Aanhangende en hangende baby-hamsterniercellen hebben een ander cytoskelet en oppervlaktereceptorrepertoire

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Veronika Dille¹, Florian Pfaff¹, Aline Zimmer ID², Martin Beer¹, Michael Eschbaumer ID^1*

Abstract

Dierlijke celkweek, waarin enkele cellen groeienoponthoud, idealiter in een chemisch gedefinieerde omgeving, is een steunpilaar van de biofarmaceutische productie. De synthetische omgeving mist exogene groeifactoren en vereist gewoonlijk een tijdrovend aanpassingsproces om celklonen te selecteren die zich inoponthoudtot hoge celaantallen. De moleculaire mechanismen die de aanpassing vergemakkelijken en die in de cel plaatsvinden, zijn grotendeels onbekend. Vooral voor cellijnen die worden gebruikt voor de productie van virusantigeen, zoals babyhamsterniercellen (BHK-cellen), is de beperking van de virusgroei door de ontwikkeling van ongewenste celkenmerken hoogst ongewenst. De vergelijking tussen hechtend groeiende BHK-cellen en suspensiecellen met verschillendegevoeligheidaan het mond- en klauwzeervirus toonden verschillen aan in de expressie van cellulaire receptoren zoals integrines en heparansulfaten en in de organisatie van het actine-cytoskelet. Transcriptoomanalyses en groeikinetiektoonde de diversiteit van BHK-cellijnen aan en bevestigde het belang van goed gekarakteriseerde oudercelklonen en bewuste screening om ervoor te zorgen dat essentiële cellulaire kenmerken niet verloren gaan tijdens de aanpassing.

Cistanche tubulosa voorkomt nierziekte, klik hier voor het monster

1. Inleiding

Dierlijke celcultuurtechnologie werd voor het eerst gebruikt voor de productie van virusantigeen bij de productie van vaccins, maar recentelijk zijn ook bacteriële of gistproductieplatforms voor recombinante eiwitten overgeschakeld naar zoogdiercelsystemen [1, 2]. Belangrijk in beide contexten zijn niercellen van babyhamsters (BHK), afgeleid van de Syrische goudhamster (Mesocricetus auratus). Oorspronkelijk waren BHK-cellen een aanhangend groeiende, ankerafhankelijke zoogdiercellijn met een fibroblastgroeipatroon in standaard celkweekomstandigheden, waaronder foetaal runderserum (FBS) [3, 4]. De aanpassing van hechtende BHK-cellen aanoponthoudgroei in serumvrije media in combinatie met grootschalige kweekomstandigheden is een succesverhaal voor de productie van recombinante eiwitten (bijv. factor VIII) met hoge opbrengsten [1, 2]. Bovendien zijn BHK-cellen vatbaar voor een breed scala aan virussen, waaronder het virus van mond- en klauwzeer (MKZ) [5]. Om aan de toenemende vraag naar MKZ-vaccins in veel delen van de wereld te voldoen, moeten grote hoeveelheden antigeen zo goedkoop mogelijk worden geproduceerd, wat haalbaar is door de dichtheid van levensvatbare cellen aan de cellulaire kant te vergroten en de kosten te verlagen door vereenvoudiging van de up- en downstream-verwerking van het antigeen aan de productiekant [6]. Animal-component-free media (ACFM) verminderen het risico op besmetting door onvoorziene middelen en vereenvoudigen bovendien het proces wanneer er geen serum hoeft te worden aangevuld [6, 7]. De aanpassing van cellen om te groeien in suspensie zonder serum en in ACFM is echter een tijdrovend en geleidelijk proces [6, 8]. BHK-cellen bereiken gemakkelijk celdichtheden van 3,5 x 106 cellen/ml in suspensie, maar de aanpassing brengt altijd het risico met zich mee dat ongewenste celeigenschappen evolueren in vergelijking met de startpopulatie die kunnen resulteren in slechte groeiprestaties, onvoldoende celspecifieke opbrengsten of tumorverwekkende activa [5, 7]. Veranderingen in de cellen kunnen op hun beurt leiden tot onverwachte virusvarianten tijdens het culturele aanpassingsproces. Vooral voor de productie van vaccinantigeen is een verandering in viruskenmerken en antigeniciteit hoogst ongewenst. BHK-cellen verschillen al in hun gevoeligheid en hun mogelijkheid om bepaalde virusstammen van MKZV te vermeerderen [9]. Het is duidelijk dat de verandering van verankeringsafhankelijke fibroblastische groei via aggregatie en vorming van sferoïden naar cellen die onafhankelijk in suspensie groeien, gepaard zal gaan met significante veranderingen in de cel zelf [4, 6]. Het verlies van integrinesignalering als gevolg van de onderbreking van extracellulair matrix-celcontact leidt tot veranderingen in membraaneiwitexpressie en in de organisatie van het actine-cytoskelet, dat een belangrijke ontvanger is van integrine-gemedieerde signalering [6, 10]. Tegelijkertijd spelen deze integrines een belangrijke rol bij MKZ-infectie omdat ze de receptor voor MKZ in de natuurlijke gastheer en de primaire receptor in celcultuur [11].

Een meer diepgaand begrip van de cellulaire verschillen tussen aanhangend groeiende HK-cellen en cellen inoponthoudzal nieuwe mogelijkheden voor celengineering openen en de selectie van geschikte celklonen voor de productie van vaccinantigeen vereenvoudigen.

In deze studie, hechtend groeiende BHK-cellen en ACFM-aangepastoponthoudBHK-cellen werden onderzocht met betrekking tot de expressie van cellulaire receptoren zoals integrines en heparansulfaten (HS), hun vermogen om eiwitten op het celoppervlak te presenteren en de organisatie van het cellulaire actineskelet. Transcriptoomanalyses en groeikinetiek geven informatie over de diversiteit van de geteste BHK-cellijnen.

cistanche kan de nieren voeden en de nierfunctie verbeteren

2. materialen en methoden

2.1 Cellijnen en celcultuur

De belangrijkste gebruikte cellijnen waren twee hechtende BHK-21 kloon 13-derivaten (van American Type Culture Collection [ATCC] CCL-10, gehouden als CCLV-RIE 164 en 179 in de Collection of Cell Lines in Veterinary Medicine , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Duitsland; kortweg: BHK164 of BHK179) en deoponthoudcellijnen BHK21C13-2P (BHK-2P) geleverd door de European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC; 84111301) en BHK-InVitrus (BHK-InV, ook wel "lijn #8" genoemd) zoals in onze eerdere publicatie [12]; Sigma-Aldrich, St. Louis, VS).

