Vooruitgang in moleculaire identificatie van Cistanche

Abstract:CistanchesHerba, een zeldzaam en waardevol medicinaal materiaal in China, heeft een hoge medicinale waarde en ecologische waarde. Te midden van de vooruitgang van moleculair biologische technieken, is een verscheidenheid aan op DNA gebaseerde moleculaire identificatietechnieken geleidelijk verbeterd en is er grote vooruitgang geboekt in het onderzoek naarCistanchesHerba. Dit artikel bespreekt de op DNA gebaseerde moleculaire identificatietechnieken voorCistancheen bespreekt de beperkingen en toepassingsmogelijkheden, die naar verwachting zullen dienen als referentie voor nauwkeurige identificatie en kwaliteitsevaluatie van de Cistanches Herba, de bescherming en het rationele gebruik van de hulpbronnen en de variëteit van fokken.

Trefwoorden:Cistanche; moleculaire identificatie; moleculaire merkertechniek; de identificatie en kwaliteit; Behoud van hulpbronnen

Klik hier voor meer details over de componenten van Cistanche

Cistanche is de droge schubbladige vlezige stengel van Cistanche deserticola YC Ma enCistanche tubulosa(Schenk) Wight, een plant van het geslachtCistanchebij de familie Cistanche. Jiangyun, Cunyun, Cistanche en Chagangaoya (Mongoolse taal) staan ​​bekend als "woestijnginseng" [2]. In de afgelopen jaren, nu de hulpbronnen van de wilde Cistanche op het punt van uitputting staan ​​en de binnenlandse vraag met de dag toeneemt, is een groot aantal namaakproducten van Cistanche op de markt van Chinese kruidengeneesmiddelen terechtgekomen, wat enorme schommelingen in de marktprijzen heeft veroorzaakt. en de kwaliteit van medicinale materialen kan niet worden gegarandeerd, wat de veiligheid van klinische medicatie ernstig in gevaar brengt. seks [3]. Daarom staan ​​het behoud, het onderzoek en de rationele ontwikkeling en het gebruik van de kiemplasmabronnen van de Cistanche-plant voor de deur, en de nauwkeurige identificatie van de kiemplasmabronnen van de Cistanche-plant is bijzonder belangrijk.

net zo belangrijk. De 2020-editie van de "Farmacopee van de Volksrepubliek China" (hierna "Chinese Farmacopee" genoemd) vermeldt alleen dat de gedroogde, geschubde, vlezige stengels van Cistanche deserticola als echte medicijnen worden gebruikt. Vanuit het perspectief van de situatie zijn er naast de planten Cistanche en Cistanche tubehua opgenomen in de 2020-editie van de "Chinese Farmacopee", ook Cistanche sinensis G. Beck, C. salsa (CA Mey.) G. Beck, Lanzhou Cistanche C. lanzhouensis ZY Zhang, etc. [4], er zijn ook een groot aantal nagemaakte dopingverschijnselen. Met de ontwikkeling en voortdurende verbetering van moleculaire biologietechnologie, heeft moleculaire identificatietechnologie de voordelen van minder monsterverbruik, hoge snelheid en hoge nauwkeurigheid, en wordt het veel gebruikt bij de soortidentificatie van dieren en planten. De ontwikkeling van onderzoek naar resource mining gaat ook relatief snel [5]. Momenteel is er enige vooruitgang geboekt bij de identificatie van medicinale materialen van Cistanche door middel van moleculaire identificatietechnologie. Volgens de classificatie van moleculaire markertechnologie die vereist is voor moleculaire identificatie [6], bespreekt dit artikel de kiemplasma-identificatie van Cistanche deserticola en andere aspecten, en bespreekt het bestaan ​​van kiemplasma-identificatie van Cistanche deserticola. Analyseer de problemen en stel bijbehorende oplossingen voor, met als doel een referentie te bieden voor de bescherming, het rationele gebruik en de teelt van nieuwe variëteiten van Cistanche-planten.

1 Toepassing van DNA-barcoderingstechnologie bij de identificatie van Cistanche-planten

1.1 DNA-barcoderingstechnologie

In 2003 introduceerde professor Paul Hebert van de Universiteit van Guelph in Canada streepjescodetechnologie in de biologische wereld en stelde voor het eerst het concept van "DNA-streepjescode" voor [7]. DNA-barcodetechnologie is een effectieve methode voor het identificeren van traditionele Chinese geneeskunde en multi-based grondstoffen. Voor het respectieve DNA werden de kandidaat-fragmenten geamplificeerd door de algemene primer-polymerasekettingreactie (PCR), de PCR-amplificatieproducten werden gezuiverd, gesequenced en geanalyseerd, de doel-DNA-streepjescodesequentie werd doorzocht en er werd een DNA-streepjescodeherkenningssysteem geconstrueerd [8 ]. Concluderend, DNA-barcode-identificatie is een biomoleculaire identificatiemethode die gebruik maakt van een of enkele relatief korte, standaard DNA-fragmenten voor soortidentificatie [9].

In de afgelopen jaren is door de combinatie van high-throughput sequencing-technologie en DNA-barcode-identificatietechnologie een nieuwe technologie ontwikkeld die barcodesequenties van meerdere soorten in gemengde monsters tegelijkertijd kan detecteren: DNA-metabarcode, waarvan het basisprincipe is om high-throughput sequencing toe te passen. De technologie verkrijgt de versterkte sequentie van de gemengde streepjescode en identificeert de soortensamenstelling in het gemengde monster door middel van bioinformatica-analyse[10].

1.2 Selectie van DNA-barcodesequenties

De barcodesequenties die kunnen worden gebruikt in DNA-barcoderingstechnologie omvatten mitochondriaal co-enzym Ⅰ (CO Ⅰ) DNA, 12S rRNA, 16S rRNA-sequenties en ribosomaal 18S rDNA voor identificatie van diersoorten [11]; ribosomaal 16S rDNA voor bacteriële identificatie[12] ], ribosomale interne getranscribeerde spacer (ITS) genspecifieke fragmenten en CO I-sequenties voor identificatie van schimmels[13]; vanwege de trage evolutiesnelheid van mitochondriale genomen in planten, worden barcodefragmenten voornamelijk geselecteerd op het chloroplastgenoom. De voorgestelde genfragmenten omvatten voornamelijk rpoB, rpoC1, matK, rbcL en UPA, en de niet-coderende regiofragmenten omvatten atpF-atpH, trnH-psbA, psbK-psbI en

Genucleëerd gen ITS[14]. In 2006 testte de onderzoeksgroep van Chen Shilin het onderscheidingsvermogen van ITS2 op meer dan 6.600 plantenmonsters en ontdekte dat de identificatie-efficiëntie van ITS2 op soortniveau maar liefst 92,7 procent was, wat aangeeft dat de ITS2-reeks standaard DNA-streepjescodes kan identificeren van geneeskrachtige planten en nauw verwante soorten. ITS2 werd gebruikt als een nieuw type universele DNA-barcode voor medicinale planten [15], en werd erkend door internationale vakgenoten [16].

In 2013 heeft de Nationale Farmacopeecommissie de opname van de richtlijnen voor de moleculaire identificatie van DNA-streepjescodes voor Chinese medicinale materialen in de aanvullende editie van de "Chinese Farmacopee" besproken en goedgekeurd. ITS2 is het belangrijkste DNA-barcode-identificatiesysteem voor medicinale plantenmaterialen [17].

Op dit moment hebben veel wetenschappers onderzoek gedaan naar moleculaire identificatie van Cistanche-planten. Volgens het onderzoek van Chen Shilin et al. [18], ITS2 is geschikt als standaard streepjescodereeks voor identificatie van medicinale planten. Sun Zhiying et al [19] ontdekten dat de ITS2-sequentie kan worden gebruikt als basis voor het effectief identificeren van het Chinese kruidengeneesmiddel Cistanche deserticola en zijn namaakproducten in DNA-barcodes. Wang Xiaoyue et al [20] gebruikten ITS2-streepjescodes om 4 veelvoorkomende versluierde producten van Cynomorium, Cistanche, Liedang en Cistanche te identificeren, en stelden met succes de "moleculaire identiteitskaart" van de verduisterde producten van Cistanche vast. De methode om medicinale planten te identificeren door middel van ITS2-sequenties is relatief volwassen en heeft de voordelen van snelheid, nauwkeurigheid en efficiëntie. Daarom is het gebruik van de ITS2-reeks om Cistanche-planten te identificeren de meest gebruikte methode geworden.

1.3 Workflow van DNA-barcodering

De workflow van DNA-barcodering is vergelijkbaar met de werking van moleculair fylogenetisch onderzoek, en de belangrijkste stappen worden weergegeven in figuur 1. Gu Xiuyan [21] verkreeg de basissequentie van ITS en analyseerde de verschillen tussen soorten, en ontdekte dat Cistanche nauw verwant is naar Cistanche saline, en Cistanche in Lanzhou is nauw verwant aan Cistanche, wat ook een basis vormt voor de ontwikkeling van nieuwe medicijnbronnen van Cistanche. basis. Li Zhenhua et al [22] voerden moleculair DNA-identificatieonderzoek uit op Cynomorium, Cistanche en Huanghua Liedang, en realiseerden een snelle en nauwkeurige identificatie van Cistanche en vervalste Cynomorium, Cistanche en Huanghualiedang door plaatsspecifieke PCR.

Kortom, er is al een relatief compleet proces voor het identificeren van plantensoorten met behulp van DNA-barcodes. Het identificeren van Cistanche-planten door DNA-sequenties te analyseren en een gerelateerde database op te zetten, kan in de toekomst een betere basis vormen voor de identificatie en classificatie van Cistanche-planten.

1.4 Data-analyse van DNA-barcodering

Het verwerken en analyseren van de verkregen gegevens is een zeer belangrijke taak[18]. Nadat de sequentiebepaling is voltooid, worden sequentievergelijking en handmatige correctie uitgevoerd om sequenties en primergebieden van lage kwaliteit te verwijderen. Veelgebruikte software omvat Chromas, CExpress[23], enz.; De genetische afstandsanalyse van de uiteindelijke sequentie wordt over het algemeen uitgevoerd door MEGA-software [24] om de genetische afstand tussen monsters van verschillende plantensoorten te analyseren, en het K2P-model [25-26] wordt gebruikt om de intraspecifieke afstand tussen soorten te berekenen ; construeer vervolgens de Neighbour-joining (NJ) fylogenieboom, met behulp van de iTol online website [27] om de ontwikkelingsboom te verbeteren en te verfraaien (https://itol.embl.de/), en controleer het ondersteuningspercentage van elke tak volgens de bootstrap (1000 herhalingen).

De BLAST-methode is een zoekalgoritme op basis van BLAST. Het is noodzakelijk om een ​​database met referentiesequenties op te zetten of te downloaden voor soortidentificatie op de GenBank-database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) voor daaropvolgende analyse van genfragmenten en soortidentificatiewerk [28]. Xu Danyun et al [29] gebruikten 3 paar universele primers voor DNA-barcodes om 22 soorten Lauraceae-planten te identificeren en identificeerden met succes 20 plantensoorten. Adolfo et al [30] hebben met succes 3 soorten Pueraria-planten geïdentificeerd met behulp van ITS2- en matK-streepjescodes. Bovenstaande studies tonen aan dat door het verkrijgen en analyseren van de DNA-sequenties van medicinale planten, plantensoorten snel en efficiënt geïdentificeerd kunnen worden.

2 Toepassing van andere moleculaire merkertechnieken bij de identificatie van Cistanche-planten

Voor organismen worden hun eigenschappen boven het moleculaire niveau uiteindelijk bepaald door moleculaire eigenschappen. Vergeleken met morfologische analyse [31] en chromosoomanalyse [32] kunnen moleculaire markers het ware gezicht van biologische genetische diversiteit onthullen. Sarwat et al [33] gebruikten geamplificeerd fragmentlengtepolymorfisme (AFLP), selectief geamplificeerde polymorfe microsatelliet locustechnologie (SAMPL), eenvoudige intersequentie-amplificatie van herhalingen (ISSR), willekeurig geamplificeerd polymorf DNA (RAPD) en andere moleculaire merkertechnieken ontdekten de genetische diversiteit van Tribulus terrestris-monsters verzameld op verschillende plaatsen in India, en de resultaten toonden aan dat deze vier moleculaire markertechnieken verschillende DNA-vingerafdrukken kunnen verkrijgen die uniek zijn voor elke geografische regio. De International Union for the Protection of Plant Variety Rights (UPOV) maakt ook gebruik van DNA-moleculaire merkeridentificatie als hulpmiddel voor DUS-testen (distinctness uniformity and stabiliteit) van gewasvariëteiten [34]. Op dit moment zijn moleculaire markertechnologieën zoals AFLP, RAPD en ISSR relatief volwassen en worden ze veel gebruikt bij de identificatie van Cistanche-planten (tabel 1).

Steun:

wallence.suen@wecistanche.com 0015292862950