiveerde macrofagen. Verder remden 4-6 significant de dood van L929-cellen veroorzaakt door TNF-a, wat wijst op een afname van de gevoeligheid van L929-cellen voor TNF-a (vide ante). Deze bevindingen suggereren dat 4-6 de gevoeligheid van deze cellen voor de door TNF-a geïnduceerde cytotoxiciteit vermindert. Veel verbindingen die door D-GalN geïnduceerde celdood en de productie van TNF-a remmen, zijn gerapporteerd,24,26,32 maar er zijn weinig verbindingen gerapporteerd die de gevoeligheid van hepatocyten voor TNF-a selectief verminderen.42,43,49,50

Tot slot, van verse stengels vanCistanche tubulosa, drie nieuwefenylethanoïde glycosiden, kankanosides H1 (1), H2 (2) en I (3) samen met 16 bekendefenylethanoïde glycosiden(4-19) en twee geacyleerde oligosuikers (20, 21) werden geïsoleerd. Structurele vereisten voor hun beschermende effecten op door D-GalN geïnduceerde hepatocytbeschadiging en cytoprotectieve effecten op L929-cellen veroorzaakt door TNF-a waren als volgt; (1) het aglycondeel was essentieel voor de activiteit; (2) het aglycon met de 3,4-dihydroxygroep vertoonde een sterkere activiteit dan dat met de 4-hydroxygroep; (3) de 60-ObD-glucopyranosylgroep verminderde de activiteit; (4) het 8-ObD-glucopyranosyl-deel met de 40-O-caffeoylgroep vertoonde een sterkere activiteit dan dat met de 60-O-caffeoylgroep; en (5) introductie van de {{27 }}O-acetylgroep verminderde de activiteitfenylethanoïde glycosiden, echinacoside(4), acteoside (5) en isoacteoside (6) remden de toename van insAST en zout bij doses van 25-100 mg/kg PO in met D-GalN/LPS behandelde muizen, en er werd gesuggereerd dat die remmende effecten afhankelijk van de verminderde gevoeligheid van hepatocyten voor TNF-a. De gedetailleerde werkingsmechanismen van defenylethanoïde glycosidenverder bestudeerd moeten worden.

3. Experimenteel

3.1. Algemeen

De volgende instrumenten werden gebruikt om spectrale en fysieke gegevens te verkrijgen: specifieke rotaties, Horiba SEPA-300 digitale polarimeter(l=5 cm); UV-spectra, Shimadzu UV-1600-spectrometer; IR-spectra, Shimadzu FTIR-8100 spectrometer; 1H en 13C NMR-spectra, JEOLJNM-ECA600 (600 en 150 MHz) en JEOL JNM-ECS400 (400 en 100 HMz) spectrometers met tetramethylsilaan als interne standaard; FABMS en hoge resolutie FABMS, JEOL JMS-SX 102A massaspectrometer; HPLC-detector, Shimadzu RID-10A brekingsindex, Shimadzu SPD-10A UV–vis en Shodex OR-2 optische rotatiedetectoren. HPLC-kolom, Cosmosil 5C18-MS-II en pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4,6 mm id) en (250 - 20 mm id) kolommen werden gebruikt voor respectievelijk analytische en preparatieve doeleinden.

De volgende experimentele omstandigheden werden gebruikt voor chromatografie: normale fase silicagelkolomchromatografie (CC), silicagel 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63-210 mesh, sferisch, neutraal ); omgekeerde-fase silicagel CC, Diaion HP-20 (NipponRensui) en Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); normale fase TLC, voorgecoate TLC platen met silicagel 60F254 (Merck, 0,25 mm); reversed-phase TLC, voorgecoate TLC-platen met silicagel RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); reversed-phase HPTLC, voorgecoate TLC-platen met silicagel RP-18 WF254S(Merck, 0,25 mm), de detectie werd bereikt door te besproeien met 1 procent Ce(SO4)2–10 procent waterig H2SO4, gevolgd door verwarming .

3.2. Plantaardig materiaal

Verse stengels vanCistanche tubulosagekweekt in Urumqi, provincie Xinjiang, China, werden in september 2007 verzameld. Het plantmateriaal werd geïdentificeerd door een van de auteurs (MY). In ons laboratorium ligt een voucher voor het plantmateriaal.