Voor de groeikinetiek werden daarnaast de volgende cellijnen gebruikt: BHK-2P gehandhaafd in Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) met 10 procent FBS ("lijn #2") of aangepast aan de ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) in twee verschillende processen (lijnen #4 en #5), plus vier andereoponthoudcellijnen: BHK21C13 aangepast aan groei inoponthouddoor de geleidelijke onttrekking van serum (lijn #3), BHK21-C (lijn #6), BHK21-Hektor (lijn #7) en productie BHK (lijn #9) [12]. Al deze cellen werden geleverd door Merck KGaA.

Alle BHK-21-cellen die in het onderzoek zijn gebruikt, zijn uiteindelijk afgeleid van de BHK-21-kloon 13-cellijn van Macpherson en Stoker [13]. De term "cellijn" wordt losjes gebruikt; niet alle elf BHK-21-lijnen die in de huidige studie zijn beschreven, zijn echt verschillende cellijnen in plaats van derivaten die onder verschillende omstandigheden zijn gekweekt. Voor een betere referentie is de nummering van de regels consistent gehouden met de nummering in onze vorige publicatie [12].

Cellijn #1 uit de vorige publicatie was niet opgenomen in de huidige studie en dit nummer wordt daarom niet gebruikt. In plaats daarvan is elke verwijzing naar BHK-2P-cellen die de regelnummers #2, #4 of #5 niet vermelden, naar de hoofdsomoponthoudcellijn BHK21C13-2P (ECACC84111301) geïntroduceerd aan het begin van deze sectie.

De aanhangende Chinese hamster (Cricetulus griseus) ovarium (CHO) cellijnen CHO-K1 (ATCCCCL-61, gehouden als CCLV-RIE 134) en CHO677 (CRL 2244, gehouden als CCLV-RIE 1524) evenals IB-RS -2 cellen (Instituto Biolo´gico-Rim Suı´no-2, gehouden als CCLV-RIE 103) en Madin-Darby runderniercellen (kortweg: MDBK, gehouden als CCLV-RIE261) werden gebruikt als controles in flowcytometrie-experimenten.

De kweekomstandigheden waren 37 ˚C, 5 procent CO2 en vooroponthoudcellen 320 rpm in TubeSpin-bioreactoren (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Zwitserland) bij 80 procent relatieve vochtigheid. Alle hechtende cellijnen werden gekweekt in Minimum Essential Medium Eagle (MEM) aangevuld met Hanks' en Earle's zouten (Sigma-Aldrich) met 10 procent FBS. Alle suspensiecellijnen werden aangepast om te groeien in CellventoTM BHK200-medium (Merck KGaA) behalve cellijn #2, die werd gekweekt zoals hierboven beschreven.

Metingen van celdichtheid en levensvatbaarheid werden uitgevoerd met behulp van trypanblauw (Bio-Rad, Hercules, CA, VS) en een automatische celteller (model TC20, Bio-Rad).

2.2 Analyse van de groeicurve van suspensiecellen

Analyses van de groeicurve werden uitgevoerd als batch-experimenten, uitgevoerd in duplo, twee keer afzonderlijk, met een zaaidichtheid van 0,6 x 106 cellen/ml. Levensvatbare celdichtheid (VCD) en levensvatbaarheid in procenten werden dagelijks gemeten tot zes dagen na celinoculatie.

De celspecifieke berekeningen werden uitgevoerd volgens de vergelijkingen gegeven door [14]:

X: VCD (per ml); t: tijdstippen van bemonstering (uur); n en n-1: twee opeenvolgende bemonsteringspunten.

Celdelingsnummer (cd):

2.3 Flowcytometrie

Flowcytometrische analyses werden uitgevoerd met behulp van het flowcytometrie-instrument FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, VK). Celresten werden naar buiten geleid op basis van de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingspatronen. Voor actinekleuring werd de mediane fluorescentie-intensiteit in het Alexa 488-kanaal direct gemeten. Voor alle antilichaamvlekken werd het percentage Alexa 488- of PE-positieve cellen bepaald met een intervalpoort waarvan de ondergrens werd ingesteld op basis van een isotypecontrole. Alle experimenten werden drie keer onafhankelijk uitgevoerd.

2.3.1 Antilichaamkleuring van cellulaire oppervlaktereceptoren.

oppervlak. MDBK-cellen dienden als een positieve controle voor de expressie van v 3, IB-RS-2-cellen dienden als een positieve controle voor de expressie van v 8 en CHO-K1-cellen dienden als een positieve controle voor de expressie van HS . CHO677-cellen brengen geen van de geteste integrines of HS tot expressie en dienden daarom als een negatieve controle in alle experimenten. De volgende antilichamen werden gebruikt: voor v 3, PE-geconjugeerde kloon LM609 (verdunning 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); voor v 8, primair antilichaam 11E8, kloon 68, muis IgG2a (verdunning 1:100) (vriendelijk geleverd door Dr. Stephen Nishimura) met secundair antilichaam geit anti-muis IgG2a (verdunning 1:1000) geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ); voor HS, kloon 10E4, muis IgM (verdunning 1:200) (Amsbio, Abingdon, VK) met secundair antilichaam geit anti-muis IgM mu-keten (verdunning 1:2000) geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Cambridge, VK) . In elk experiment werd slechts één primair antilichaam gebruikt.

Suspensiecellen werden gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Hechtende cellen werden losgemaakt met behulp van 10 mM EDTA in PBS en vervolgens gewassen met PBS. Na het wassen werden de cellen gefilterd door een celzeef (nylon mesh, 7 0 μm poriediameter, VWR, Radnor, VS) om celklonten te verwijderen en werden ze aangepast tot 1 x 106 cellen / ml vóór 1 μL LIVE / DEAD FixableViolet dode celkleuring (Thermo Fisher Scientific) werd gedurende 30 minuten toegevoegd aan 1 ml celsuspensie. Deze stap en alle volgende stappen werden beschermd tegen licht en bij 4 ˚C uitgevoerd. Het primaire antilichaam werd 30 minuten geïncubeerd en het secundaire antilichaam werd 20-30 minuten geïncubeerd. Na alle stappen werd een wasstap met 2 ml FACS-buffer (PBS, 0,1 procent natriumazide, 0,1 procent BSA) en centrifugeren bij 300 x g, 5 min, 4 ˚C uitgevoerd. Ten slotte werden de gekleurde cellen opnieuw gesuspendeerd in 300 L FACS-buffer.

2.3.2 Actinekleuring.

Filamenteuze actine werd gekleurd met Phalloidin-iFluor 488 Reagent (ab176753, Abcam), bereid volgens de datasheet. BHK179, BHK-2P en BHK-InV-cellen werden losgemaakt zoals hierboven beschreven en gefixeerd met 4 procent formaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT). Cellen werden tweemaal gewassen met PBS en 1 x 106 gefixeerde cellen werden permeabel gemaakt met 0, 1 procent Triton X -100 (Sigma-Aldrich) in PBS, gevolgd door incubatie bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten. Cellen werden tweemaal gewassen met PBS (centrifugatie bij 300 x g, 5 min) voordat de bereide phalloidin-voorraadoplossing werd toegevoegd, 1:1000 verdund in FACS-buffer en 20 min bij RT geïncubeerd. Ten slotte werden cellen tweemaal gewassen met FACS-buffer en opnieuw gesuspendeerd in een FACS-buffer van 300 L. Gekleurde cellen werden direct geanalyseerd met een fluorescentiemicroscoop en gebruikt voor FACS-analyse.

2.3.3 Transfectie-experimenten.

BHK164- en BHK-2P-cellen werden getransfecteerd met ofwel EGFP-N1, een plasmide dat Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) (Clontech) tot expressie brengt, of in een andere reeks experimenten met pVSV-G, een plasmide dat het G-eiwit van vesiculaire stomatitis Indiana-virus (VSV), met behulp van Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, 2 ug plasmide-DNA en 1,875 L of 3,75 Lof lipofectamine verdund in CellventoTM BHK200-medium werden gemengd en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd om complexvorming mogelijk te maken. Daarna werden deze mengsels overgebracht naar cellen in 12-putjesplaten (ongeveer 4 x 105 cellen/ml) en het medium werd toegevoegd tot 200 μL. De cellen werden 24 uur bij 37 C geïncubeerd.

Voor FACS-analyse werd de volledige inhoud van de putjes na 24 uur geoogst. De met pEGFP getransfecteerde cellen werden driemaal gewassen met PBS en werden opnieuw gesuspendeerd in een 300 L FACS-buffer. Eén duplicaat van met pVSV-G getransfecteerde cellen werd gepermeabiliseerd met PBS met 0,1 procent (v/v) TritonX-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur voorafgaand aan antilichaamkleuring, terwijl de andere niet-permeabel bleef. Antilichaamkleuring werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven met polyklonaal konijnenserum VSV 274/E (verdunning 1:500, vriendelijk geleverd door Dr. Stefan Finke) en secundair antilichaam geit anti-konijn (H plus L) geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (verdunning 1: 1000; Thermo Fisher Scientific).

2.4 Statistische analyse

De gegevens zijn geanalyseerd met GraphPad Prism versie 07.04 voor Windows (GraphPad Software, La Jolla, VS). Gewone eenrichtingsanalyse van variantie werd gedaan met Tukey's post-hottest om verschillen tussen behandelingsgroepen te evalueren. De drempel voor statistische significantie werd gesteld op een p-waarde van 0,001.

2.5 Transcriptoomanalyse

2.5.1 RNA-extractie, bibliotheekvoorbereiding en sequencing.

Drie onafhankelijke batches van elk van de hechtende BHK179-cellijnen en de BHK-2P- en BHK-InV-suspensiecellijnen werden gebruikt voor transcriptoomanalyse. Gemiddeld werden 8,3 x 105 BHK179-cellen, 1,6 x 107 BHK-2P-cellen en 1,4 x 107 BHK-InV-cellen gelyseerd in TRIzol-reagens (Thermo Fisher Scientific). Na toevoeging van 0,2 volumes trichloormethaan aan het cellysaat, incubatie en centrifugatie, werd de waterige fase verzameld en gemengd met één volume 100% ethanol. Hieruit werd totaal RNA geëxtraheerd met behulp van de RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) met DNase-digestie op de kolom met de RNase-Free DNase Set (Qiagen) volgens de instructies van de fabrikant. De ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) werd toegevoegd en gebruikt als interne controle voor alle volgende stappen. Vervolgens werd gepolyadenyleerd mRNA geïsoleerd uit 1-3 ug hoogwaardig totaal RNA met behulp van de Dynabeads mRNA DIRECT Micro-kit (ThermoFisher Scientific). Het mRNA werd vervolgens gefragmenteerd en gebruikt voor cDNA-synthese en bibliotheekbereiding met behulp van de TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Sequentiebepaling werd uitgevoerd in het Heinrich-Pette-Institut, Hamburg, met behulp van NextSeq 500 (2x75 bp) en HiSeq 4000 (1x50 bp) apparatuur (Illumina).

2.5.2 Statistische analyse van differentiële genexpressie.

Een kwaliteitscontrole van de onbewerkte uitlezingen van elke sequencingbibliotheek werd uitgevoerd met behulp van FastQC (versie {{0}}.11.9; Babraham Institute, Cambridge, VK) met de nadruk op de verdeling van de leeslengte en adapterbesmetting voor en na de adapter trimmen met Trim Galore (versie 0.6.4_dev, Babraham Institute) en Cutadapt (versie 2.10) [15]. Met behulp van Zalm [16] werden de bijgesneden onbewerkte waarden vervolgens quasi toegewezen aan het genoom van de Syrische goudhamster.

