Anti-veroudering -Klotho-gen-geactiveerde scaffold bevordert verjongende wondgenezingsreactie in stamcellen afkomstig van menselijk vet

3. Discussie

Deze studie was gericht op het onderzoeken van de functionele impact van een anti-aging -Klotho-gen-geactiveerde scaffold op menselijke ADSC's voor verbeterde toepassingen voor wondgenezing. Over het algemeen ontdekten we dat het gen-geactiveerde schavot gecontroleerde activering van de regeneratieve vermogens van ADSC's biedt, zoals weergegeven in figuur5. Met name de gen-geactiveerde scaffold verbeterde tijdelijk de stamheid van ADSC's door de activering van transcriptiefactor Oct-4. De gen-geactiveerde scaffold bevorderde ook de vroege activering van het antifibrotische gen TGF- 3, een cruciale factor voor gecontroleerde genezing met minder littekens. Bovendien controleerden de geactiveerde ADSC's in de tijd endotheliale angiogenese en ondersteunden ze genezing van dermale fibroblasten door middel van paracriene signalering. Op weg naar rijping controleerden de ADSC's ook de activering van pro-fibrotische respons in de dermale fibroblasten. Ondertussen regenereerden de ADSC's op het gen-geactiveerde schavot effectief het dermale basaalmembraan door de afzetting van laminine en collageen IV te verbeteren. Deze reactie werd verder geassocieerd met een verminderde litteken-geassocieerd -SMA-eiwitexpressie en verbeterde kwalitatieve elastinematrixafzetting. Onze studie heeft collectief vastgesteld dat de -Klotho-gen geactiveerdCistanchebeschikt over een enorm potentieel voorwond genezenen kongeavanceerde op stamcellen gebaseerde therapie voor verjongende genezingstoepassingen.

Figuur 5. Een schematische weergave van de functionele impact van door het B-Klotho-gen geactiveerde scaffold op menselijke ADSC's voor toepassingen bij wondgenezing. De belangrijkste bevindingen van deze studie zijn de (1) voorbijgaande versterking van stamcelpluripotentie en antifibrotische respons, (2) verbeterde paracriene controle richting angiogenese, en pro-fibrotische collageenremodellering in dermale fibroblasten en uiteindelijk (3) verhoogde rijping van het basismembraan met controle over litteken-geassocieerde eiwittenexpressie Stippellijnen voor elastinematrix impliceert verbeterde kwalitatieve afzetting.

Klik hier om te weten hoe CistancheWondgenezing Effecten

Bij strategieën voor wondgenezing wordt op plasmiden gebaseerde gentherapie toegepast om de cellulaire respons tijdelijk te versterken totdat het wondherstel voltooid is [37]. Onze gen-geactiveerde scaffold laat ook zien dat het therapeutisch is -Klotho-gen wordt gedurende 14 dagen tijdelijk gereguleerd. De aanzienlijk verbeterde (170-voudige) uitdrukking van de -Klotho-mRNA op dag 3 zou kunnen worden toegeschreven aan de onmiddellijk vroege CMV-promoter waarvan bekend is dat deze de transcriptionele activering van het gecodeerde transgen verbetert [38]. In de MSC's zou de CMV echter DNA-methylatie of histon-deacetylering kunnen ondergaan die de transgenexpressie kan verminderen [39]. Bovendien zijn de plasmiden over het algemeen niet-replicerende episomen, waardoor de overdracht van transgen naar delende cellen wordt beperkt en de transgenexpressie in de loop van de tijd afneemt.40]. De aanwezigheid van heterochromatische markers afkomstig van de bacteriële sequenties van deplasmide zou transgenexpressie verder kunnen onderdrukken [41], die in het algemeen bijdragen aan een voorbijgaande genexpressie.

Een van de pistes die wordt nagestreefd bij de behandeling van moeilijk te genezen wonden, is de toepassing van bioactieve scaffolds met celzaden. Een reden is hun vermogen om snel wondherstel te bevorderen. Metabolisch actieve cellen in het transplantaat scheiden paracriene factoren uit en ondergaan differentiatie, waarbij ze de complexe signaleringsgebeurtenissen in de wondomgeving orkestreren [42]. Met name stamcellen hebben een uniek vermogen om externe prikkels waar te nemen en hun reactie te moduleren om de homeostase te herstellen [43]. Stamcellen verliezen echter hun stamkracht wanneer ze in vitro worden geëxpandeerd om grote aantallen cellen voor het transplantaat te genereren. Onze studie toont aan dat de stamheid tijdelijk kan worden verbeterd met behulp van een gen-geactiveerde scaffold die een anti-verouderingsgen draagt -Klotho. We merkten met name op dat het anti-verouderingsgen-geactiveerde scaffold de expressie van het stamness-gen Oct-4 in de ADSC's verhoogde. Oct-4 is een van de sleuteltranscriptiefactoren in embryonale stamcellen en is essentieel voor gecontroleerde embryonale ontwikkeling [44]. In de ADSC's kan de activering van het Oct-4-gen hun proliferatie- en differentiatiepotentieel bevorderen [45]. De verhoogde expressie van Oct-4 kan dus een snelle differentiatie van de ADSC's op het gen-geactiveerde scaffold in gastheercellen vergemakkelijken en helpen bij het genezingsproces.

Nadat we de activering van het Oct-4-gen in de ADSC's hadden waargenomen, hebben we vervolgens de angiogene potentie van de ADSC's beoordeeld. Angiogenese is cruciaal voor de efficiënte integratie van het transplantaat met het gastheerweefsel [46]. Cellen in het transplantaat triggeren angiogenese door de secretie van paracriene factoren. Angiogenese is ook een cruciale gebeurtenis voor de ontwikkeling van granulatieweefsel en de activiteit ervan neemt af naarmate het granulatieweefsel rijpt [47]. Deze geprogrammeerde beperking van de angiogene activiteit in de latere stadia van de genezing is essentieel voor het beheersen van littekens en hypergranulatie die re-epithelisatie kunnen belemmeren [48]. Onze bevinding toont ook aan dat de ADSC's op het gen-geactiveerde scaffold endotheliale kieming kunnen verbeteren en hun groei kunnen beheersen door middel van paracriene signalering. Bovendien demonstreren de significante toenames in de metabole activiteit en kieming van de endotheelcellen als reactie op dag 3 CM het potentieel van de met ADSC's beladen gen-geactiveerde scaffold om snel te integreren met het gastheerweefsel. Bovendien is het gebruik van CM-stamcellen een algemeen aanvaarde celvrije benadering om de kwaliteit van wondgenezing te verbeteren [49]. Als beperking erkennen we dat volwassen dermale endotheelcellen een beter celmodel zouden dienen voor het bestuderen van angiogenese; om echter consistent te blijven met onze eerdere studies en de HUVEC's die algemeen worden aanvaard als de "gouden standaard" celkandidaat [50] hebben we de HUVECs-angiogenese-assay overgenomen.

Een toename van de fibroblastremodelleringsactiviteit is een algemeen kenmerk van rijping van granulatieweefsel [51]. Tijdens deze fase worden de collageen III-matrices geleidelijk vervangen door sterkere collageen I-vezels [51]. Collageenvezels bevorderen dan wondcontractie [52], en wondcontractie is onmisbaar voor volledige wondsluiting [53]. Een agressieve, aanhoudende toename van de afzetting van collageen I kan de littekenvorming echter vergroten [54]. Het beheersen van littekens is cruciaal omdat het de ontwikkeling van andere huidaanhangsels zoals haarzakjes, talgklieren en zweetklieren kan remmen, bijvoorbeeld in brandwonden [54]. Onze bevinding toont aan dat de bejaarde (dag 14) CM van de gen-geactiveerde scaffold-groep de expressie van pro-fibrotisch collageen I in volwassen dermale fibroblasten zou kunnen beheersen. Dit gecontroleerde effect op de fibroblasten trad op zonder verdere invloed op de migratie van de fibroblasten of hun anti-fibrotische collageen III-expressies ten opzichte van de genvrije steigergroep. Daarom suggereren we dat de met ADSC's beladen gen-geactiveerde scaffold betere controle kan bieden bij het beperken van littekens in vivo door middel van gecontroleerde collageen I-expressie. Li et al. hebben ook aangetoond dat de ADSC's CM de expressie van collageen I aanzienlijk kunnen verminderen in fibroblasten die zijn afgeleid van hypertrofische littekens [55]. Een andere studie door Wang et al. toonde een vergelijkbare vermindering van collageen I-expressie aan in keloïde-afgeleide fibroblasten [56], die gezamenlijk het antifibrotische potentieel van de CM van de ADSC's aantonen.

Een van de belangrijke bevindingen die we opmerkten bij de toepassing van de -Klotho-gen-geactiveerde scaffold is de verbeterde regeneratie van het basaalmembraan in de ADSC's. De regeneratie van het basismembraan is essentieel voor de rijping van bloedvaten en volledige re-epithelisatie [57,58]. Belangrijk is de trend waarin de eiwitten laminine[59]. Naast het werken als een anti-verouderingsfactor [60] functioneert de bèta-klotho om de gevoeligheid voor fibroblastgroeifactor (FGF) door FGF-receptoren te verbeteren [61]. Bovendien is gevonden dat een toename van FGF-signalering de rijping van de basaalmembraan bevordert door de afzetting van laminine en collageen IV [62]. Daarom, rekening houdend met de rol van beta klotho als een co-receptor van FGF, wordt de verhoogde rijping in de kelder in de gen-geactiveerde steigergroep mogelijk gemedieerd door een toename van de FGF-signalering van ADSC's.

De basismembraancomponent die opmerkelijk opgereguleerd is in de gen-geactiveerde scaffold-groep is het collageen IV-eiwit. Het collageen IV-eiwit vertegenwoordigt 50 procent van alle basaalmembranen [63] en zorgt voor structurele stabiliteit van het basaalmembraan [59]. Veroudering vermindert echter aanzienlijk de collageen IV-expressie in de dermale-epidermale overgang [58,64] en het ontbreken van collageen IV kan de pathogenese van littekens bevorderen [65]. Onze resultaten suggereren dus dat de verhoogde regeneratieve potentie van het basaalmembraan van het met ADSC's beladen gen-geactiveerde scaffold aanzienlijk kan helpen bij verbeterde genezing bij bejaarde patiënten. Andere studies hebben ook aangetoond dat van vetweefsel afgeleide ECM het enorme therapeutische potentieel bezit voor huidherstel [66]. Bovendien zijn weefsel-gemanipuleerde transplantaten rijk aan laminine en collageen IV ook van belang voor respiratoir epitheelherstel [67]. 

Naast de pro-fibrotische controle naar de fibroblasten, toont ons onderzoek verder aan dat de ADSC's in het gen-geactiveerde scaffold ook een 2-voudig lagere expressie van het litteken-geassocieerde eiwit tot expressie brengen -SMA % 5b68]. Hoewel we de impact ervan in vivo niet hebben geëvalueerd, is de vermindering van lokaal -SMA-expressie is cruciaal voor verbeterde kwalitatieve genezing [69]. Het gebruik van fibrotische middelen zoals bleomycine [70] zou een manier kunnen zijn om de antifibrotische eigenschappen van de ADSC's/gen-geactiveerde scaffoldconstructie in vitro beter te evalueren; onze focus lag echter op het vaststellen van het voorlopige therapeutische potentieel van het construct.

Een andere indicator dat de met ADSC's beladen gen-geactiveerde scaffold de kwalitatieve genezing kan verbeteren, is de afzetting van fibreuze elastinematrix in plaats van fragmentarische extracellulaire secreties in de genvrije scaffold-groep. Elastine-afzetting is een van de belangrijkste activiteiten die foetale littekenloze wondgenezing stimuleren [71]. Volwassen huiden missen echter de afzetting van elastine [71]. Als zodanig wordt tropoelastine, een voorloper van elastine, vaak opgenomen in scaffolds van biomateriaal om littekens bij wondgenezing te beheersen [72]. Alles bij elkaar impliceren onze bevindingen dat de ADSC's/ - Door het Klotho-gen geactiveerd scaffold-construct kan in vivo een sterke antifibrotische respons geven.

4. Materialen en methoden

4.1. Voorbereiding van gen-geactiveerde steiger

De gen-geactiveerde scaffold is ontwikkeld met behulp van een 2-stappenproces. Ten eerste werden stevige poreuze collageen-chondroïtinesulfaatsteigers vervaardigd door een vriesdroogslurry van runderpees type 1 collageen en chondroïtine-6-sulfaat afgeleid van haaienkraakbeen (Sigma, VK). Een geoptimaliseerd vriesdroogproces, ontworpen om uniforme poriën te creëren, werd gebruikt om de steigers te produceren [73]. Op basis van ons gepubliceerde protocol [74] werden de gevriesdroogde steigers vervolgens dehydrothermisch (DHT) behandeld bij 105◦C onder vacuüm voor sterilisatie en mechanische verbetering. De gesteriliseerde scaffolds werden vervolgens chemisch verknoopt met 14 mM N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride en 5,5 mM N-Hydroxysuccinimide (2,5 molaire verhoudingen van EDC/NHS) (Sigma, UK) oplossing om de mechanische stabiliteit verder verbeteren [75]. De verknoopte steigers werden vervolgens gewassen met PBS (Gibco, Paisley, VK) om resterende chemicaliën te verwijderen. Toen de scaffolds klaar waren, werden polyplexen met een N/P10-verhouding (stikstof-fosfaatverhouding) bereid door een vooraf bepaald volume vertakte polyethyleenimine (PEI)-oplossing te mengen met plasmide-DNA (pDNA) dat codeert voor het menselijke beta-Klothog-gen ( -Klotho), verkregen van SinoBiological, Beijing, China. De N/P10-verhouding werd gekozen op basis van onze eerdere studies waaruit bleek dat polyplexen geformuleerd met een N/P10-verhouding effectief kleine, stabiele kationische nanodeeltjes konden vormen met plasmiden zo groot als GLuc (5,76 kb) [21,23]. Voorafgaand aan gebruik werden de plasmiden verdund in endotoxinevrij water om een ​​werkconcentratie te verkrijgenvan 0.5µg/µL. Het plasmide bevat humaan verbeterd direct-vroeg cytomegalovirus(CMV3) promotor om stabiele en voorbijgaande expressie van het gecodeerde op hoog niveau te bevorderengen in zoogdiercellen.

Men liet het plasmide/PEI-mengsel gedurende 30 minuten bezinken om zichzelf te assembleren tot polyplexnanodeeltjes. De nanodeeltjes werden vervolgens door middel van pipetteren op de steigers geladengelijke volumes van de polyplex-oplossing per kant van de steiger. In totaal 2µg pDNA wasgebruikt per scaffold om de gen-geactiveerde scaffold te ontwikkelen.

4.2. Cell Seeding aan -Klotho-gen-geactiveerde steiger

Menselijke ADSC's (iXCells Biotechnologies, San Diego, CA, VS) werden uitgebreid tot passage 4 in het door het bedrijf geleverde ADSC-groeimedium (cat. nr. MD0003). In totaal 5× 105 ADSC's (2.5× 105 per kant) werden vervolgens gezaaid per genvrij scaffold (controle,n = 3) of door genen geactiveerd scaffold (test,n = 3). Nadat de cellen ongeveer 20 minuten hadden laten bezinken, werd 2 ml transfectiemedium OptiMEM (Gibco, VK) toegevoegd en werden de gecellulaire scaffolds geïncubeerd bij 37 °C.◦C gedurende 24 uur. Na de incubatie van 24 uur werden de cellulair gemaakte genvrije of gen-geactiveerde scaffolds overgebracht naar nieuwe 12-well-platen en gevoed met 2 ml ADSC-groeimedium. Mediawisseling werd vervolgens elke 3-4 dagen uitgevoerd tot dag 14 door 1 ml van de geconditioneerde media (CM) te verzamelen en deze te vervangen door een gelijk volume verse media. Alle CM werden opgeslagen bij−80 ◦C tot analyse.

4.3. qRT-PCR-analyses om te bepalen -Klotho Gene Overexpressie en activering van functionele genen

Om de tijdelijke regulatie van de doelwitgenen te bepalen, werden cellen geoogst op dag 3 (vroeg) en 14 (laat) na het zaaien op de genvrije of gen-geactiveerde scaffolds. De cellen werden eerst gelyseerd met behulp van het Qiazol-lysisreagens (Qiagen, Germantown, MD, VS). Vervolgens werd chloroform toegevoegd om het cellysaat te scheiden in eiwit-, DNA- en RNA-fasen. Met behulp van de RNeasy Kit (Qiagen, Manchester, VK) werd het RNA geëxtraheerd en hun kwaliteit en kwantiteit werden bepaald met behulp van een Multiskan Go-plaatlezer (Thermo Scientific, VK) met de absorptie ingesteld op 260 nm. Genomisch DNA werd vervolgens verwijderd door het RNA te mengen met een genomisch DNA-uitwisbuffer (Qiagen, Manchester, VK) en te verwarmen tot 42°C.◦C gedurende 2 minuten. Vervolgens werd reverse transcriptie uitgevoerd om het cDNA te bereiden. Duplicaten van cDNA per replicaat (n = 3) werden in de qRT-PCR-platen geladen en vervolgens werd de assay uitgevoerd met behulp van de primers vermeld in tabel1. Vouwverandering in mRNA-expressie ten opzichte van de cellen op het genvrije schavot werd berekend met behulp van de 2−∆∆CTmethode van gemiddelden van drie herhalingen per groep. Menselijke GAPDH (Hs_GAPDH_1_SG, cat. nr. QT00079247) werd gebruikt als het huishoudgen.

4.4. Bioactiviteitsanalyses van uitgescheiden factoren vanaf de ADSC's -Klotho-gen-geactiveerde steiger

4.4.1. Pro-angiogene bioactiviteitsanalyses

4.4.2. Analyses van genezing en rijping van dermale fibroblasten

Na de angiogenese-assay onderzochten we de potentie van de CM voor dermale genezing door gebruik te maken van een scratch-assay van menselijke volwassen dermale fibroblasten (iXcells, Cat nr. 10 HU-014). Voor deze studie hebben we specifiek de oude CM vanaf dag 14 gekozen om de invloed ervan op fibroblastwondsluiting tijdens rijping te bestuderen. In totaal 1× 104 cellen/putje in een 96-putjesplaat werden gezaaid en overnacht geïncubeerd in het fibroblast-groeimedium. De volgende dag werd een wond op de monolaag gemaakt door een pipetpunt van 200 µL horizontaal over het putje te krassen. De monolaag werd vervolgens gespoeld met PBS om eventueel vuil te verwijderen en gevoed met de CM. Wondsluiting werd geregistreerd tussen 12-16 uur na de kras. Immunokleuring werd gebruikt om de expressie van pro-fibrotisch collageen I (1:100, Novusbio, UK) en anti-fibrotisch collageen III (1:100, Novusbio, UK) in de fibroblasten te bestuderen. De fibroblasten werden tegengekleurd met rhodamine (1:800, Abcam, VK) voor beeldvorming met F-actine. Immunokleuring werd uitgevoerd zoals beschreven in Sectie4.5, met uitzondering van weefselbewerking en deparaffinisatie. Zowel HUVEC's als de fibroblasten werden gebruikt bij passage 4.

4.5. Immunofluorescentie Beeldvorming van extracellulaire matrixeiwitten

Na 14 dagen kweken werden de cellulair gemaakte genvrije of gen-geactiveerde scaffolds geoogst voor detectie van matrixafzetting met behulp van immunofluorescentie. De verwerking van de monsters werd uitgevoerd zoals eerder beschreven. In het kort werden de scaffolds eerst gewassen met PBS en gedurende 20 minuten gefixeerd in 10 procent neutraal gebufferde formaline. De gefixeerde monsters werden vervolgens verwerkt volgens het standaardprotocol voor deparaffinisatie. De blokken werden vervolgens in 7-µm dikke plakjes en verzameld op geladen objectglaasjes. De secties werden vervolgens gedeparaffineerd met behulp van xyleen, gevolgd door rehydratatie van de sectie met afnemende gradiënten van ethanol. Vervolgens werden de cellen permeabel gemaakt met 0,2 procent Tween®20 (Sigma-Aldrich, Frankrijk) oplossing in PBS gedurende 30 min (10 min wassen× 3) en geblokkeerd met 10 procent NGS (Normal Goat Serum, Invitrogen, Rockford, IL, VS)/5 procent BSA/0,3 M Glycine (bereid in permeabiliserende oplossing) gedurende 1 uur. Na het blokkeren werden de objectglaasjes gespoeld in PBS en vervolgens geïncubeerd bij 4◦C 's nachts met de antilichamen tegen doelmatrixeiwitten vermeld in tabel2. De volgende dag werden de objectglaasjes driemaal gedurende 2-3 minuten elk in PBS gespoeld om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen. Vervolgens werden de objectglaasjes geïncubeerd in Alexa 488-geconjugeerd geiten-antimuis-IgG (A32723, Invitrogen, VK) of Alexa 594-geconjugeerd geiten-anti-konijn-IgG (A11012, Invitrogen, VK) op 1: 800 verdunning bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. De spoelstap werd uitgevoerd zoals eerder en tegengekleurd voor kernen met behulp van het montagemedium met DAPI (ab104139, Abcam, VK). De dia's werden vervolgens afgebeeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Olympus BX43, Japan) bij 20× objectief. Monsters geïncubeerd met alleen secundaire antilichamen werden gebruikt als controles.

Afbeelding kwantificering

Image]-software (Image, NIH, MD, VS) werd gebruikt om semi-kwantitatief de hoeveelheid tot expressie gebrachte eiwitten te bepalen. Voor elke marker werd eerst een constante drempelwaarde bepaald door middel van voorlopige beeldvorming van verschillende secties. Met behulp van de ingestelde drempelwaarde werd de geïntegreerde dichtheid (gekleurd gebied x gemiddelde grijswaarde) van de beelden bepaald en vervolgens genormaliseerd naar het aantal cellen (DAPI-telling) om een ​​uiteindelijke gemiddelde fluorescentiedichtheid per cel te geven. Er werd een gemiddelde gekwantificeerd van 8-10 willekeurige afbeeldingen per herhaling met een minimum van drie herhalingen per groep. De gemiddelden verkregen van de drie herhalingen/groep werden vervolgens gebruikt voor het meten van de relatieve expressie tussen de groepen.

4.6. Statistische analyse

Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde plus standaarddeviatie. Ongepaarde, tweezijdige t-test werd over het algemeen gebruikt om de statistische significantie tussen groepen te berekenen, waarbij p < 0.05 als significant werd beschouwd

Dit onderzoek toonde aan dat deanti-veroudering -Klotho-gen-geactiveerde cistancheaanbiedingen gecontroleerd activering van het regeneratieve vermogen van ADSC's. De belangrijkste bevindingen van deze studie zijn de (1)voorbijgaande versterking van stamcelpluripotentie en antifibrotische respons, (2)verbeterde paracriene controle in de richting van angiogeneseen pro-fibrotische remodellering van collageenin dermale fibroblasten, en uiteindelijk (3)verhoogde rijping van het basaalmembraanmet controle over de expressie van litteken-geassocieerde eiwitten. Concluderend suggereren deze resultatendat de ADSC's beladen zijn -Klotho-gen-geactiveerde scaffold kan een groot potentieel hebbenbehandeling van een breed scala aan huidwonden.

middelen, ALL, FJO en MBK; datacuratie, ALL en MBK; schrijven -origineel ontwerpvoorbereidingactie, ALLES; schrijven - beoordelen en bewerken, ALL, FJO en MBK; visualisatie, ALLES; overzicht,FJO en MBK; projectadministratie, MBK; financiering acquisitie, FJO en MBK Alle auteurshebben gelezen en akkoord gaan met de gepubliceerde versie van het manuscript.

Belangenconflicten:De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict bestaat.

Referenties

1. Laiva, Alabama; O'Brien, FJ; Keogh, MB Innovaties in afleveringssystemen voor genen en groeifactoren voor diabetische wondgenezing.J. Weefsel Eng. Regen. Med.2018, 12, e296–e312. [KruisRef] [PubMed] 

2. Makrantonaki, E.; Wlaschek, M.; Scharffetter-Kochanek, K. Pathogenese van wondgenezingsstoornissen bij ouderen.JDDG J. Dtsch. Dermatol. Ges.2017, 15, 255–275. [KruisRef] [PubMed]

3. Ganguly, P.; El Jawhari, JJ; Burska, AN; Ponchel, F.; Giannoudis, PV; Jones, EA De analyse van in vivo veroudering in mesenchymale stromale cellen van het menselijk beenmerg met behulp van kolonievormende unit-fibroblast-assay en het CD45lowCD271 plus-fenotype.Stamcellen Int.2019, 2019, 5197983. [KruisRef] 

4. Westerweel, PE; Teraa, M.; Rafifii, S.; Jaspers, JE; Wit, IA; Hooper, AT; Verhaar, MC Verminderde mobilisatie van endotheliale voorlopercellen en disfunctioneel beenmergstroma bij diabetes mellitus.PLoS EEN2013, 8, e60357. [KruisRef] 

5. Murray, RZ; West, ZE; Cowin, AJ; Farrugia, BL Ontwikkeling en gebruik van biomaterialen als therapieën voor wondgenezing.Brandwond. Trauma2019, 

6. [KruisRef] [PubMed] 6. Ebrahimian, TG; Pouzoulet, F.; Squiban, C.; Burd, V.; André, M.; Neef, B.; Tamarat, R. Celtherapie op basis van van vetweefsel afgeleide stromale cellen bevordert fysiologische en pathologische wondgenezing.Arteriocler. Trom. vasc. Biol.2009, 29, 503–510. [KruisRef] 

7. Wu, Y.; Chen, L.; Scott, PG; Tredget, EE Mesenchymale stamcellen verbeteren wondgenezing door differentiatie en angiogenese.Stamcellen2007, 25, 2648–2659. [KruisRef] [PubMed] 

8. Foubert, P.; Gonzalez, AD; Teodosescu, S.; Bernard, F.; Doyle-Eisele, M.; Jekkala, K.; Fraser, JK Van vet afgeleide regeneratieve celtherapie voor genezing van brandwonden: een vergelijking van twee toedieningsmethoden.Adv. Wondverzorging2016, 5, 288–298. [KruisRef] [PubMed]

9. Assi, R.; Foster, TR; Hij, H.; Stamati, K.; Baai, H.; Huang, Y.; Dardik, A. Levering van mesenchymale stamcellen in biomimetisch gemanipuleerde scaffolds bevordert de genezing van diabetische ulcera.Regen. Med.2016, 11, 245–260. [KruisRef] [PubMed] 

10. Jiang, Y.; Chen, B.; Liu, Y.; Zhufu, Z.; Yan, X.; Hou, X.; Tan, Q. Effect van collageensteiger met van vetweefsel afgeleide stromale vasculaire fractiecellen op diabetische wondgenezing: een onderzoek in een diabetisch varkensmodel.Weefsel Eng. Regen. Med.2013, 10, 192–199. [KruisRef] 

11. Falanga, V.; Sabolinski, M. Een tweelagige levende huidconstructie (APLIGRAF®) versnelt de volledige sluiting van moeilijk te genezen veneuze ulcera.Wondherstel Regen.1999, 7, 201–207. [KruisRef] 12. Hart, CE; Loewen-Rodriguez, A.; Lessem, J. Dermagraft: gebruik bij de behandeling van chronische wonden.Adv. Wondverzorging.2012, 1, 138–141. [KruisRef] [PubMed] 13. Dinh, TL; Veves, A. De werkzaamheid van Apligraf bij de behandeling van diabetische voetulcera.Plast. herconstr. Surg.2006, 117, 152S–157S. [KruisRef] [PubMed]

14. Eaglestein, WH; Falanga, V. Tissue engineering en de ontwikkeling van Apligraf®, een equivalent van de menselijke huid.Clin. Daar.1997, 19, 894–905. [KruisRef] 

15. Jiang, T.; Xu, G.; Wang, Q.; Yang, L.; Zheng, L.; Zhao, J.; Zhang, X. In vitro verminderde expansie de stamheid van mesenchymale stamcellen in een vroege passage voor de behandeling van kraakbeendefecten.Celdood Dis2017, 8, e2851. [KruisRef] [PubMed]

16. Liu, J.; Ding, Y.; Liu, Z.; Liang, X. Senescentie in mesenchymale stamcellen: functionele veranderingen, moleculaire mechanismen en verjongingsstrategieën.Voorkant. Mobiele ontwikkelaar Biol.2020, 8, 258. [KruisRef] [PubMed] 

17. Wang, W.; Xu, X.; Li, Z.; Lendlein, A.; Ma, N. Genetische manipulatie van mesenchymale stamcellen door niet-virale genafgifte.Clin. Hemorheol. Microcirc.2014, 58, 19–48. [KruisRef] 

18. Deveza, L.; Choi, J.; Lee, J.; Huang, N.; Cooke, J.; Yang, F. Polymeer-DNA Nanodeeltjes-geïnduceerde CXCR4-overexpressie verbetert stamceltransplantatie en weefselregeneratie in een muis-hindlimb ischemiemodel.Theranostiek2016, 6, 1176–1189. [KruisRef] [PubMed] 

19. O'Brien, FJ Biomaterialen & steigers voor tissue engineering.zaak. Vandaag2011, 14, 88-95. 20. Yannas, ik.; Tzeranis, D.; Harley, B.; Dus, P. Biologisch actieve op collageen gebaseerde steigers: vooruitgang in verwerking en karakterisering.Philos. Trans. R Soc. Een wiskunde. Fysiek. Eng. Wetenschap.2010, 368, 2123–2139. [KruisRef] 

21. Laiva, AL; Raftery, RM; Keogh, MB; O'Brien, FJ Pro-angiogene impact van SDF-1 gen-geactiveerde op collageen gebaseerde scaffolds in stamcel-aangedreven angiogenese.Int. J. Pharm.2018, 544, 372–379. [KruisRef] [PubMed] 

22. Lackington, WA; Raftery, RM; O'Brien, FJ In vitro werkzaamheid van een gen-geactiveerde zenuwgeleidingsleiding waarin niet-virale PEI-pDNA-nanodeeltjes zijn opgenomen die genen dragen die coderen voor NGF, GDNF en c-Jun.Acta Biomater.2018, 75, 115–128. [KruisRef] 

23. Tierney, EG; Duffy, huisarts; Hibbitts, AJ; Cryan, SA; O'Brien, FJ De ontwikkeling van niet-virale gen-geactiveerde matrices voor botregeneratie met behulp van polyethyleenimine (PEI) en op collageen gebaseerde steigers.J. Controle. Uitgave2012, 158, 304–311. [KruisRef] [PubMed] 24. Laiva, AL; O'Brien, FJ; Keogh, MB SDF-1 gen-geactiveerde collageensteiger stimuleert functionele differentiatie van menselijke Schwann-cellen voor toepassingen bij wondgenezing.Biotechnologie. Bioeng.2021, 118, 725–736. [KruisRef] [PubMed]