Anti-verouderingspotentieel van substantie P-gebaseerde hydrogel voor een lange levensduur van de menselijke huid

Trefwoorden:substantie Cistanche; anti-verouderingseffect; ontstekingsremmende werking; opname door de huid; 3D menselijk huidmodel;cosmetisch ingrediënt

Klik hier om Cistanche voor een verouderde huid te krijgen

1. Inleiding

Veroudering van de huidtreedt op als gevolg van verschillende processen, waaronder interne (cellulaire stofwisseling, hormonale veranderingen en genetische mutatie) en externe factoren (gifstoffen, chemicaliën en ultraviolette (UV) straling) [1-3].Verouderde huidwordt biologisch gekenmerkt door een algemene achteruitgang van de componenten van de extracellulaire matrix (ECM), met gedesorganiseerd en verminderd collageen en elastine [4,5]. Bovendien, eeninflammatoir fenomeenis gewoonlijkgeïnduceerd in een ouder wordende huid, veroorzakenrimpels en verdikking van de dermisEnopperhuid. Pro-inflammatoire mediatoren die vrijkomen uit ontstekingscellenkan de activering van collagenasen, genaamd matrixmetalloproteïnasen (MMP's), versterken, wat leidt tot collageenafbraak [6-8]. De afgelopen dagen zijn veel anti-verouderingsmaterialen voorgesteld, die de mogelijkheid hebben om de collageensynthese te verbeteren. Een van de bekende materialen is de groeifactor. Groeifactoren zijn uitgebreid bestudeerd voor genezing van huidwonden [9]. Velen van hen, zoals van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (VEGF), epidermale groeifactor (EGF) en keratinocytgroeifactor, hebben rechtstreeks invloed op de collageensynthese via een netwerk van inter- en intracellulaire signaalroutes [9,10]. Topisch aangebrachte groeifactoren zijn echter niet erg nuttig geweest als anti-verouderingsmiddel vanwege hun grote moleculaire grootte, wat hun vermogen om het strakke stratum corneum te penetreren beperkt [11]. Naast groeifactoren zijn er ook veel anti-verouderingspeptiden met een laag molecuulgewicht ontwikkeld. Zo voorkomen palmitoyltripeptiden de afbraak van collageen door te interfereren met collageenreductie door collagenasen, zoals MMP1 en 3 [12]. Bovendien is aangetoond dat kopertripeptiden, de best onderzochte peptiden, de procollageensynthese stimuleren [13].

Hoewel verschillende onderzoeken de bevordering van collageensynthese hebben aangetoond door topisch aangebrachte groeifactoren en peptiden, is het enkele effect van collageensynthese, zonder een ontstekingsremmend effect, mogelijk niet voldoende om de antiverouderingsprestaties klinisch te verbeteren. Voor meer voor de hand liggende effecten moet de verbinding in de diepe lagen van de huid worden aangebracht. Daarom is er een grote behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe materialen, die de dubbele functie hebben van collageensynthese en ontstekingsremmende effecten, samen met een verhoogde opname door de huid. substantie Cistanche (CP), een klein peptide bestaande uit 11 aminozuren, vertoont potentiële wondgenezingsactiviteit, uitgeoefend via inductie van celproliferatie, collageensynthese en ontstekingsremmende effecten [14-16]. De therapeutische toepassing van CP is echter beperkt door de lage stabiliteit, die de genezende eigenschappen ervan kan vertragen [17-19]. In onze vorige studie ontwikkelden we een nieuwe formulering van CP, bekend als CP-gel, die de stabiliteit van CP onder verschillende opslagomstandigheden verhoogt [20]. Naast de stabiliteit heeft CP-gel een effectievere wondgenezing laten zien dan alleen CP door de proliferatie van keratinocyten en fibroblasten te verbeteren. In het huidige werk hebben we de karakterisering van CP-gel uitgebreid en de bevordering van collageensynthese en ontstekingsremmende effecten voor anti-verouderingsprestaties aangetoond. Huidabsorptie en pigmentatie door CP-gel werden ook verder onderzocht. Onze bevindingen tonen het hogere antiverouderingspotentieel van CP-gel aan dan dat van CP alleen, met een verhoogd huidabsorptie-effect en dus een bredere cosmetische toepasbaarheid.