3.3. Extractie en isolatie

De verse stengels vanCistanche tubulosa(2,98 kg) werden fijn gesneden en driemaal geëxtraheerd met methanol onder terugvloeikoeling gedurende 3 uur. Verdamping van het oplosmiddel onder verlaagde druk leverde een methanolisch extract (249,1 g, 8,36 procent). Het methanolische extract werd onderworpen aan Diaion HP 20 CC (5,0 kg, H20?MeOH) om H20- en MeOH-geëlueerde fracties te geven (167,84 g, 5,63 procent en 81,21 g, 2,73 procent respectievelijk). De door MeOH geëlueerde fractie (61,00 g) werd onderworpen aan normale fase silicagel CC[1,8 kg, CHCl3-MeOH-H2O (15:3:0,4-1{{48} }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH] om zeven fracties te geven [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4(10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) en 7 (4,60 g)]. De fractie 2 (9,56 g) werd gescheiden door omgekeerde fase silicagel CC [400 g,MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)?MeOH?aceton] om vijf fracties te geven [Fr. 2-1 (55,9 mg), 2-2 (4,48 g), 2-3 (3,42 g), 2-4 (1,16 g) en 2-5 (31,9 mg)]. De fractie 2-3 (1.00 g) werd onderworpen aan HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN–1% waterige AcOH (7:93, v/ v)] om zeven breuken te geven [Fr. 2-3–1 (66,5 mg), 2-3–2 (20,4 mg), 2-3–3 (26,0 mg),2–3–4 (136,6 mg), 2-3-5 (38{{300}},6 mg), 2-3-7 (84,9 mg)]. De fractie 2–3–4 (106,6 mg) werd verder gezuiverd door HPLC [Cosmosil pNAP,CH3CN–1% waterige AcOH (5:95, v/v)] om salidroside (19,13,7 mg, {{340}}.0{{409}}27 procent). De fractie 4 (10,69 g) werd gescheiden door omgekeerde fase silicagel CC [500 g, MeOH–H2O (30:7 0,v/v)?MeOH?aceton] om vier fracties te geven [Fr. 4–1 (878,2 mg), 4–2 (7.06 g), 4–3 (1,57 g) en 4–4 (792,8 mg)]. De fractie 4–2 (1,5{{560}} g) werd onderworpen aan HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% waterige AcOH (2{{57{{586}) }}}:80, v/v)] om vijf breuken te geven {Fr. 4–2–1(42,9 mg), 4–2–2 [= campneoside I (17, 67,0 mg, 0,014 procent)], 4–2– 3 [= acteoside (5, 1,21 g, 0,26 procent)], 4-2-4 (41,6 mg) en 4-2-5 (181,3 mg)}. De fractie 4–2–4 (41,6 mg) werd verder gezuiverd door HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 procent waterige AcOH (18:82, v/v)] om isoacteoside (6, 19,1 mg, 0,0040 procent) en cis-acteoside te geven (7,3,4 mg, 0,0007 procent). De fractie 4–3 (1,57 g) werd gezuiverd door HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% waterige AcOH (20:80, v/v)] om 11 fracties te geven [Fr. 4–3–1 (30,4 mg), 4–3–2 (55,2 mg), 4–3–3 (= 17, 22,1 mg, 0,0010 procent), 4–3–4 (= 5 , 224,6 mg, 0,010 procent), 4-3-5 (27,4 mg), 4-3-6 (43,6 mg), 4-3-7 (= 6, 825,0 mg, 0,037 procent), 4-3 –8 [= syringa lide A 30-OaL-rhamnopyranoside (16, 37,6 mg, 0,0017 procent)], 4–3–9 (39,8 mg), 4–3–10 [{{310} }acetylacteoside (8, 85,4 mg, 0,0038 procent)] en 4-3-11 (64,6 mg)]. De fractie 4–3–6 (43,6 mg) werd verder gezuiverd door HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 procent waterige AcOH (18:82,v/v)] om kankanosiden H1 te geven (1, 17,0 mg, 0,0008 procent) en H2 (2,3,3 mg, 0,0001 procent). De fractie 4–3–9 (39,8 mg) werd verder gezuiverd door HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 procent waterige AcOH (18:82, v/v)] om kankanoside I (3, 15,4 mg, 0,0007 procent) en 6 ( 3,1 mg, 0,0001 procent). De fractie 5 (8,84 g) werd gescheiden door omgekeerde fase silicagel CC [400 g, MeOH–H2O (20:80-30:70, v/v)?MeOH?aceton] tog zeven fracties [Fr. 5-1 (870,2 mg), 5-2 (478,9 mg), 5-3 (3,72 g), 5-4 (979,9 mg), 5-5 (1,19 g), 5-6 (1,27 g) en 5 –7 (130,1 mg)]. De fractie 5-1 (870,2 mg) werd gezuiverd door HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN-1 procent waterige AcOH (5:95, v/v)] om cafeïnevrij lacteoside (9, 5,1 mg, 0,0002 procent) en cistanoside F ( 20, 8,1 mg, 0,0004 procent). De fractie 5–3 (3,72 g) werd gezuiverd door HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN–1% waterige AcOH (15:85, v/v)] om zes fracties te geven [Fr. 5-3-1 (128,6 mg), 5-3-2 [= kankanose (21, 9,4 mg, 0,0004 procent)], 5-3-3 (64,6 mg), 5-3-4 (72,3 mg), 5–3–5 [= echinaco-zijde (4, 2,54 g, 0,11 procent) en 5–3–6 (318,5 mg)]. De fractie 5-3-4 (72,3 mg) werd verder gezuiverd door HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 procent AcOH in water (10:90, v/v)] om campneoside II te geven (18,10,6 mg, 0,0005 procent). De fractie 5-4 (979,9 mg) werd gezuiverd door HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 procent waterige AcOH (15:85, v/v)] tot gegeveninefracties [Fr. 5-4-1 (28,6 mg), 5-4-2 (90,5 mg), 5-4-3 (99,7 mg), 5-4-4 (= 4, 25,7 mg, 0,0012 procent), 5 –4–5 (16,4 mg), 5–4–6 (318,5 mg), 5–4–7 (21,6 mg), 5–4–8 (= 5, 204,4 mg, 0,0091 procent), en5– 4-9 (134,7 mg)]. De fractie 5–4–6 (318,5 mg) werd gezuiverd door HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 procent waterige AcOH (15:85, v/v)] om cistantubulosiden B1 (11, 44,9 mg, 0,0020 procent), B2 (12 , 7,6 mg, 0,0003 procent), en A (15, 21,1 mg, 0,0009 procent) en wiedemanninoside C (14, 17,2 mg, 0,0008 procent). De fractie 5-5 (1,19 g) werd gezuiverd door HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% waterige AcOH (18:82, v/v)] om tubuloside A (10, 300,3 mg, 0,013 procent) en arenarioside (13,5,8 mg, 0,0006 procent). De fractie 6 (12,52 g) werd gescheiden door omgekeerde-fase silicagel CC [600 g, MeOH-H2O (20:80-30:70,v/v)?MeOH?aceton] om vier fracties [Fr. 6-1 (553,8 mg), 6-2 (10,69 g), 6-3 (1,40 g) en 6-4 (17,8 mg)]. De fractie 6-2 (500,0 mg) werd gezuiverd door HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 procent waterige AcOH (25:75, v/v)] om 4 (353,1 mg, 0,34 procent) op te leveren. ).

3.3.1. Kankanoside H1 (1)

Een wit poeder, ½a- 24D -45.3 (c 1.06, MeOH). FABMS met positieve ionen met hoge resolutie: berekend voor C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637.Gevonden: 835,2633. UV [MeOH, nm (log e)]: 226 (4,33), 293 (sh, 4,36), 317 (4,52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070,1044 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD30D) d: gegeven in Tabel 2. 13CNMR (150 MHz, CD30D) dC: gegeven in Tabel 3. Positief-ion FABMS:m/z 835 (M plus Na) plus. Negatief-ion FABMS: m/z 811 (MH)-.

3.3.2. Kankanoside

H2 (2)Een wit poeder, ½a- 25D-52.4 (c 0.27, MeOH). FABMS met positieve ionen met hoge resolutie: berekend voor C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Gevonden: 835.2644. UV [MeOH, nm (log e)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: gegeven in Tabel 2. 13C NMR (150 MHz,CD3OD) dC: gegeven in Tabel 3. Positief-ion FABMS: m/z 835 (M plus Na) plus .Negatief-ion FABMS : m/z 811 (MH)-.

3.3.3. Kankageen kant I (3)

Een wit poeder, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). FABMS met positieve ionen met hoge resolutie: berekend voor C35H46O18Na (M plus Na) plus: 777.2581.Gevonden: 777.2585. UV [MeOH, nm (log e)]: 246 (3,97), 295 (sh,4,04), 334 (4,23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070,1046 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD30D) d: gegeven in Tabel 2. 13CNMR (150 MHz, CD30D) dC: gegeven in Tabel 3. Positief-ion FABMS:m/z 777 (M plus Na) plus. Negatief-ion FABMS: m/z 753 (MH)-.

3.4. Alkalische en zure hydrolyse van 1-3

Oplossingen van 1, 2 en 3 (elk 1,5 mg) in 5% waterig kaliumhydroxide (KOH, 0,5 ml) werden gedurende 1 uur bij 40°C geroerd. Elke oplossing werd geneutraliseerd met Dowex HCR W2 (H-plus-vorm) en de harsen werden door filtratie verwijderd. Verdamping van het oplosmiddel onder verlaagde druk leverde de overeenkomstige gedeacyleerde producten op, die werden onderworpen aan HPLC-analyse [kolom: Cosmosil pNAP,250 - 4,6 mm id; mobiele fase: CH3CN-1 procent waterige AcOH (15:85, v/v); detectie: UV (254 nm); stroomsnelheid: 1.0 ml/min] te identificeren als trans-cafeïnezuur (tR 9,9 min vanaf 3), trans-p-coumarinezuur (tR 17,1 min vanaf 1) en cis-p-coumarinezuur (tR17,8 min van 2), respectievelijk. Daarna werd elk opgelost in 1.0 MHCl (1.0 ml) en 3 uur verwarmd op 80°C. Na te zijn afgekoeld, werd het reactiemengsel geneutraliseerd met Amberlite IRA-400 (OH-vorm) en werden de harsen verwijderd door filtratie. Na verwijdering van het oplosmiddel onder verminderde druk werd het residu gescheiden door de Sep-Pak C18-patroonkolom (H20-MeOH). De met H20 geëlueerde fractie werd onderworpen aan HPLC-analyse onder de volgende omstandigheden: HPLC-kolom, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id - 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokyo, Japan); detectie, optische rotatie [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokyo, Japan); mobiele fase,CH3CN–H2O (85:15, v/v); stroomsnelheid 0,8 ml/min]. Identificatie van L-rhamnose (i) en D-glucose (ii) vrijgemaakt uit 1, 2 of 3 in de H2O-geëlueerde fractie werd uitgevoerd door vergelijking van hun retentietijden en optische rotatie met die van authentieke monsters [i,tR 9,9 min (negatief)] en [ii, tR 17,9 min (positief)].

3.5. Bioassay

3.5.1. Reagentia

LPS (van Salmonella enteritidis), minimaal essentieel medium (MEM) en William's E-medium werden gekocht bij Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, VS); foetaal runderserum (FBS) was van Invitrogen (Carlsbad, CA, VS); en andere chemicaliën waren van Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Japan). 96-Well-microplaten zijn gekocht bij Sumitomo Bakelite Co., Ltd (Tokyo, Japan).

3.5.2. Dieren

Mannelijke ddY-muizen werden gekocht bij Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd, (Wakayama, Japan). De dieren werden gehuisvest bij een constante temperatuur van 23 ± 2 C en kregen een standaard laboratoriumvoer (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo, Japan). Alle experimenten werden uitgevoerd met muizen bij bewustzijn, tenzij anders vermeld. Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de Experimental Animal Research Committee van Kinki University.

3.5.3. Beschermende effecten op door D-GalN/LPS geïnduceerde leverbeschadiging bij muizen

De methode beschreven door Tiegs et al.51 werd aangepast en gebruikt voor dit experiment. In het kort, mannelijke ddY-muizen met een gewicht van ongeveer 25-30 g vasten gedurende 20 uur vóór het experiment. D-GalN (350 mg/kg) en LPS (10 lg/kg) opgelost in zoutoplossing werden intraperitoneaal geïnjecteerd om leverbeschadiging te veroorzaken. Elk testmonster werd 1 uur vóór de D-GalN/LPS-injectie oraal toegediend. Bloedmonsters werden 10 uur na D-GalN/LPS-injectie verzameld uit de infraorbitale veneuze plexus. SAST- en sALT-niveaus werden bepaald met behulp van de Reitman-Frankel-methode (commerciële kit, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Hydrocortison werd als referentieverbinding gebruikt. Testmonsters werden gesuspendeerd met 5 procent Arabische gomoplossing en de oplossing werd in elk experiment oraal toegediend met 10 ml/kg, terwijl het vehikel oraal werd toegediend met 10 ml/kg in de overeenkomstige controlegroep.

3.5.4. Beschermende effecten op cytotoxiciteit geïnduceerd door D-GalN inprimair gekweekte muizenhepatocyten

Het hepatoprotectieve effect van de bestanddelen werd bepaald door de {{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT ) colorimetrische test met behulp van primaire gekweekte muizenhepatocyten.33-43 Hepatocyten werden geïsoleerd uit maleddY-muizen (30-35 g) door de collagenase-perfusiemethode. Een celsuspensie bij 4 - 104 cellen in 100 ul William's E medium met FBS (10 procent), penicilline G (100 eenheden/ml) en streptomycine (100 lg/ml) werd geïnoculeerd in een 96-well microplaat en voorgekweekt gedurende 4 uur bij 37 graden onder een 5 procent CO2-atmosfeer. Het medium werd toegevoegd met 100 ul van het verse medium dat D-GalN (2 mM) bevat, met of zonder het testmonster en de hepatocyten werden gedurende 44 uur gekweekt. Het medium werd verwisseld met 100 ul van het verse medium en 10 ul MTT [5 mg/ml in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)]-oplossing werd aan het medium toegevoegd. Na 4 uur incubatie werd het medium verwijderd en vervolgens werd 100 ul isopropanol met 0,04 M HC1 toegevoegd om het in de cellen geproduceerde formazan op te lossen. De optische dichtheid (OD) van de formazanoplossing werd gemeten met een microplaatlezer bij 570 nm (referentie: 655 nm). Remming (procent) werd verkregen door de volgende formule.

Remming ( procent )= [(OD(steekproef) - OD(controle))/(OD(normaal)-OD(controle))] x 100

3.5.5. Effecten op de productie van NO in LPS-gestimuleerde muisperitoneale macrofagen

Een screeningstest voor NO-productie met behulp van TGC-geïnduceerde peritoneale macrofagen van muizen werd uitgevoerd zoals eerder beschreven.43,46,

3.5.6. Effecten op de productie van TNF-a in LPS-gestimuleerde muisperitoneale macrofagen

TNF-a dat vrijkomt in het medium werd bepaald zoals eerder beschreven28 met een kleine wijziging. In het kort werden door TGC geïnduceerde peritoneale macrofagen van muizen (5 - 105 cellen/putje) verzameld uit de buikholten van mannelijke ddY-muizen, gesuspendeerd in 100 lLof RPMI 1640 aangevuld met 5 procent FBS, penicilline (100 eenheden/ ml) en streptomycine (100 lg/ml), en voorgekweekt in 96-well microplaten bij 37 graden in 5 procent CO2 in de lucht gedurende 1 uur. Niet-hechtende cellen werden verwijderd door wassen met PBS en 100 ul vers medium dat verschillende concentraties testverbinding bevatte werd toegevoegd. Na 10 min werd 100 ul van het medium dat 10 ug/ml LPS bevatte toegevoegd en 4 uur geïncubeerd. TNF-a-productie in elk putje werd bepaald met behulp van een ELISA-kit (Mouse TNF-a ELISA-kit, Invitrogen). Elke testverbinding werd opgelost in DMSO en de oplossing werd toegevoegd aan het medium (eindconcentratie DMSO 0,5 procent)

3.5.7. Remmende effecten op door TNF-a geïnduceerde celdood in L929-cellen

L929-cellen (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japan) werden bewaard in Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Sigma-Aldrich) met 10 procent FBS, 1 procent MEM niet-essentiële aminozuren (Invitrogen), penicilline G (100 eenheden /mL) en streptomycine (100 lg/mL) bij 37 C onder een 5 procent CO2-atmosfeer. De cellen werden geïnoculeerd in een 96-well weefselkweekplaat [3 -104 cellen/well in 100 ul/well in MEM]. Na 44 uur incubatie in het medium TNF-a (20 ng/ml) met of zonder het testmonster, werd de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld met de MTT colorimetrische test (videante).49,50 Elke testverbinding werd opgelost in DMSO, en de oplossing werd aan het medium toegevoegd (eindconcentratie in DMSO 0,5 procent).

3.6. Statistieken

Waarden worden uitgedrukt als gemiddelden ± SEM Eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door Dunnett's test werd gebruikt voor statistische analyse. Waarschijnlijkheidswaarden (p) kleiner dan 0.05 werden als significant beschouwd.

Dankbetuigingen

TM, KN en OM werden ondersteund door een Subsidie ​​voor Wetenschappelijk Onderzoek van 'High-tech Research Center' Project voor Particuliere Universiteiten: matching fund subsidie ​​van een Subsidie ​​voor Wetenschappelijk Onderzoek van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur , Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT) van Japan, 2007-2011 en ook ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek van MEXT. MY en HM werden ondersteund door het 21e COE-programma, Academic Frontier Project en een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek van MEX

Van: 'Geacyleerd'fenylethanoïdeoligoglycosiden met hepatoprotectieve activiteit van de woestijnplantCistanche tubulosa' doorToshio Morikawa et al

---Bio-organische en medicinale chemie 18 (2010) 1882-1890.