Kortom, de genomische en transcriptreferenties van GCF{{0}}.1_MesAur1.0 werden verkregen van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) en gecombineerd met referentiesequenties van de ERCC spike- bij controles. Een lokvogel-bewuste transcriptoomindex [17] werd geconstrueerd om selectieve uitlijning met zalm mogelijk te maken. Voor kwantificering werden tien bootstrap-replica's gebruikt en werd compensatie voor sequentiespecifieke biases, GC-biases en 5'- of 3'-positionele bias ingeschakeld.

Vervolgens werden de kwantificeringsgegevens voor de ERCC-spike-in-controles gecorreleerd aan hun theoretische concentratie, om problemen tijdens de monstervoorbereiding te detecteren.

Bovendien werden de genspecifieke kwantificatiegegevens aanvankelijk gefilterd (alleen genen die voorkomen in meer dan één replica met meer dan 15 tellingen), genormaliseerd met behulp van geregulariseerde logtransformatie (rlog) en gebruikt voor exploratieve gegevensanalyse, bijvoorbeeld met PCA. Differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd en vervolgens gebruikt voor routeanalyse met behulp van DESeq2 [18]. De expressiegegevens werden geanalyseerd op significant differentieel tot expressie gebrachte genen tussen de cellijnparen BHK-2P en BHK179, BHK-InV en BHK-2P, en BHK-InV en BHK179. Vervolgens werd de resulterende binaire logaritmische (log2) vouwverandering aangepast met behulp van de functies "lfcShrink" en "apglm" in DESeq2 om te compenseren voor lage of variabele leestellingen die kunnen leiden tot overschatting van variantie [19].

De criteria voor een significant verschillend tot expressie gebracht gen waren ingesteld op een maximale aangepaste waarde van {{0}}.05 en een minimale absolute waarde van de gekrompen log2-voudige verandering van 1. Pathway en The criteria voor een significant verschillend tot expressie gebracht gen werden ingesteld op een maximale aangepaste waarde van 0,05 en een minimale absolute waarde van de gekrompen log2-voudige verandering van 1. Pathway- en verrijkingsanalyse werd uitgevoerd met behulp van de functie "verrijken" in clusterprofiel (versie 3.16.0).

cistanche kan de nieren voeden en de nierfunctie verbeteren

3. Resultaten

3.1 De gevoeligheid van een cellijn voor MKZV is onafhankelijk van de individuele groeisnelheid en het aantal celdelingen

Batch-experimenten met negen verschillende BHK-suspensiecellijnen werden uitgevoerd over een periode van zes dagen en de dichtheid van levensvatbare cellen (VCD) en levensvatbaarheid werden dagelijks gemeten. Op basis van eerdere waarnemingen dat de cellijnen verschilden in vatbaarheid voor MKZ-serotype Azië{{0}} [12], is onderzocht of een verhoogd cellulair metabolisme en groeitempo samenhangt met een verminderde vatbaarheid voor infectie met dit virus (tabel 1). Twee van de drie gevoelige BHK-suspensiecellijnen zijn langzaam groeiende cellen met kleine celdelingsgetallen (cd) van 0,60 (#3) en 0,70 (#9), terwijl de derde gevoelige cellijn (#8) de hoogste groeisnelheid en cd (μ=0.035, cd=1.62) van alle geteste cellijnen.

De onttrekking van serum en aanpassing aan groei in ACFM had geen effect op de gevoeligheid voor MKZ in onze reeks onderzochte cellijnen. Cellijn #2 is de langzaam groeiende, serumafhankelijke voorloper van de BHK-2P-cellijnen, in suspensie gehouden met GMEM met foetaal runderserum. Tijdens de aanpassing aan groei in ACFM werden de cellen geselecteerd op hoge VCD, gekoppeld aan een hoge groeisnelheid en cd. Net als de belangrijkste BHK-2P-cellijn die voor het onderzoek werd gebruikt, zijn cellijnen #4 en #5 ook afgeleid van cellijn #2, maar verschillen ze in de wijze van aanpassing aan ACFM. Alle BHK-2P-cellijnen die in ACFM werden gehandhaafd, vertoonden een zeer vergelijkbaar groeiprofiel. Gevoeligheid voor MKZ-serotype Azië-1 werd door geen van deze cellijnen verkregen tijdens de aanpassing aan ACFM, waarschijnlijk omdat de oorspronkelijke lijn #2 al resistent was geweest. Evenzo werd geen verandering in gevoeligheid waargenomen voor suspensiecellijn #3. Bij een aanhankelijke groei (vgl. cellijn #1 in [12]) waren de cellen vatbaar voor MKZ-Azië-1 en behielden ze deze eigenschap tijdens de aanpassing aan de groei in suspensie. Tegelijkertijd kregen ze niet het snelle groeiprofiel van andere suspensiecellen.

3.2 Suspensiecellen vertonen minder primaire receptoren maar meer secundaire receptoren voor MKZ op hun oppervlak dan hechtende BHK-cellen

De eerste stap voor een virus om een ​​cel met succes te infecteren, is de binding van het virale deeltje aan receptormoleculen op het celoppervlak. Om de verschillen tussen aanhangend groeiende BHK-cellen en BHK-cellen in suspensie te analyseren, werden antilichamen tegen cellulaire receptoren getest die betrokken zijn bij de extracellulaire matrixinteractie en waarvan bekend is dat ze een belangrijke rol spelen bij MKZ-infectie. Integrines v 3 en v 8 werden onderzocht als representatieve celreceptoren die het RGD (Arg-Gly-Asp) bindingsmotief herkennen en interageren met serumcomponenten en de extracellulaire matrix, maar worden ook door FMDV gebruikt als zijn natuurlijke primaire receptoren. Geen van de geteste suspensiecellijnen (BHK-InV en BHK-2P) brachten integrine v3 of v8 tot expressie op het celoppervlak. Hoewel het verschil tussen hechtend BHK en suspensie BHK niet significant was voor integrine v 8 (Fig 1b), bracht een significant hoger percentage hechtend BHK179 integrine v 3 tot expressie in vergelijking met de suspensiecellijnen BHK-InV en BHK-2P ( Afb. 1a).

Grote hoeveelheden HS werden gepresenteerd op het oppervlak van beide suspensiecellijnen. De expressie van HS was zeer uiteenlopend tussen de replicaatculturen van hechtende BHK179-cellen. Vergeleken met de suspensiecellijnen waren minder cellen in de BHK179-culturen HS-positief, hoewel het verschil niet significant was op het vooraf bepaalde significantieniveau (figuur 2).

Kleuring en microscopische analyse onthulden grote verschillen in de rangschikking van het actine-cytoskelet tussen hechtende en suspensiecellen (figuur 3). De actinefilamenten in de hechtende BHK179-cellen zijn uniform verdeeld over de hele cel in een fijn reticulair patroon (Figuur 3a), terwijl cellen die in suspensie groeiden diffuse actinekleuring hadden (Figuur 3b). Interessant genoeg was de hoeveelheid filamenteus actine verschillend tussen de suspensiecellijnen BHK-InV en BHK-2P. De mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) na phalloïdinekleuring was significant hoger in BHK-InV-cellen in vergelijking met BHK -2P, wat wijst op een hoger filamenteus actinegehalte in deze cellen (Fig 3c).

3.3 Suspensiecellen verschillen in transfectie-efficiëntie, maar niet in hun vermogen om oppervlakte-eiwitten weer te geven

Vanwege de verschillen in actineconformatie tussen hechtende en suspensiecellen, werden de cellen onderzocht op hun overdraagbaarheid en het vermogen om eiwitten op hun oppervlak te presenteren. In het algemeen is de transfectie-efficiëntie, gemeten door de expressie van EGFP, verminderd in suspensiecellen (figuur 4a). Bij gebruik van een lage dosis van het transfectiereagens, bracht een significant hoger percentage hechtende cellen EGFP tot expressie in vergelijking met de suspensiecellen. Wanneer een hoge dosis transfectiereagens werd gebruikt, werd een hoger percentage suspensiecellen met succes getransfecteerd, hoewel het verschil tussen hoge en lage doses niet significant was. Om de vraag te beantwoorden of suspensiecellen nog steeds eiwitten zoals cellulaire receptoren op hun oppervlak kunnen presenteren, werden cellen getransfecteerd met een plasmide dat codeert voor het VSV G-eiwit (Figuur 4b). Eén reeks cellen werd voorafgaand aan de kleuring gepermeabiliseerd om rekening te houden met de mogelijkheid dat het G-eiwit tot expressie werd gebracht maar niet op het celoppervlak werd vertoond. Er was geen significant verschil in het vermogen om het VSV G-eiwit tot expressie te brengen en te presenteren tussen hechtende en suspensiecellen, noch bij gebruik van een lage of een hoge dosis transfectiereagens.

3.4 Transcriptoomanalyse onthult verschillen in de expressie van genen gerelateerd aan de extracellulaire matrix tussen suspensiecellen

Een transcriptoomanalyse werd uitgevoerd om de verschillen tussen aanhangend groeiende BHK-cellen en BHK-cellen in suspensie verder te onderzoeken en om op te helderen waarom suspensiecellen verschillen in hun gevoeligheid voor MKZ. Een hechtende BHK-cellijn (BHK179) gekweekt in MEM aangevuld met FBS, evenals een snelgroeiende FMDV-gevoelige cellijn (BHK-InV) en een snelgroeiende resistente cellijn (BHK-2P), beide aangepast aan ACFM, werden gekozen voor de analyse.

Een hoofdcomponentenanalyse (PCA) benadrukte de nauwe relatie tussen de biologische replica's van de individuele cellijnen (figuur 5a). Alle replica's van dezelfde cellijn bevinden zich dicht bij elkaar in de plot met weinig indicatie van batch-to-batch-effecten. De eerste hoofdcomponent (goed voor 81 procent van de variantie in de genormaliseerde dataset) werd geïnterpreteerd als het transcriptionele verschil tussen cellen die in suspensie groeien en cellen die groeien in therapietrouw, terwijl de tweede hoofdcomponent (15 procent van de variantie) het verschil vertegenwoordigde tussen de suspensiecellijnen BHK-2P en BHK-InV, mogelijk geassocieerd met gevoeligheid voor MKZ-infectie. Samen waren de eerste twee hoofdcomponenten in staat om 96 procent van de gevonden variantie in de dataset te verklaren, wat aangeeft dat de transcriptoomanalyse relevante verschillen tussen de drie cellijnen identificeerde.

Het kleinste aantal differentieel tot expressie gebrachte genen werd gevonden bij het vergelijken van BHK-InV met BHK-2P (590 opwaarts gereguleerd; 304 neerwaarts gereguleerd). Vergelijkbare aantallen werden gezien bij de vergelijking van BHK -2 P of BHK-InV afzonderlijk met BHK179 (respectievelijk 1527 en 1519 opwaarts gereguleerd; 1308 en 943 neerwaarts gereguleerd) (figuur 5b). Wanneer de twee suspensiecellijnen (BHK-InV en BHK-2P) werden gecombineerd en vergeleken met de hechtende BHK179-cellijn, werden 1814 genen differentieel tot expressie gebracht. Terwijl 411 genen exclusief verschillend tot expressie worden gebracht bij het vergelijken van BHK179 met BHK-InV, worden bijna twee keer zoveel (701 genen) exclusief verschillend tot expressie gebracht tussen BHK179 en BHK-2P. Tussen de twee suspensiecellijnen werden slechts 104 genen exclusief verschillend tot expressie gebracht.

Bij het vergelijken van de set van differentieel tot expressie gebrachte genen van de MKZ-gevoelige cellijnen BHK179 en BHK-InV met de MKZ-resistente cellijn BHK-2P, bleek een subset van 553 genen in beide vergelijkingen verschillend tot expressie te komen ( Afb. 5c). Omdat deze genen mogelijk betrokken zijn bij MKZ-gevoeligheid, werd een GO-term-verrijkingsanalyse uitgevoerd en onthulde dat veel van deze genen gerelateerd zijn aan de cellulaire componenten van de extracellulaire matrix (ECM), celmembranen en cel-celverbindingen (Fig 5d) .

Omdat we verschillen tussen de cellijnen met betrekking tot ECM-interacties hebben waargenomen, werd het transcriptoom opnieuw geanalyseerd met een focus op de expressie van integrines v 1, v 3, v 6, v 8, evenals actine, allemaal mogelijk relevant voor gevoeligheid voor FMDV-infectie (Afb. 5e). Met uitzondering van ACTA2 was er geen significant verschil in de expressie van actine-gerelateerde genen tussen BHK-InV- en BHK-2P-cellen op mRNA-niveau. De genormaliseerde gentellingen voor alle onderzochte actine-gerelateerde genen waren significant hoger in de hechtende cellijn BHK179 dan in de suspensiecellijnen (S1 Fig).

Alle drie de cellijnen brachten vergelijkbare hoeveelheden ITGAV-transcripten tot expressie, coderend voor integrine-subeenheid v, maar vertoonden differentiële expressie voor de integrine-subeenheden. In detail brachten de suspensiecellijnen BHK-2P en BHK-InV significant minder ITGB1, ITGB3 en ITGB6 tot expressie in vergelijking met de hechtende cellijn BHK179. ITGB3 en ITGB8 werden significant differentieel tot expressie gebracht tussen de suspensiecellijnen BHK-2P en BHK-InV. Interessant is dat ITGB8 het enige coderende gen voor de integrine-subeenheid was dat in hoge mate tot overexpressie werd gebracht in zowel FMDV-gevoelige cellijnen BHK179 als BHK-InV in vergelijking met de FMDV-resistente cellijn BHK -2 P (Fig 5e).

cistanche kan de nieren voeden en de nierfunctie verbeteren

4. Discussie

De aanpassing van cellen om te groeien in suspensie en in serumvrije media is een tijdrovend en geleidelijk maar noodzakelijk proces in de biotechnologie om hoogproductieve cellijnen te genereren die worden gebruikt om antilichamen, vaccinantigenen of andere eiwitten te produceren [1, 8 ]. Dit proces is inderdaad altijd beladen met het risico dat cellen ongewenste eigenschappen krijgen in vergelijking met het oorspronkelijke celmateriaal [7]. Bij de productie van vaccinantigeen is de gevoeligheid van de cellijn voor het doelvirus van groot belang. Voor het mond- en klauwzeervirus (MKZV) is het een bekend fenomeen dat bepaalde BHK-cellijnen resistent zijn tegen infectie of hun gevoeligheid verliezen tijdens herhaalde subkweek [20-22]. Bovendien kunnen de antigene eigenschappen van het virus variëren, afhankelijk van de gastheercel [9].

Suspensiecellen groeien onafhankelijk van een oppervlak en worden verzwolgen door zuurstofrijke voedingsmedia, waardoor ze snel kunnen groeien. De snelle vermenigvuldiging van cellen is een vereiste functie om de cultuur gemakkelijk en in korte tijd op te schalen naar grote volumes. Het verwijderen van serum uit het medium is nodig om de kosten, het risico op contaminatie te verlagen en om downscale processen te vereenvoudigen [23, 24].

Batchgroeianalyse van verschillende BHK-suspensiecellijnen was bedoeld om te bepalen of de selectie op een snelgroeiende celpopulatie in serumvrije omstandigheden schadelijk is voor de verspreiding van MKZ. In feite groeiden twee van de drie gevoelige cellijnen langzaam, maar hun gevoeligheid voor MKZV bleek onafhankelijk te zijn van hun groeimetabolisme. Het is waarschijnlijker dat MKZ-gevoeligheid al verloren gaat (of behouden blijft) tijdens de initiële aanpassing aan groei in suspensie. Het losraken van de cellen van het oppervlak en de onttrekking van serum in de volgende stappen van aanpassing aan suspensiegroei leidt tot veranderingen in het expressieniveau van oppervlakte-eiwitten en eiwitten die betrokken zijn bij het cytoskelet [7].

Integrines zijn een belangrijke familie van celoppervlakreceptoren die in het celmembraan zijn geïntegreerd en cel-naar-cel signalering bemiddelen, evenals een sterke verbinding tussen de cel en het oppervlak door de binding van extracellulaire matrix (ECM) componenten [10, 25 ]. Regeling van de celcyclus, organisatie van het cytoskelet en de translocatie van ontluikende receptormoleculen naar het celmembraan zijn afhankelijk van integrines [25]. Voor veel integrines wordt de binding van de ECM, evenals de binding van liganden die aan de cellen worden geleverd door de toevoeging van serum aan het kweekmedium, gemedieerd door het RGD-motief [6, 25] en het zal waarschijnlijk veranderen wanneer de cel schakelt over van hechtende naar suspensiegroei. De herkenning van het RGD-motief door integrines wordt ook door FMDV gebruikt om receptor-gemedieerde endocytose van het virusdeeltje te initiëren [26]. Het RGD-motief in VP1 van FMDV is sterk geconserveerd [27], en de integrines v 1, v 3, v 6 en v 8 zijn bekende receptoren die in vivo en in vitro door FMDV worden gebruikt [28-31]. Omdat de vermoedelijke verschillen in het celoppervlakproteoom tussen hechtende en suspensiecellen ook cruciaal kunnen zijn voor de verschillen in gevoeligheid voor MKZ-infectie, werden antilichamen die binden aan de integrine v 3 en v 8 gebruikt om een ​​hechtende BHK-cellijn te kleuren, evenals een gevoelige en resistente BHK-cellijn. Er werd geen v6-kleuring uitgevoerd omdat eerder is aangetoond dat dit integrine niet tot expressie wordt gebracht op het oppervlak van BHK-cellen [32], hoewel ITGB6-mRNA wel detecteerbaar is. Evenzo, ondanks het hoge niveau van ITGB8-mRNA-expressie gedetecteerd in BHK179- en BHK-InV-cellen, lijkt v8-integrine in het algemeen niet op het oppervlak van BHK-cellen te worden gepresenteerd. Integrine v 3 werd in mindere mate gevonden op de hechtende cellijn, maar niet op de suspensiecellijnen.

Afgezien van integrines, kunnen ligandbinding, internalisatiegebeurtenissen en intracellulaire signalering worden gemedieerd door heparansulfaat (HS) proteoglycanen [33] en de verwerving van HS als secundaire receptor wordt vaak waargenomen na herhaalde passage van FMDV in kweek [34]. Specifieke antilichaamkleuring onthulde overvloedig HS op beide suspensiecellijnen en in mindere mate ook op de hechtende BHK-cellen. Van mutaties in het genoom van MKZ, die leiden tot veranderingen in de virale capside-eiwitten om het gebruik van HS als receptor mogelijk te maken, is bekend dat ze het virus in de natuurlijke gastheer verzwakken [35]. De beschikbaarheid van HS kan daarom een ​​cruciale factor zijn voor veranderde antigeniciteit van MKZ-onafhankelijkheid van de cellijn waaraan het virus is aangepast.

Omdat cellulaire loslating verband houdt met veranderingen in het actine-myosine contractiele mechanisme [7] en het kweken van cellen in suspensie andere vereisten voor overleving met zich meebrengt, bijv. weerstand tegen hoge schuifspanning als gevolg van agitatie van de kweekvloeistof [6], is het actineskelet van groot belang in deze studie. Microscopische analyse onthulde een conformationele herschikking van het cytoskelet van een reticulaire verdeling in hechtende groeiende cellen naar een dichte bolvormige structuur in suspensieomstandigheden. Dit kan een aanpassingsmechanisme zijn voor de bovengenoemde hoge schuifspanning en het is ook bekend dat het voorkomt in CHO-cellen onder dezelfde omstandigheden [6]. Maar het is ook opmerkelijk dat hoewel er geen significant verschil was in de expressie van de meeste actinegenen tussen BHK-InV- en BHK-2P-cellen op mRNA-niveau, significant meer filamenteus actine-eiwit werd gedetecteerd in het MKZV-gevoelige BHK -InV dan in de MKZ-resistente BHK-2P. Dit kan worden gekoppeld aan verschillende polymerisatiesnelheden van globulaire actine in filamenteuze actine.

Tenminste in hechtende cellen hangt de invoer van MKZV af van actinedynamiek. Virale binnenkomst induceert actineruches en een verstoring van het actinefilamentnetwerk door de omzetting van filamenteus actine in bolvormig actine is beschreven in het vroege stadium van infectie [36-38]. Afgaande op het cytopathische effect (CPE) dat wordt gezien in hechtende BHK-cellen wanneer geïnfecteerd met FMDV, ondergaat het cytoskelet intensieve herschikkingen in veel van zijn componenten [38]. Dergelijke CPE wordt niet gezien in suspensiecellen vanwege hun reeds bolvormige vorm, maar het verhoogde actinegehalte kan enig voordeel aan het virus geven. Vanwege de verschillen in het actine-cytoskelet werden transfectie-experimenten uitgevoerd om de transfectie-efficiëntie tussen suspensie en hechtend BHK te vergelijken en om te bepalen of het dichte cytoskelet van de suspensiecellen de presentatie van eiwitten op het cellulaire oppervlak belemmert. Het is algemeen bekend dat suspensiecellijnen erg moeilijk te transfecteren zijn, wat wordt veroorzaakt door de verminderde hechting van het transfectiecomplex aan het celmembraan en vervolgens verminderde opname van de DNA-payload [39]. Dit werd ook bevestigd door onze experimenten. Maar hoewel de transfectie-efficiëntie was verminderd in BHK-2P-cellen in vergelijking met de hechtende BHK-cellijn, was er geen verschil in het vermogen om het getransfecteerde VSV G-eiwit op het celoppervlak te vertonen. Er werd een verschil in het percentage gekleurde cellen waargenomen tussen de pEGFP-N1- en pVSV-G-expressieplasmiden in BHK-2P-cellen. Dit werd niet verder onderzocht, maar het kan worden veroorzaakt door een andere detectielimiet tussen de immunofluorescentiekleuring die wordt gebruikt om VSV-G te visualiseren en de aangeboren fluorescentie van EGFP.

Ten slotte werd transcriptoomanalyse uitgevoerd om meer informatie te verkrijgen over de transcriptionele verschillen tussen aanhangende en gesuspendeerde BHK-cellen enerzijds en tussen MKZ-gevoelige en MKZ-resistente BHK-cellijnen anderzijds. Onze resultaten zijn in lijn met andere onderzoeken naar transcriptomische veranderingen in CHO-, MDCK- of HEK-cellen tijdens de overgang van hechtende naar suspensiegroei. Over het algemeen zijn de meeste veranderingen gerelateerd aan de cytoskeletstructuur, cellulair metabolisme en interacties van ECM-componenten en worden ze opgereguleerd voor suspensiecellen [7, 40, 41]. Verrassend genoeg vertoonde de FMDV-resistente BHK-2P-suspensiecel neerwaartse regulatie van deze genensets, wat ook de verminderde actinespiegels in BHK-2P in vergelijking met de BHK-InV-cellen zou kunnen verklaren. Specifieke analyse van expressie van integrine-subeenheid onthulde vergelijkbare niveaus van transcripten van integrine-subeenheid V in alle drie de cellijnen. De hoogste expressie in alle cellijnen werd gevonden voor de integrine-subeenheid 1. Het is belangrijk op te merken dat integrine 1 heterodimeren kan vormen met tien verschillende ketens en constitutief tot expressie wordt gebracht door de meeste zoogdiercellen [6, 42]. Evenzo kan de V-subeenheid een heterodimeer vormen met vijf verschillende ketens, maar 6 en 8 worden alleen in combinatie met V op het celoppervlak gepresenteerd [42]. Dit wordt nauwkeurig weerspiegeld door de waargenomen overvloed aan transcripten van de enkele integrine-subeenheden. De verhoogde transcriptie van 3 in hechtende cellen correleert ook goed met het hogere signaal voor integrine v3 in de antilichaamkleuringsexperimenten. Aan de andere kant werden de waargenomen verschillen in ITGB3- en ITGB8-mRNA-niveaus tussen BHK-2P en BHK-InV niet weerspiegeld in de oppervlaktekleuring. We waren niet in staat om vast te stellen of dit alleen te wijten was aan ongelijke gevoeligheid tussen de mRNA- en eiwitkwantificatiemethoden of indicatief was voor een post-transcriptionele blokkering van eiwitexpressie of oppervlaktepresentatie [43]. Over het algemeen brachten de suspensiecellijnen BHK-2P en BHK-InV significant minder ITGB1-, ITGB3- en ITGB6-mRNA tot expressie in vergelijking met de hechtende cellijn.

5. ConclusiesIn

Concluderend is het van cruciaal belang bij de bereiding van suspensiecellen om een ​​oudercelkloon met bekende kenmerken te gebruiken en om de resulterende celpopulatie zorgvuldig te screenen tijdens het aanpassingsproces om ervoor te zorgen dat de cellijn essentiële kenmerken behoudt, in dit geval , de gevoeligheid voor MKZ. Bovendien moeten moderne methoden zoals FACS-analyse en transcriptomics worden gebruikt voor verdere karakterisering van productiecellijnen.

cistanche kan de nieren voeden en de nierfunctie verbeteren

Dankbetuigingen

We danken Patrick Zitzow voor zijn uitstekende technische ondersteuning.

Bijdragen van auteurs

Conceptualisatie:Veronika Dille, Michael Eschbaumer.

Formele analyse:Veronika Dille, Florian Pfaff.

Financiering acquisitie:Aline Zimmer, Martin Beer.

Onderzoek:Veronika Dille.

Methodologie:Veronika Dille, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Projectadministratie:Martin Beer.Bronnen: Aline Zimmer.

Overzicht:Michaël Eschbaumer.

visualisatie:Veronika Dille, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Schrijven - origineel ontwerp:Veronika Dille.

Schrijven – recensie & redactie:Veronika Dille, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, Michael Eschbaumer.

Referenties

1. Merten OW. Vooruitgang in celcultuur: verankeringsafhankelijkheid. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370 (1661):20140040.

2. Dingermann T. Recombinante therapeutische eiwitten: productieplatforms en uitdagingen. Biotechnologie J.2008; 3(1):90–7.

3. Hernandez R, Brown DT. Groei en onderhoud van niercellen van babyhamsters (BHK). Curr ProtocMicrobiol. 2010; Hoofdstuk 4:Bijlage 4H. mca04hs17 PMID: 20440683

4. Cruz HJ, Moreira JL, Stacey G, Dias EM, Hayes K, Looby D, et al. Aanpassing van BHK-cellen die een recombinant eiwit produceren aan serumvrij medium en eiwitvrij medium. Cytotechnologie. 1998; 26(1):59–64.

5. Guskey LE, Jenkin HM. Aanpassing van BHK-21-cellen aan groei in schudcultuur en daaropvolgende besmetting door het Japanse encefalitisvirus. Appl Microbiol. 1975; 30(3):433–8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.433-438.1975 PMID: 1237269

6. Walther CG, Whitfield R, James DC. Belang van interactie tussen integrine en actine cytoskelet bij suspensieaanpassing van CHO-cellen. Appl Biochem Biotechnol. 2016; 178(7):1286–302.

7. Kluge S, Benndorf D, Genzel Y, Scharfenberg K, Rapp E, Reichl U. Monitoring van veranderingen in proteoom tijdens stapsgewijze aanpassing van een MDCK-cellijn van hechting tot groei in suspensie. Vaccin. 2015; 33(35):4269-80.

8. Costa AR, Withers J, Rodrigues ME, McLoughlin N, Henriques M, Oliveira R, et al. De impact van celaanpassing aan serumvrije omstandigheden op het glycosyleringsprofiel van een monoklonaal antilichaam geproduceerd door eierstokcellen van Chinese hamsters. N Biotechnologie. 2013; 30(5):563-72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12. 002 PMID:23247406

9. Bolwell C, Brown AL, Barnett PV, Campbell RO, Clarke BE, Parry NR, et al. Gastheercelselectie van antigene varianten van mond- en klauwzeervirus. J-gen. Virol. 1989; 70 (Pt 1):45–57.

10. Wiesner S, Legate KR, Fassler R. Integrine-actine-interacties. Cel Mol Leven Sci. 2005; 62(10):1081-99.

11. O'Donnell V, Pacheco JM, Gregg D, Baxt B. Analyse van mond- en klauwzeervirus-integrinereceptorexpressie in weefsels van naïeve en geïnfecteerde runderen. J Comp Pathol. 2009; 141 (2-3): 98-112. PMID: 19515380

12. Dill V, Hoffmann B, Zimmer A, Beer M, Eschbaumer M. Aanpassing van FMDV Azië-1 aan suspensiecultuur: celresistentie wordt overwonnen door veranderingen in viruscapside. Virussen. 2017; 9(8). https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID:28820470

13. Macpherson I, Stoker M. Polyoma-transformatie van hamstercelklonen - een onderzoek naar genetische factoren die de celcompetentie beïnvloeden. Virologie. 1962; 16:147-51.

14. Rourou S, van der Ark A, van der Velden T, Kallel H. Een microcarrier-celkweekproces voor het vermeerderen van rabiësvirus in Vero-cellen gekweekt in een geroerde bioreactor onder volledig dierlijke componentvrije omstandigheden. Vaccin. 2007; 25(19):3879-89.

15. Martin M. Cutadapt verwijdert adaptersequenties uit sequentielezingen met hoge doorvoer. EMBnetjournaal. 2011; 17:10-2.

16. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Salmon biedt snelle en vooringenomenheidsbewuste kwantificering van transcriptieexpressie. Nat methoden. 2017; 14(4):417–9.

17. Srivastava A, Malik L, Sarkar H, Zakeri M, Almodaresi F, Soneson C, et al. Uitlijnings- en mappingmethodologie beïnvloeden de schatting van de overvloed aan transcripten. Genoom Biol. 2020; 21(1):239.

18. Love MI, Huber W, Anders S. Gemodereerde schatting van vouwverandering en dispersie voor RNA-seq-gegevens met DESeq2. Genoom Biol. 2014; 15 (12):550.

19. Zhu A, Ibrahim JG, Love MI. Zware eerdere distributies voor sequentietellingsgegevens: het verwijderen van de ruis en het behouden van grote verschillen. Bio-informatica. 2019; 35 (12): 2084–92.

20. Clarke JB, Spier RE. Variatie in de gevoeligheid van BHK-populaties en gekloonde cellijnen voor drie stammen van het mond- en klauwzeervirus. Boog Virol. 1980; 63(1):1–9.