2. Resultaten

2.1. In-vitro-toxiciteit van CP-gel

Om de CP-gel van anti-verouderingstoepassing te maken, zouden hoge activiteiten gecombineerd met lage toxiciteit voor de menselijke huid wenselijk zijn. Daarom werd de in vitro toxiciteit van CP-gel geëvalueerd met behulp van menselijke dermale fibroblasten (HDF's) en een gereconstrueerde 3D menselijke huid, keraskin®-FT. Eerst hebben we de schadelijke effecten van CP-gel op celmembraan beoordeeld, met betrekking tot die van CP alleen, door lactaatdehydrogenase (LDH) -test met behulp van HDF's (Figuur 1A). De LDH-assay werd verder gebruikt, naast de eerdere 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay [20], voor een nauwkeurigere toxiciteitsmeting van CP-gel. De resultaten toonden aan dat noch CP-gel, noch CP alleen enige celmembraanbeschadiging vertoonden tegen HDF's bij alle geteste concentraties. Bovendien had behandeling met een vehiculum zonder CP geen effect op het celmembraan ten opzichte van een medium dat alleen PBS bevatte. Om de mogelijke irritatie van de menselijke huid als gevolg van de CP-gel verder te testen, hebben we de laatste, in verschillende concentraties, aangebracht op het huidmodel met volledige dikte, keraskin®-FT (Figuur 1B, C) gedurende in totaal 24 uur. Om de effecten op de levensvatbaarheid van weefsels te vergelijken, werd 5 procent natriumdodecylsulfaat (SDS), een bekend irriterend middel, als positieve controle gebruikt. CP-gel (1–10 µg/ml) was niet toxisch voor keraskin®-FT, zoals aangetoond door de MTT-assay (Figuur 1B), wat erop wijst dat er geen potentiële huidirritatie is in vergelijking met controle (PBS-behandeling). Bovendien bleek uit histologisch onderzoek dat de keraskin®-FT helemaal geen schade had opgelopen door CP-gel (Figuur 1C). Dezelfde resultaten werden verkregen in de groep die alleen met CP werd behandeld (Figuur S1). Op basis van deze resultaten werd geconcludeerd dat zelfs een hoge concentratie CP-gel (10 µg/ml CP) niet-toxisch was en geen huidirritatie veroorzaakte.

Figuur 1, Effect van substantie Cistanche (CP)-gel op de levensvatbaarheid van HDF's en in vitro gereconstrueerde 3D menselijke huid, keraskin@-FT.(A) Voor schadelijke effecten van CP-gelformulering op het celmembraan, werden HDF's behandeld met PBS (Con; controle), alleen CP of CP-gel (1-10 ug/ml) gedurende 24 uur, en de levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door middel van een LDH-assay. (B, C) Huidirritatie werd getest met behulp van CP-gel (1-10 ug/mL) op in vitro gereconstrueerde menselijke 3D-huid, keraskin@-pT. Weefsellevensvatbaarheid in de met CP-gel behandelde groep werd geanalyseerd met MTT-assay (B) en histologisch onderzoek (C), PBS werd gebruikt als controle en waarden vertegenwoordigen mear plus SD van drie onafhankelijke experimenten. Elke waarde werd vergeleken met de controle met behulp van Student'st-test (** p < 0.01). Schaalbalk=500 uhm. HDF, menselijke huidfibroblast; LDH, lactaatdehydrogenaseMTT, 3-(4.5-dimethylthiazol-2-vl)-2 .5-difenyltetrazoliumbromide: PBS, met fosfaat beboterde zoutoplossing SDS, natriumdodecyl sulfaat.

2.2. Effect van CP Gel op de productie van collageen

Om het effect van CP-gel op de collageensynthese op de huid te onderzoeken, werden HDF's behandeld met CP-gel. Onze resultaten toonden aan dat CP-gel, die 1–10 µg/ml CP bevat, significant (p < 0.01) de productie van procollageen type I verhoogde tot 128,05 ± 5,19, 145,19 ± 6,80 en 150,68 ± 16,70 procent, vergeleken met de controlebehandeling (PBS) (Figuur 2A). Anders, zoals weergegeven in figuur 2A, werd geen opmerkelijk verschil in type I collageenproductie waargenomen bij HDF's die alleen met 1 μg/ml CP werden behandeld. Hoewel CP alleen enig effect had op de collageenproductie bij concentraties van 5–10 µg/ml (119,96 ± 3,8 en 124,77 ± 8,87 procent), was dit effect significant (p < 0,01) lager dan met CP-gel.

Figuur 2. Collageenverhogende effecten van CP-gel in HDF's. Effecten van CP-gel op type 1 collageen (A)MMP-1 (B) en TIMP-1 (C) werden gemeten in HDF's. HDF's werden behandeld met alleen PBS (Con; controle)CP of CP-gel (1-10 ug/mL) gedurende 24 uur, en de expressie van het type [procollageen, MMP-1 en TIMP{{8 }}werd gemeten met respectievelijk de Procollagen Type IC-peptide (PIP) EIA-kit, humaan MMP{{10}} ELISA-kit en IIMP-1 ELISA-kit. PBS werd gebruikt als controle. Waarden vertegenwoordigen het gemiddelde plus SD van drie onafhankelijke experimenten. * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. PBS-bevattend medium zonder CP, # p < 0,05# y < 0,01 vs. CP alleen. HDE, menselijke huidfibroblast; PBS, met fosfaat gebufferde zoutoplossing; MMP-1matrix metalloproteïnase-1; TIMP-1, weefselremmers van metalloproteïnase-1; EL ISA, enzymgekoppelde immunosorbenttest.

Vervolgens. beoordeelde de niveaus van geassocieerd met collageenafbraak in met CPwegel behandelde HDE's. Onze resultaten onthulden dat CP-gel met 1-10 ug/ml CP significant (p < 0.01) de MMP-1-niveaus remde tot 62,88 plus 6,54, 59,54 plus 8,35 en 57,44 plus 7,69 procent, vergeleken met die in de controle-HDF's (PBS-behandeling) (Figuur 2B). Zoals verwacht remde alleen CP, dat 1-10 ug/ml CP bevat, ook de niveaus van MMP-1 tot 80,18 plus 2,88, 78,48 plus 6,19 en 79,84 plus 15,08 procent, hoewel deze effecten significant lager waren dan die van CP-gel. In de met CP-gel behandelde HDF's waren bij CP-concentraties van 1-10 ug/ml de expressieniveaus van weefselremmer van metalloproteïnase (IIMP)-1, die remming van MMP veroorzaakt-1, verhoogd tot 113,41 plus 4,74, 116,76 plus 3,31 en 115,8 plus 10,13 procent in vergelijking met die in de controlebehandeling (PBS) (Figuur 2C). Deze resultaten samen suggereerden dat CP-gel de productie van procollageen type I kan versnellen door MMP-1 te remmen en de expressie van TIMP-1 in de HDF's te verbeteren. Vergelijkende analyse van CP-gel en CP alleen toonde aan dat CP-gel effectiever was in het induceren van collageenproductie dan CP alleen.

2.3. Effcacy van CP Gel bij huidontsteking

Om het effect te onderzoekenvan CP-gel op de expressie van inflammatoire cytokines, onderzochten we of CP-gel een ontstekingsremmende rol speelde door IL-1 alfa of -6 te verlagen en IL-10 te verhogen of groeifactor (TGF) te transformeren )-beta 1 in SDS-geïnduceerde menselijke epidermale keratinocyten (HEK's). Met PBS behandelde cellen werden als negatieve controles beschouwd, terwijl met SDS gestimuleerde cellen als positieve controles dienden. Zoals te zien in figuur3Een, 24-uur behandeling met CP-gel (5µg/ml CP in CP-gel) aanzienlijk (p < 0.01) verminderde de SDS-geïnduceerde expressie van IL-1 alpha en IL-6. Aan de andere kant is CP-gel aanzienlijk (p < 0.01) verhoogde de SDS-geïnduceerde expressie van IL-10 en TGF-beta 1 (Figuur3B). Deze resultaten suggereren een ontstekingsremmend effectvan CP-gel op de HEK's.

Figuur 3. Ontstekingsremmend effect van CP-gel in SDS-gestimuleerde HEK's. HEK's werden gelijktijdig geïncubeerd met 0.0015 procent SDS- en CP-gel gedurende 24 uur. De supernatanten van de celkweek werden geoogst en het niveau van ontstekingsfactoren werd gemeten met ELISA-kits. