Een MRNA-vaccin lokt STING-afhankelijke antitumor-immuunreacties uit

Abstract

Met lipiden geformuleerde RNA-vaccins zijn op grote schaal gebruikt voor de preventie en behandeling van ziekten, maar hun werkingsmechanisme en individuele componenten die bijdragen aan dergelijke acties moeten nog worden afgebakend. Hier laten we zien dat een therapeutisch kankervaccin bestaande uit een protamine/mRNA-kern en een lipide-omhulsel zeer krachtig is in het bevorderen van cytotoxische CD8-T-celreacties en het bemiddelen in antitumorimmuniteit. Mechanistisch gezien zijn zowel de mRNA-kern als de lipidenschil nodig om de expressie van type I-interferonen en inflammatoire cytokines in dendritische cellen volledig te stimuleren. Stimulatie van interferon-b-expressie is uitsluitend afhankelijk van STING, en de antitumoractiviteit van het mRNA-vaccin wordt aanzienlijk aangetast bij muizen met een defect Sting-gen. Het mRNA-vaccin wekt dus STING-afhankelijke antitumorimmuniteit op.

cistanche voordelen voor mannen versterken het immuunsysteem

1. Inleiding

De snelle ontwikkeling en wereldwijde toepassing van mRNA-vaccins voor de preventie van SARS-CoV-2-infectie hebben de kracht van op mRNA gebaseerde medicijnen in de gezondheidszorg aangetoond1,2. Vanwege hun grote molecuulgewicht en negatieve lading moeten mRNA-moleculen in transportvoertuigen worden verpakt om effectief zoogdiercellen binnen te dringen. Het verpakken in bezorgvoertuigen van nanometerformaat heeft ook het voordeel dat het mRNA-moleculen beschermt tegen enzymatische afbraak. Er zijn meerdere leveringsplatforms ontwikkeld om aan dit doel te voldoen, zoals lipidenanodeeltjes4, lipo polyplex (LPP)5, liposoom-protamine-RNA (LPR)6, RNA lipoplex (RNA-LPX)7 en virusachtig vaccindeeltjes (VLVP). )8. Hoewel elk platform zijn eigen unieke structuur en samenstelling heeft, bevatten de meeste vehikels een ionisch lipidemolecuul dat de verpakking van mRNA en het ontsnappen van mRNA-moleculen uit de endosomen vergemakkelijkt. Met het succes van de profylactische vaccins is er een algemeen besef dat mRNA-therapieën kunnen worden gebruikt om misschien wel de meeste, zo niet alle, ziektetypen te behandelen9e12. Op mRNA gebaseerde therapeutische kankervaccins worden inderdaad al vele jaren bestudeerd13,14. Recente ontwikkelingen in klinische onderzoeken hebben ook hun toepassingspotentieel aangetoond bij geselecteerde kankerpatiënten15e17. In tegenstelling tot peptidekankervaccins die worden bereid met adjuvantmoleculen18e20, kunnen mRNA-vaccindeeltjes ook als zelfadjuvantia dienen21.

Een uit twee componenten bestaand mRNA-gebaseerd kankervaccin dat vrij en protamine-gecomplexeerd mRNA bevat, kan bijvoorbeeld ook de toll-like receptor 7 (TLR7)-signalering activeren22. Echter, met de toenemende bezorgdheid over acute aangeboren immuuntoxiciteit door naakt mRNA, gebruiken de meeste onderzoekers en bedrijven gemodificeerd RNA om aangeboren herkenning door de TLR's te voorkomen23. Bijgevolg spelen de lipidecomponenten een belangrijke rol bij het verhogen van de adjuvansactiviteit in het mRNA-vaccindeeltje, bij voorkeur door het activeren van niet-TLR-signalering. Een recent onderzoek naar het met lipiden geformuleerde, negatief geladen RNA-LPX bestaande uit 1,2- di-octadecenyl-3-trimethylammonium (DOTMA, een kationisch lipide)/dioleoylfosfatidylethanolamine (DOPE, een helperlipide) liposoom onthulde activering van de interleukine 1 (IL1)-interleukine 1-receptorantagonist (IL-1ra)-as bij het reguleren van de secretie van pro-inflammatoire cytokines, en de essentiële rol van het activeren van de tweestaps-inflammasoomroute in monocyten24. Interessant is dat een ander recent onderzoek naar het op LNP gebaseerde BNT162b2, bereid met ALC-0315 (een geïoniseerd lipide), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC, een hulplipide) , polyethyleenglycol-2000-N, N-di-tetradecylaceetamide (PEG2000-DTA) en cholesterol toonden de sleutelrol aan van het activeren van type I interferon-afhankelijke MDA5-signalering, maar niet van TLR's of inflammasoom, bij het stimuleren van beide aangeboren en adaptieve immuniteit van het COVID-19-vaccin25. Deze onderzoeken wijzen op de mogelijkheid dat afgifteplatforms bestaande uit variabele lipidemoleculen afhankelijk kunnen zijn van verschillende signaaltransductieroutes voor vaccinactiviteit. Het is dus belangrijk om de functie van sleutelmoleculen en hun combinaties volledig te onderzoeken om mRNA-therapieën verder te verbeteren.

In de huidige studie hebben we experimenten opgezet om de functionele rol van individuele componenten in een therapeutisch kankervaccin te ontleden. Het mRNA-vaccindeeltje (MVP) is samengesteld uit een protamine/mRNA-kern die is ingekapseld in een lipide-omhulsel bestaande uit een kationisch lipide, een helper-lipide, een gepegyleerd lipide en cholesterol (Fig. 1A). Er is aangetoond dat de opname van geladen lipiden gerichte RNA-afgifte kan vergemakkelijken26, en dioleoylethylfosfatidylcholine (EDOPC) en dioleoyl-3- trimethylammoniumpropaan (DOTAP) zijn twee van de kationische lipiden die voor dit doel zijn getest5,27. We onderzochten de stimulatie van de expressie van interferon-b (IFN-b), IL-1b en tumornecrosefactor-a (TNF-a) door de mRNA-kern, het mRNA-vrije vehikel en de hele MVP, en correleerde dergelijke activiteiten met de TLR7, mitochondriale antivirale signalering (MAVS, ook bekend als IPS-1), stimulator van IFN-genen (STING) en TIR-domein-bevattende adapter die IFN-b (TRIF)-signalering induceert. Vervolgens onderzochten we de rol van protamine in de kern en kationische lipide in de schaal bij het stimuleren van IFN-b- en TNF-a-expressie. Ten slotte vergeleken we antitumor-immuunreacties van de MVP bij wildtype en gen-knock-out muizen.

Voordelen van cistanche tubulosa-Antitumor

2. materialen en methoden

2.1. Materialen

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylfosfocholine (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfatidyl-ethanolamine (DOPE) (850725 ), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfo-ethanolamine-N-[amino(polyethyleenglycol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoyl-3-trimethylammoniumpropaan (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) (850375) werden gekocht bij Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, Alabama, VS). Cholesterol (C8667) werd verkregen bij Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, VS). De reagentia werden opgelost in ethanol in een concentratie van respectievelijk 2 mg/ml voor DSPE-PEG2k, 10 mg/ml voor cholesterol en DOPC, en 20 mg/ml voor EDOPC, DOPE en DOTAP. Protaminesulfaat (P4020) werd verkregen van Sigma Aldrich. mRNA-moleculen die coderen voor ovalbumine (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP-mRNA) (L-7201) en luciferase (Luc-mRNA) (L-7204) werden gekocht bij TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, VS). RNase-vrij water (W0805-010) werd verkregen van GeneDEPOT (Baker, TX, VS). De TLR7-agonist imiquimod (tlrimq) en Sting-agonist 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) waren producten van Invivogen (San Diego, CA, VS). Lipofectamine 2000 (11668019) en Quant-iT™ RiboGreen™ RNA-testkit (R11490) werden gekocht bij Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, VS). Recombinante muis GM-CSF (554586) werd gekocht bij BD Biosciences (San Diego, CA, VS). 500 Protein transporter-remmercocktail (00-4980-93) was een product van Invitrogen. Cytofix/Cytoperm-kit (AB_2869010) werd gekocht bij BD Biosciences. EasySepTM Mouse T Cell Isolation Kit (19851) werd verkregen van STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). De volgende antilichamen werden verkregen van BioLegend (San Diego, CA, VS): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) en anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643) en anti-CD103-PE (121406). Anti-CD40-FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) en anti-IFN-g-PE (554412) waren van BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) werd gekocht bij ImmuDex (Fairfax, VA, VS). ELISA-kits voor IL-1b (EM2IL1B) en TNF-a (BMS607-3) zijn gekocht bij Invitrogen, en ELISA-kits voor CCL5 (DY478) en IFN-b (DY8234) zijn verkregen bij R&D Systems , Inc. (Minneapolis, Minnesota, VS). Antilichamen voor Western blot-analyse, waaronder anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antifosfo-TBK1 (5483), anti-b-actine (4970) en anti-GAPDH (5174) werden gekocht bij Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, VS).

Figuur 1 Bereiding en karakterisering van mRNA-deeltjes. (A) Schematische weergave van de bereiding van vaccindeeltjes. (B) Agarosegelelektroforese laat zien dat mRNA-moleculen in het monsterlaadputje werden vastgehouden in monsters die waren bereid met mRNA/protamine in een verhouding van 1:1 tot 1:2. (CeF) Karakterisering van mRNA-vaccindeeltjes (MVP's) op basis van het percentage inkapseling, polydispersiteitsindex, zeta-potentieel en grootte. (G) Representatieve TEM-afbeeldingen van MVP2-deeltjes, schaalbalk Z 50 nm. (H) Percentage eGFP-expressie nadat DC2.4-cellen gedurende 16 uur met eGFP-MVP's waren behandeld. (I) Fluorescerende beeldvorming van DC2.4-cellen die eGFP tot expressie brengen, schaalbalk Z 400 mm. (J) Kwantitatieve analyse van bioluminescentie in BMDC's behandeld met MVP's ingekapseld met voor luciferase coderend mRNA gedurende 16 uur. (K) Veranderingen in de levensvatbaarheid van BMDC's behandeld met PBS, mRNA-vrij vehikel, mRNA / protamine-kern of in mRNA ingekapseld MVP2. Behandelingsconcentraties waren mRNA-equivalent. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde SEM (nZ 3). *P <0,05; **P<0,01.

2.2. Cellijnen en celcultuur

De DC2.4 dendritische cellijn van muizen werd verkregen van ATCC (Manassas, VA, VS) en werd gekweekt in RPMI-1640 dat 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bevatte. De muizenmelanoomcellijn B16-OVA werd verkregen van Dr. Kenneth Rock, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, VS). B16-OVA-cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. De murine colonadenocarcinoomcellijn MC38 werd gekocht bij ATCC. Cellen werden gemanipuleerd met OVA-expressie en werden gekweekt in DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. De celkweek werd op 37°C gehouden met 5% CO2.

cistanche tubulosa-verbetering van het immuunsysteem

2.3. Bereiding van mRNA-vaccindeeltjes

Alle mRNA-vaccindeeltjes werden bereid met behulp van het NanoAssemblr Benchtop microfluïdische instrument van Precision Nanosystems, Inc., (Vancouver, BC, CAN) door de organische fase en de waterfase te mengen. Om de organische fase te bereiden werden EDOPC (20 mg/ml), DOPE (20 mg/ml), cholesterol (10 mg/ml) en bis-DSPE-PEG2k (2 mg/ml) opgelost in ethanol en bij 34°C gemengd. :30:35:1 M-verhouding met een stroomsnelheid van 9 ml/min. Om de mRNA-kern in de waterfase te bereiden, werd mRNA gemengd met protaminesulfaat in een verhouding van 1:1 (w/w) in het microfluïdische instrument met een stroomsnelheid van 9 ml/min. Na 20 minuten incubatie bij 20°C werd de mRNA-kern in de waterige fase gemengd met de organische fase om mRNA-vaccindeeltjes te genereren. Na 20 minuten werd de suspensie van vaccindeeltjes overgebracht naar een Amicon ultracentrifugaal filter (MWCO 30 kDa) en werd 9-volume water van moleculaire kwaliteit toegevoegd om de ethanolconcentratie te verdunnen van 25% naar 2,5%. De deeltjessuspensie werd vervolgens geconcentreerd door centrifugatie bij 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) bij 4 ° C. Een gelijk volume van 2 PBS werd aan het geconcentreerde product toegevoegd om de osmotische druk aan te passen.

2.4. Gelvertragingstest

De mRNA/protaminekern werd eerst geanalyseerd door middel van gelretardatie. In het kort werd de mRNA/protamine-kern met 0,5 mg mRNA in het putje van een 1% agarosegel in 1 TBE-oplossing geladen en werd elektroforese gedurende 30 minuten bij 120 V uitgevoerd (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). RNA-banden werden gekleurd met Gelred (Biotium, Hayward, CA) en gedetecteerd met een GelDoc-systeem (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Karakterisering van mRNA-vaccindeeltjes

Grootteverdeling en zetapotentiaal werden gemeten met dynamische lichtverstrooiing Zetasizer (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, VS). De inkapselingssnelheid werd bepaald met behulp van een Quant-iT™ RiboGreen™ RNA-testkit. In het kort werd een vaccindeeltjesmonster dat 0,5 mg mRNA bevatte, verdund met een TriseEDTA-buffer (10 mmol/l TriseHCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7,5) met of zonder 2% Triton-X100 in een { {10}}putplaat. Na 10 minuten incubatie bij 37°C werd RiboGreen aan elk putje toegevoegd en werd de fluorescentie-intensiteit gemeten. De inkapselingsefficiëntie werd berekend zoals getoond in Vgl. (1): Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van vaccindeeltjes werd uitgevoerd volgens een eerder beschreven procedure9.

2.6. Dieren

Alle dieroperaties werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Houston Methodist Hospital (protocolnummer AUP06200042). Muizen werden gehuisvest in een omgeving die volledig voldeed aan de wettelijke normen van het National Institute of Health en de American Association of Laboratory Animal Care-normen. Wildtype C57BL/6J-muizen en genetisch gemanipuleerde muizen, waaronder Tlr7/, Sting/, Mavs/ en Trif/-muizen, werden gekocht bij Jackson Laboratory.

2.7. Generatie van van muizenbeenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC's)

Beenmergcellen werden uit het dijbeen en het scheenbeen gespoeld met volledige RPMI 1640. Rode bloedcellen werden gelyseerd met een ACK-lysebuffer, en onrijpe beenmergcellen werden gekweekt in RPMI 1640 aangevuld met 20 ng/ml recombinant muizen-GM-CSF gedurende 10 minuten. dagen bij 37 C met 5% CO2. Het celkweekmedium werd op dag 3, 6 en 8 ververst en op dag 10 werden niet-hechtende dendritische cellen verzameld.

2.8. Meting van cytokinen en chemokinen

BMDC's werden in een 24-putjesplaat gezaaid met een dichtheid van 5  105 cellen/putje. Na 1 uur bezinking werden de cellen behandeld met 1 mg/ml imiquimod, 20 mg/ml 20 30 -cGAMP, (1 mg/ml mRNA-equivalent) vaccindeeltjes of controles. Celkweekmedia werden 24 uur later verzameld en de niveaus van TNF-a, CCL5, IFN-b en IL-1b werden gemeten met behulp van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-kits door de door de fabrikant voorgestelde procedures te volgen.

cistanche plantverhogend immuunsysteem

2.9. Analyses van DC-transfectie, DC-rijping en stimulatie

Om de DC-transfectie-efficiëntie in vitro te analyseren, werden DC2.4-cellen gezaaid met 2,5 105 cellen/putje in een 24-putjesplaat. Cellen werden behandeld met voor eGFP of luciferase coderende in mRNA ingekapselde deeltjes bij een eindconcentratie van 1 mg mRNA/ml. Cellen werden 24 uur later geoogst, gewassen met 2% FBS in PBS-oplossing en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in dezelfde oplossing voordat ze werden toegepast voor flowcytometrieanalyse met een BD LSR II flowcytometer (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) . Om DC-rijping en antigeenpresentatie in vitro te meten, werden BMDC's met 2,5  105 cellen/putje in een 24-well-plaat gezaaid en gedurende 24 uur behandeld met 1 mg/ml OVA-MVP. BMDC's werden 30 minuten gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 en CD86 voor DC-rijping, en anti-H-2Kb (SIINFEKL) voor antigeenpresentatie. Om de stimulerende potentie in vivo te bepalen, werden C57BL/6J-muizen eenmaal gevaccineerd met 10 mg OVA-MVP per muis in de voetzool, en drainerende popliteale LN's werden geoogst 24, 48 en volgende celoppervlakmarkers: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Flowcytometrieanalyses van T-celactivatie en proliferatie

Om T-celactivatie in vivo te meten, werden muizen eenmaal gevaccineerd met 10 mg OVA-MVP en werden popliteale LN's na 24 of 48 uur geïsoleerd. T-cellen werden gekleurd met de volgende antilichamen: CD45, CD3, CD4, CD8 en CD69. Om antigeenspecifieke T-cellen te detecteren werden 5 dagen na de tweede vaccinatie tumoren, milt en popliteale lymfeklieren geoogst. Weefsels werden verwerkt om suspensies van één cel te genereren, en cellen werden gekleurd met T-celspecifieke antilichamen en OVA257e264-MHCI-dextrameer volgens de instructies van de fabrikant. Om het intracellulaire IFN-g-niveau te meten, werden 2  106 splenocyten of cellen geïsoleerd uit popliteale LN's en tumoren gestimuleerd met 10 mg/ml OVA257e264-peptide in compleet RPMI 1640-medium aangevuld met 55 mmol/l b-mercaptoethanol en 1 eiwittransporterremmer cocktail voor 18 uur. Cellen werden geoogst en gekleurd met T-celspecifieke antilichamen. Na fixatie en permeabilisatie met Cytofix/Cytoperm-kit werden de cellen gekleurd met anti-IFN-g-antilichaam en voor analyse op een BD LSR II-flowcytometer (BD Biosciences) aangebracht. Om de proliferatie van T-cellen te meten, werden T-cellen geïsoleerd uit de milten van transgene OT-I-muizen met behulp van een T-cel-isolatiekit voor muizen. Ze werden gedurende 10 minuten bij 37°C gekleurd met 1 mmol/l CFSE in RPMI 1640 dat 200 mg/ml BSA bevatte. CFSE-gelabelde T-cellen werden twee keer gewassen met 5 volumes koude, volledige RPMI 1640. In de tussentijd werden rijpe BMDC's behandeld met 2 mg/ml OVA-mRNA-ingekapselde MVP gedurende 24 uur vóór T-celisolatie. Zodra de T-cellen gereed waren, werden BMDC's en T-cellen gedurende 72 uur samen gekweekt in een verhouding van 1:5 (DC:T). Cellen werden verzameld en gekleurd met oppervlakte-antilichamen voor T-cellen, de proliferatie werd getest met behulp van een BD LSR II-flowcytometer (BD Biosciences) en geanalyseerd. Alle flowcytometrieresultaten werden geanalyseerd met de FlowJo v10-software (Ashland, OH, VS).

2.11. Het volgen van eiwitexpressie in levende muizen

BALB/c-muizen werden behandeld door intra-voetzoolinjectie met 10 mg Luc-mRNA-ingekapseld MVP. Ze werden 6, 12, 24 of 48 uur later intraperitoneaal geïnjecteerd met 30 mg RediJect D-luciferine per muis, en de bioluminescentie werd gemeten met het Xenogen IVIS-200 beeldvormingssysteem (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, VS).

2.12. ELISpot-test

IP-filterplaten werden voorgespoeld met 50 ml 35% ethanol en driemaal grondig gewassen met PBS voordat de ethanol verdampte. De platen werden vervolgens overnacht bij 4°C bekleed met anti-IFN-g-vangantilichamen. De platen werden gedurende 2 uur bij 37°C geblokkeerd met RPMI 1640 compleet medium dat 55 mmol/l b-mercaptoethanol bevatte. Cellen (1  105 splenocyten, 1  105 cellen uit popliteal LN) werden in elk putje gezaaid en gedurende 36 uur gestimuleerd met 10 mg/ml OVA257e264-peptide. Media werden weggegooid en cellen werden viermaal gewassen met PBST (PBS dat 0,05% Tween 20 bevatte) en tweemaal met PBS. Na de laatste wasbeurt werd een anti-IFN-g-detectieantilichaam toegevoegd en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. De platen werden vier keer gewassen met PBST en tweemaal met PBS, en avidine-HRP werd toegevoegd en nog eens 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Tenslotte werden de platen opnieuw gewassen met PBST en PBS zoals hierboven beschreven, en werd 50 ml AEC-substraat aangebracht en gecontroleerd op vlekreactie. Toen vlekken zichtbaar werden, werd de reactie gestopt door het AEC-substraat weg te gooien en dit vijfmaal met dubbel gedestilleerd water te spoelen. Na een nacht aan de lucht drogen werden de platen gescand en geanalyseerd met behulp van de CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, VS).

2.13. Western blot-analyse

BMDC's afgeleid van wildtype Mavs KO- of Sting KO-muizen werden verzameld en cellen werden gelyseerd in RIPA-cellysebuffer aangevuld met protease- en fosfataseremmers. De eiwitconcentratie in cellysaat werd gemeten met een BCA-eiwittestkit. Eiwitmonsters werden gescheiden met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en overgebracht naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan. MAVS- en STING-expressie werd gedetecteerd nadat het membraan was geïncubeerd met een anti-MAVS- of anti-STING-antilichaam bij een verdunning van 1:2000, gevolgd door immunodetectie met SuperSignal West Pico en Femto Chemiluminescent Substrate. Om de activering van de STING-route te meten, werden BMDC's afgeleid van wildtype muizen gedurende 2 uur behandeld met vehiculum- of OVA-mRNA-ingekapseld MVP in de aangegeven concentratie. Cellen werden gelyseerd en voortgezet voor Western-blot-analyse met anti-TBK1- en antifosfo-TBK1-antilichamen bij een verdunning van 1:2000.

2.14. Antitumortest

Muizentumormodellen werden gegenereerd door 2  105 cellen B16-OVA-melanoomcellen of 5  105 MC38-OVA-cellen per muis subcutaan te enten in de linkerflank van 6 tot {{5} }vrouwelijke C57BL/6J-muizen van een week oud. Muizen werden willekeurig in behandelingsgroepen verdeeld en twee keer behandeld, met een tussenpoos van 7 dagen, met 10 mg OVA MVP of controles in de voetzool. De tumorgroei werd elke 2 dagen gevolgd. Het tumorvolume werd berekend volgens Vgl. (2):

Muizen werden 5 dagen na de tweede vaccinatie geëuthanaseerd en het gewicht van het tumorweefsel werd geregistreerd.

2.15. statistische analyse

Alle resultaten worden weergegeven als gemiddelde SEM. Statistieken werden beoordeeld met een eenrichtings-ANOVA-test met behulp van Tukey's correctie voor vergelijking van meerdere groepen en een ongepaarde tweezijdige t-test voor vergelijking van twee groepen. De gegevens zijn geanalyseerd met de GraphPad Prism v8.0.2-software. P < 0.{{10}}5 werd als statistisch significant beschouwd (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Resultaten

3.1. MVP bemiddelt robuuste mRNA-expressie in dendritische cellen (DC)

We hebben core-shell-vaccindeeltjes bereid in een tweestaps microfluïdische benadering (Fig. 1A) en systematisch individuele componenten in het nanodeeltje geëvalueerd om een ​​vaccindeeltje samen te stellen met hoge stabiliteit, hoge cellulaire opname en hoog expressiepotentieel in DC's. Gelelektroforese onthulde dat een stabiele mRNA-kern kon worden gevormd zodra de mRNA-tot-protamine-verhouding 1 of lager was (Fig. 1B). Met behulp van voor eGFP coderend mRNA als surrogaatmarker hebben we ontdekt dat een lipidensamenstelling met een molaire verhouding van 34% EDOPC/30% DOPE/35% cholesterol/1% DSPEPEG2k een ideale inkapselingssnelheid en de beste expressie-efficiëntie opleverde (Tabel 1, Ondersteunende informatie (afb. S1AeS1D). Het veranderen van de ladingsverhouding veranderde de inkapselingssnelheid, de polydispersiteitsindex of de oppervlaktelading van de deeltjes niet significant (tabel 2, figuur 1CeE); de grootte van de resulterende deeltjes had echter een diameter tussen 70 en 80 nm wanneer de verhouding tussen 12 en 16 lag, vergeleken met een diameter van 120e130 nm zodra de verhouding buiten het bereik viel (Fig. 1F en G). De beste expressie werd gedetecteerd in DC2.4-cellen behandeld met MVP2 die een ladingsverhouding van 12 hadden (Fig. 1H en I). Een soortgelijk patroon werd waargenomen wanneer deeltjes werden bereid met mRNA dat codeert voor luciferase, en dosisafhankelijke expressie werd gedetecteerd (Fig. 1J). De in mRNA ingekapselde deeltjes vertoonden de gewenste stabiliteit omdat ze geen activiteit verloren na lyofilisatie of invriezen-dooien (Fig. S1E en S1F). Bovendien was er geen cytotoxiciteit nadat van beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC's) waren behandeld met alleen de mRNA-kern, een vehikeldeeltje bereid zonder mRNA-moleculen, of mRNA-bevattend MVP2 (Fig. 1K). MVP2 vertoonde dus het beste expressiepotentieel. Het werd gebruikt voor alle verdere experimenten in het onderzoek en werd in de rest van de tekst bestempeld als MVP. De MVP-deeltjes konden effectief mRNA-moleculen in vivo afleveren, en er was geen detecteerbare toxiciteit van de in mRNA ingekapselde MVP op basis van veranderingen in lichaamsgewicht (Fig. S1GeS1I).

3.2. MVP induceert effectief antigeenpresentatie en T-celactivering in vitro en in vivo

We hebben mRNA-kern, mRNA-vrij vehikel en OVA-mRNA ingekapseld MVP bereid en deze toegepast om DC-rijping en antigeenpresentatie te testen (Fig. 2A). BMDC's behandeld met MVP vertoonden dosisafhankelijke overexpressie van DC-rijpingsmarkers, waaronder CD40, CD80 en CD86 (Fig. 2BeD). Behandeling met het mRNA-vrije vehikel of met mRNA ingekapseld MVP veroorzaakte overexpressie van MHC I (Fig. 2E), wat aangeeft dat het effect geassocieerd was met het vehikel in plaats van met het mRNA-complex. Bovendien resulteerde MVP-behandeling in weergave op het celoppervlak van het OVA257e264-antigeenepitoop-MHC I-complex (SIINFEKL-MHC I) dat werd gedetecteerd met een anti-SIINFEKL-MHCI-antilichaam (Fig. 2F), wat effectieve antigeenverwerking en -presentatie door BMDC's aantoont. . Verder co-incubatie van met MVP behandelde BMDC's met B3Z, een CD8þ T-cellijn die specifiek het OVA257e264-epitoop herkende, of T-cellen geïsoleerd uit de milt van een OT-I-muis die een OVA257e264-specifieke T-cel tot expressie bracht receptor, veroorzaakte IL-2-secretie, een resultaat dat niet werd waargenomen in T-cellen die samen met DC's waren behandeld die alleen met vehiculum of alleen met de mRNA/protamine-kern waren behandeld (Fig. 2G). Flowcytometrieanalyse detecteerde 32, 5% proliferatieve CD8 T-cellen na co-incubatie met MVP (Fig. 2H en I). In OVA-mRNA ingekapselde MVP-deeltjes werden ook toegepast om muizen te behandelen door middel van intradermale injectie. Onderzoek van cellen in de drainerende lymfeklieren onthulde een gestage toename in CD86-expressie onder zowel klassieke DC's (CD8þ DC, CD11bþ DC, CD103þ DC) als plasmacytoïde DC's (pDC) gedurende de eerste 48 uur, wat wijst op stimulatie van DC rijping (Fig. 2J). De behandeling bevorderde ook de verrijking van CD8 T-cellen in de lymfeklieren, met een significante toename van de populatie CD69 CD8 T-cellen (Fig. 2K en L), wat wijst op T-celactivering door de behandeling. Om T-celactivatie te bepalen, verzamelden we cellen in de drainerende lymfeklieren 3, 5 of 7 dagen na MVP-behandeling en voerden ELISpot-analyses uit nadat cellen waren uitgedaagd met het OVA257e264-antigeenpeptide (ondersteunende informatie Fig. S2). MVP-behandeling veroorzaakte gedurende die tijd een grote sprong in IFN-g-uitscheidende cellen, met een piekactiviteit op dag 5 (Fig. 2M). Deze resultaten demonstreerden robuuste DC-stimulatie, antigeenpresentatie en T-celactivering na behandeling met MVP.

Tabel 1 Samenstelling van nanodeeltjes ingekapseld met eGFP-coderend mRNA.

tafel 2Lipidensamenstelling en ladingsverhouding van MVPdeeltjes.

3.3. MVP wekt krachtige antitumorimmuniteit op in muizenmodellen van colorectale tumoren en melanoom

MVP werd toegepast om muizen met MC38-darmkanker en B16-melanoom te behandelen. In beide modellen blokkeerde de behandeling met in OVA-mRNA ingekapseld MVP de tumorgroei tweemaal subcutaan volledig; ter vergelijking: behandeling met in eGFP-mRNA ingekapseld MVP of vehiculum alleen had geen enkel detecteerbaar remmend effect op de tumorgroei (Fig. 3AeD, Ondersteunende informatie Fig. S3). In overeenstemming met het patroon van een CD4- naar CD8-verschuiving in lymfeklieren (Fig. 2), hebben we een toename waargenomen in de CD8 / CD4 T-celverhouding in tumoren van muizen behandeld met in OVA-mRNA ingekapseld MVP (Fig. 3E). Bovendien hebben we verhoogde niveaus gedetecteerd in IFN-gþCD8þ T-cellen in de milten, lymfeklieren en tumoren bij muizen behandeld met OVA-mRNA-ingekapselde MVP, maar niet met alleen vehiculum of GFP-mRNA-ingekapselde MVP (Fig. 3FeH, ondersteunende informatie Afb. S4). Bovendien was er een significante toename van OVA257e264-MHCI dextrameer-positieve CD8þ T-cellen in tumoren uit de OVA mRNA-ingekapselde MVP-behandelingsgroep, hetgeen wijst op proliferatie van antigeen-specifieke CD8þ T-cellen (Fig. 3I). ELISpot-test met cellen geïsoleerd uit de milt en lymfeklieren zorgde voor verdere ondersteuning bij T-celactivering (Fig. 3JeM).

3.4. MVP stimuleert aangeboren immuunreacties door STING-afhankelijke signalering te activeren

We hebben mRNA-kern, mRNA-vrij vehikel en mRNA-ingekapselde MVP toegepast om BMDC's te behandelen om sleutelfactoren en routes te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de stimulatie van type I IFN en inflammatoire cytokine-expressie. Interessant genoeg was MVP net zo krachtig als de Tlr7-agonist imiquimod bij het teweegbrengen van IFN-b-secretie, en vertoonde vehikel alleen ook activiteit bij het bevorderen van IFN-b-secretie, hoewel de potentie ervan niet zo hoog was als MVP; de mRNA-kern alleen was echter ineffectief bij het stimuleren van IFN-b-secretie (Fig. 4A). Het resultaat impliceerde dat zowel mRNA als componenten in het vehikel nodig waren om de IFN-b-expressie te maximaliseren. In de tussentijd vertoonden imiquimod en vehikel vergelijkbare activiteit bij het bevorderen van de expressie van TNF-a en IL-1b, terwijl MVP veel krachtiger was dan elk van beide (Fig. 4B en C). Expressie van CCL5, een cytokine dat gewoonlijk wordt geassocieerd met NF-kB- en IFN-regulerende factoren, werd op gelijke wijze gestimuleerd in cellen die werden behandeld met imiquimod, alleen vehikel of MVP (Fig. 4D). TLR7, MAVS, STING en TRIF zijn sleutelfactoren in belangrijke signaaltransductieroutes die cellulaire reacties op viraal RNA en beschadigd DNA mediëren28e30. We genereerden BMDC's van muizen met Tlr7-, Mavs-, Sting- of Trif-gen knock-out (KO) en behandelden cellen met mRNA-kern, mRNA-vrij vehikel of in mRNA ingekapseld MVP om IFN-b- en TNF-a-expressie te onderzoeken.

Figuur 2 Stimulatie van immuunreacties door MVP. (A) Schematische weergave van mRNA/protamine-kern, mRNA-vrij voertuig en volledige MVP. (BeD) Rijping van BMDC's na 24 uur behandeling met OVA-MVP. (E en F) MHC I-expressie en OVA257e264-antigeenepitoop-MHC I-complex in BMDC's na 24 uur behandeling met OVA-MVP. (G) Niveau van IL-2 van behandelde BMDC's samen geïncubeerd met B3Z- of OT-IT T-cellen. (H en I) Flowcytometrieanalyse van proliferatieve T-cellen. Representatieve chromatogrammen van T-cellen worden getoond. (J) DC-rijping na MVP-behandeling in vivo. C57BL/6J-muizen werden behandeld met OVA-MVP en DC's in popliteale lymfeklieren werden geanalyseerd. (K en L) Analyse van de T-celpopulatie. C57BL/6J-muizen werden behandeld met vehiculum of OVA-MVP, en T-cellen in popliteale lymfeklieren werden geanalyseerd met flowcytometrie. (M) ELISpot-test. C57BL/6J-muizen werden behandeld met OVA-MVP en lymfeklieren werden op de aangegeven tijdstippen verzameld. Geïsoleerde cellen werden toegepast voor de meting van cellen die IFN-g tot expressie brengen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde SEM (nZ 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,005; ****P < 0,001; ns, niet significant.

Figuur 3 Antitumoractiviteit van MVP. (A) Remming van MC38-OVA-tumorgroei. Vrouwelijke C57BL/6J-muizen werden subcutaan geïnoculeerd met 5  105 MC38-OVA-tumorcellen/muis op dag 0 en behandeld met PBS-controle, vehikelcontrole, GFP-MVP of OVA-MVP op Dagen 3 en 10. (B) Remming van de groei van B16-OVA-tumoren. Vrouwelijke C57BL/6J-muizen werden subcutaan geïnoculeerd met 2  105 B16-OVA-tumorcellen/muis op dag 0 en behandeld met PBS-controle, vehikelcontrole, GFP-MVP of OVA-MVP op dag 3 en 10. (C en D) Beeld en gewicht van B16-OVA-tumoren op dag 17. (E) T-celpopulatie in tumoren van muizen na de behandeling. (FeH) IFN-gþCD8þ T-cellen in milten, lymfeklieren (LN) en tumoren van muizen na de behandeling. (I) OVA-specifieke CD8þ T-cellen in tumoren van muizen na de behandeling. (JeM) Afbeeldingen en kwantitatieve analyse van ELISpot-test van milt- en LN-cellen van muizen na de behandeling. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde SEM (nZ 5). *P < 0.05; **P <0,01; ***P <0,005; ****P < 0,001.

De KO-status van Mavs en Sting in BMDC's werd bevestigd met Western-blot-analyse (ondersteunende informatie Fig. S5A). Verrassend genoeg vernietigde Sting KO de stimulerende activiteit op IFN-b-secretie van zowel vehikel alleen als MVP (Fig. 4E), wat aangeeft dat MVP type I IFN-expressie activeerde via STING. Om dit idee te ondersteunen, hebben we fosforylering van tankbindend kinase 1 (TBK1) gedetecteerd (Fig. S5B), een kinase die vaak wordt geassocieerd met STING-activiteit . Bovendien was deze route onafhankelijk van TLR7-signalering, omdat IFN-b-expressie niet werd aangetast in cellen die werden behandeld met imiquimod (Fig. 4E). Ter vergelijking: Trif of Mavs KO hadden een minimale impact op de IFN-b-expressie gepromoot door MVP. Zoals verwacht was imiquimod niet effectief bij het stimuleren van IFN-b-secretie in BMDC's afgeleid van Tlr7 KO; Tlr7 KO had echter een negatieve invloed op het stimulerende effect van MVP (Fig. 4E). Interessant genoeg werd bij dezelfde behandelingen een ander profiel waargenomen op de TNF-a-secretie. Knock-out van Sting, Trif of Tlr7 had geen tot minimale impact op de door MVP gestimuleerde cytokine-expressie. Aan de andere kant verlaagde de knock-out van Mavs de TNF-a-niveaus dramatisch in cellen die werden behandeld met alleen vehikel of MVP (Fig. 4F). Het resultaat geeft aan dat MAVS een belangrijke regulator is van TNF-a-expressie in DC's na MVP-behandeling.

3.5. MVP stimuleert STING- en MAVS-routes om de uitscheiding van IFN-I en inflammatoire cytokines te bevorderen

Om componenten in het voertuig te identificeren die verantwoordelijk zijn voor het stimuleren van STING- en MAVS-signalering, hebben we voertuigen en MVP's voorbereid door belangrijke componenten te vervangen of weg te laten en deze toe te passen om BMDC's te behandelen. De Sting-agonist cyclisch GMP-AMP (cGAMP) diende als een positieve controle bij het stimuleren van de IFN-b-secretie. Door het kationische lipide EDOPC in het voertuig te vervangen door een ander positief geladen lipide, DOTAP, werd de IFN-b-secretie volledig weggevaagd. Ter vergelijking: het stimulerende effect van het vehikel en MVP bleef behouden met of zonder protamine, en een dergelijke stimulerende activiteit was afhankelijk van een intact Sting-gen (Fig. 4G). Interessant is dat BMDC's behandeld met individuele componenten van de lipidenschil, waaronder EDOPC, geen sterke IFN-b-secretie bevorderden (Ondersteunende informatie Fig. S6). EDOPC was dus essentieel voor STING-activering, en de activiteit ervan is afhankelijk van de vorming van een lipide-nanodeeltje (dwz vehikel of MVP). Vehikel en MVP bereid met EDOPC of DOTAP werden ook toegepast voor de behandeling van BMDCS afgeleid van wildtype en Mavs KO-muizen, en TNF-niveaus in celgroeimedia werden bepaald. Zoals verwacht elimineerde het vervangen van EDOPC door DOTAP of DOPC de stimulerende inspanning van het voertuig en de MVP. Bovendien was het TNF-a-niveau significant verlaagd in Mavs KO-cellen vergeleken met wildtype cellen, maar niet verminderd (Fig. 4H), wat erop wijst dat aanvullende factoren betrokken kunnen zijn bij het mediëren van door MVP gestimuleerde TNF-a-expressie.

3.6. De STING-route is essentieel voor MVP-gemedieerde antitumor-immuunreacties

Zowel wildtype- als knock-outmuizen werden behandeld met in OVA-mRNA ingekapseld MVP, en DC-rijping en T-celproliferatie werden onderzocht. Sting KO verminderde het percentage CD80- en CD86þ DC-cellen en CD69þ T-cellen aanzienlijk (Fig. 5AeD). ELISpot-test onthulde significant verminderde IFN-g-producerende cellen in de milten en lymfeklieren van Sting KO-muizen vergeleken met wildtype muizen nadat ze waren behandeld met dezelfde dosis MVP (Fig. 5EeH). De impact van Mavs KO was minimaal, omdat er geen verschil werd waargenomen op CD44þCD8þ geheugen-T-cellen, OVA257e264-MHCI dextrameer-positieve CD8þ T-cellen, of het aantal IFN-g-producerende cellen in de lymfeklieren vergeleken met wild- type muizen (Fig. 5IeL). Het resultaat versterkt het idee dat er naast MAVS nog andere factoren betrokken kunnen zijn bij door MVP gestimuleerde inflammatoire cytokine-expressie. Zowel wildtype- als Sting KO-muizen werden toegepast om B16-OVA-tumoren te inoculeren, en muizen werden behandeld met PBS-controle of met OVA-mRNA ingekapseld MVP. Flowcytometrie-analyse van lymfeklier- en tumormonsters verzameld van gevaccineerde muizen onthulde een significant verminderd aantal IFN-g-producerende CD8-T-cellen in de Sting KO-muizen (Fig. 6A en B). Als resultaat werd de tumorgroei volledig geremd bij wildtype muizen behandeld met MVP, vergeleken met slechts gedeeltelijke remming bij de Sting KO-muizen (Fig. 6C).

cistanche plantverhogend immuunsysteem

Klik hier om de producten van Cistanche Enhance Immunity te bekijken

【Vraag om meer】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats-app: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Discussie

In de huidige studie hebben we systematisch de functionele rol van individuele componenten in de MVP bij het stimuleren van antitumorimmuunreacties onderzocht. Ons celgebaseerde onderzoek heeft duidelijk aangetoond dat zowel mRNA-moleculen als het RNA-vrije vehiculum in MVP nodig zijn voor de volledige activiteit ervan bij het bevorderen van de expressie van IFN-b en een aantal inflammatoire cytokines, waaronder IL-1b en TNF. -a in dendritische cellen. Van dergelijke cytokinen is aangetoond dat ze een essentiële rol spelen bij de activering van dendritische cellen en de door vaccins gemedieerde antitumorimmuniteit . Onze studie heeft ook onthuld dat stimulatie van de cytokineproductie afhankelijk is van een aantal belangrijke signaaltransductieroutes die betrokken zijn bij aangeboren immuundetectie, waaronder die gemedieerd door STING en MAVS. Hoewel STING essentieel is voor IFN-b-expressie, is MAVS voornamelijk betrokken bij het reguleren van TNF-a-expressie (Fig. 6D). Het belang van STING-signalering op MVP-gemedieerde antitumorimmuniteit wordt verder aangetoond door verminderde T-celactiviteit en dientengevolge gecompromitteerde remming van de tumorgroei bij Sting KO-muizen. Dit resultaat komt overeen met andere rapporten dat STING-activatie de cytotoxische T-cel-gemedieerde antitumorimmuniteit bepaalt32. MAVS is een belangrijke intermediair in de RIG-I-receptor (RLR)-signalering als reactie op virale infectie. Activering van deze route leidt tot een cascade van ontstekingsreacties33. Het is intrigerend dat de T-celactiviteit niet wordt aangetast in Mavs KO-muizen, gegeven het feit dat de MAVS-signalering duidelijk een grote rol speelt bij het reguleren van de expressie van inflammatoire cytokines, waaronder TNF-a. Een mogelijke reden is dat stimulatie van dergelijke cytokines door MVP wordt gemedieerd door meerdere routes, en verstoring van de MAVS-route reduceert de cytokine-expressie niet tot een niveau dat laag genoeg is om een ​​significante impact te veroorzaken. Als alternatief wordt het verlies van MAVS-signalering gecompenseerd door de andere routes. Verdere studies zijn nodig om deze routes te identificeren om het werkingsmechanisme van het MVP-vaccin verder te begrijpen. Hoewel TLR7 van oudsher in verband wordt gebracht met mRNA-therapieën21, lijkt de TLR7-signalering geen belangrijke rol te spelen bij het mediëren van MVP-activiteit. De toepassing van volledig gemethyleerde mRNA-moleculen in het huidige onderzoek heeft de TLR7-signalering mogelijk minder relevant gemaakt. Het is goed aangetoond dat RNA-methylering de herkenning door de TLR's onderdrukt. TRIF is een sleuteladaptereiwit voor TLR3/7/8-signalering28. Knock-out van Trif heeft ook geen invloed op de MVP-activiteit, wat het idee versterkt dat de bovengenoemde TLR's, waaronder TLR7, geen belangrijke rol spelen bij het mediëren van cellulaire reacties op MVP. Bij de ontwikkeling van kankervaccins zijn meerdere Sting-agonisten toegepast, waaronder cyclische dinucleotiden en kleine en grote moleculaire verbindingen34e37. Dergelijke Sting-agonisten moeten tijdens de vaccinbereiding als externe adjuvantia worden toegevoegd, wat een extra laag complexiteit aan de vaccinsamenstelling toevoegt. Bovendien kan de extern toegevoegde Sting-agonist ongewenste bijwerkingen veroorzaken zodra deze zich afscheidt van het mRNA-complex. Ter vergelijking: onze MVP dient als zelfadjuvans en werkt in de context van een kankervaccin, aangezien geen van de individuele componenten van het vaccin, inclusief EDOPC, cytokine-expressie kan bevorderen. Interessant genoeg kan het kationische fosfolipide EDOPC niet worden vervangen door het niet-fosfolipide DOTAP, dat ook positief geladen is. Het is intrigerend om te speculeren over het mogelijke mechanisme voor het verschil tussen deze twee kationische lipiden. Er is echter gedocumenteerd dat andere eigenschappen van een lipidemolecuulcomponent, zoals hydrofobiciteit, een diepgaande invloed kunnen hebben op de algehele functie van een nanodeeltje en de werkzaamheid ervan voor nucleïnezuren. Er moet dus voorzichtigheid worden betracht bij het selecteren van de juiste moleculen om een ​​volledig functioneel mRNA-vaccin te bereiden. Samenvattend hebben we een krachtig, op mRNA gebaseerd therapeutisch kankervaccin ontwikkeld en individuele componenten met hun functionaliteit aan het vaccin toegewezen. Het werkingsmechanisme ervan verschilt nogal van andere mRNA-platforms die worden gebruikt voor profylactische en therapeutische interventies. De kennis uit de huidige studie zal zeker de toekomstige ontwikkeling van aanvullende mRNA-therapieën bepalen.

Figuur 4 Bevordering van aangeboren immuunreacties door MVP. (AeD) BMDC's behandeld met 1 mg/ml imiquimod, 1 mg/ml mRNA-equivalente kern, vehiculum of MVP gedurende 24 uur. IFN-b-, TNF-a-, IL-1b- en CCL5-niveaus werden gemeten met ELISA. (E en F) IFN-b- en TNF-a-expressie van BMDC's afgeleid van wildtype en gen-knock-out (KO) muizen. BMDC's werden 24 uur behandeld met de aangegeven reagentia. IFN-b en TNF-a werden gemeten met ELISA. (G) IFN-b in BMDC's afgeleid van wildtype en Sting knock-out muizen. BMDC's werden gedurende 24 uur behandeld met 20 mg/ml cGAMP, 1 mg/ml mRNA-equivalente kern, vehiculum of MVP. Voertuig (DOTAP): voorbereid door EDOPC te vervangen door DOTAP; vehiculum (zonder protamine): bereid door protamine weg te laten. ND: niet detecteerbaar. (H) TNF-a in BMDC's afgeleid van wildtype en Mavs knock-out muizen. BMDC's werden gedurende 24 uur behandeld met 1 mg/ml mRNA-equivalente kern, vehiculum of MVP. Voertuig (DOTAP): voorbereid door EDOPC te vervangen door DOTAP; voertuig (DOPC): bereid door EDOPC te vervangen door DOPC. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde SEM (nZ 3). ***P < 0.005; ****P < 0,001; ns, niet significant.

Figuur 5 Antitumor-immuunreacties bij Sting- en Mavs-knock-outmuizen. (AeD) Verminderde DC- en T-celactivatie bij Sting-knock-outmuizen. Zowel wildtype- als Sting-knock-outmuizen werden behandeld met in OVA-mRNA ingekapseld MVP, en lymfeklieren werden 48 uur later verzameld voor DC- en T-celmeting. (EeH) Verminderde T-cellen die IFN-g tot expressie brengen in de milt en lymfeklieren van Sting-knock-outmuizen. Er worden zowel afbeeldingen van vlekken als kwantitatieve analyses getoond. (IeL) Geen invloed op de T-celactiviteit bij Mavs-knock-outmuizen. Zowel wildtype- als Mavs-knock-outmuizen werden behandeld met PBS-controle of OVA-mRNA-ingekapselde MVP, en lymfeklieren werden 48 uur later verzameld voor meting van CD44þCD8þ geheugen-T-cellen (I), OVA257e264-MHCI dextrameer-positieve CD8þ T-cellen (J) en aantal IFN-g-producerende cellen (K en L). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde SEM (nZ 3 of 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,005; ****P < 0,001; ns, niet significant.

Figuur 6 Steekafhankelijke antitumorimmuniteit. (A en B) Analyse van T-cellen die IFN-g tot expressie brengen in lymfeklieren en tumorweefsels nadat wildtype en Sting knock-out muizen met B16-OVA-tumoren werden behandeld met in OVA-mRNA ingekapseld MVP. Muizen werden behandeld op dag 3 en 10, en lymfeklieren en tumoren werden verzameld op dag 15. Afzonderlijke cellen werden geanalyseerd met flowcytometrie. (C) Remming van tumorgroei bij wildtype en Sting knock-out muizen. Muizen werden op dag 3 en 1 behandeld met PBS-controle of MVP0. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde SEM (nZ 5). *P <0,05; ****P < 0,001; ns, niet significant. (D) Schematische weergave van MVP-stimulatie van signaaltransductieroutes die leiden tot cytokineproductie in DC's. Hoewel stimulatie van IFN-b-expressie uitsluitend wordt gemedieerd door STING, zijn er meerdere factoren, waaronder MAVS, die TNF-a- en IL-1b-expressie mediëren.

Referenties

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ, et al. Werkzaamheid van het mRNA-1273 SARS-CoV-2-vaccin na voltooiing van de geblindeerde fase. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, et al. Veiligheid en werkzaamheid van een derde dosis BNT162b2 Covid-19-vaccin. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Doffe SF. Het overwinnen van cellulaire barrières voor RNA-therapieën. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hoop MJ. Lipidennanodeeltjessystemen voor het mogelijk maken van gentherapieën. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP, et al. Lipopolyplex versterkt de antitumorimmuniteit van op mRNA gebaseerde vaccinatie. Biomaterialen 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P, et al. Systemische levering van gemodificeerd mRNA dat codeert voor herpes simplex virus 1 thymidinekinase voor gerichte kankergentherapie. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC, et al. Systemische RNA-aflevering aan dendritische cellen maakt gebruik van antivirale verdediging voor immunotherapie tegen kanker. Natuur 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L, et al. Virus-nabootsend mRNA-vaccin voor de behandeling van kanker. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA-vaccins nieuw tijdperk in de vaccinologie. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, et al. CAR T-cellen worden in vivo geproduceerd om hartletsel te behandelen. Wetenschap 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. Is er in het tijdperk van mRNA-vaccins enige hoop op een functionele HIV-genezing? Virussen 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T, et al. Een niet-inflammatoir mRNA-vaccin voor de behandeling van experimentele auto-immuunencefalomyelitis. Wetenschap 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. mRNA-vaccin voor immunotherapie tegen kanker. Mol Kreeft 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K, et al. mRNA bij immunotherapie tegen kanker: meer dan een bron van antigeen. Mol Kreeft 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M, et al. Gepersonaliseerde RNA-mutanoomvaccins mobiliseren polyspecifieke therapeutische immuniteit tegen kanker. Natuur 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M, et al. Een RNA-vaccin stimuleert de immuniteit bij met checkpointremmers behandeld melanoom. Natuur 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C, et al. Actief gepersonaliseerde vaccinatieproef voor nieuw gediagnosticeerd glioblastoom. Natuur 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, et al. Immunotherapie tegen kanker. Een dendritische celvaccin vergroot de breedte en diversiteit van melanoom-neoantigeen-specifieke T-cellen. Wetenschap 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, et al. Neoantigeenvaccin genereert intratumorale T-celreacties in fase Ib-glioblastoomonderzoek. Natuur 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H, et al. Synergetische activering van antitumorimmuniteit door een deeltjesvormig therapeutisch vaccin. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. Een aangeboren betekenis geven aan de adjuvansiteit van mRNA-vaccins. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, et al. Op boodschapper-RNA gebaseerde vaccins met dubbele activiteit induceren gebalanceerde TLR-7-afhankelijke adaptieve immuunreacties en zorgen voor antitumoractiviteit. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Onderdrukking van RNA-herkenning door Toll-achtige receptoren: de impact van nucleosidemodificatie en de evolutionaire oorsprong van RNA. Immuniteit 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L, et al. IL-1 en IL-1ra zijn belangrijke regulatoren van de ontstekingsreactie op RNA-vaccins. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M, et al. Mechanismen van aangeboren en adaptieve immuniteit tegen het PfizerBioNTech BNT162b2-vaccin. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. De vervanging van helperlipiden door geladen alternatieven in lipide-nanodeeltjes vergemakkelijkt gerichte afgifte van mRNA aan de milt en longen. J Controle-uitgave 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA, et al. Klein interfererend RNA voor de behandeling van kanker: hindernissen bij de bevalling overwinnen. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Type I interferonrespons en aangeboren immuundetectie van kanker. Trends Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Mitotische progressie na DNA-schade maakt patroonherkenning binnen micronuclei mogelijk. Natuur 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, et al. DNA-schade stimuleert het type I interferonsysteem via de cytosolische DNA-sensor STING om de antimicrobiële aangeboren immuniteit te bevorderen. Immuniteit 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. De helicase DDX41 detecteert intracellulair DNA dat wordt gemedieerd door de adapter STING in dendritische cellen. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH, et al. De omvang van de therapeutische STING-activatie bepaalt de door CD8 T-cellen gemedieerde antitumorimmuniteit. Celvertegenwoordiger 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Patroonherkenning en signaalmechanismen van RIG-I en MDA5. Voor Immunol 2014; 5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, et al. Met STING-agonisten geformuleerde kankervaccins kunnen gevestigde tumoren genezen die resistent zijn tegen PD-1-blokkade. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE, et al. Directe activering van STING in de micro-omgeving van de tumor leidt tot krachtige en systemische tumorregressie en immuniteit. Celvertegenwoordiger 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, et al. Levering van mRNA-vaccins met heterocyclische lipiden verhoogt de antitumorefficiëntie door STING-gemedieerde activering van immuuncellen. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y, et al. Een STING-activerend nanovaccin voor immunotherapie tegen kanker. Nat Nanotechnologie 2017;12:648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Transfectieactiviteit van binaire mengsels van kationische o-gesubstitueerde fosfatidylcholinederivaten: de hydrofobe kern moduleert sterk de fysische eigenschappen en de werkzaamheid van DNA-afgifte. Biofysica J 2006;91:3692e706.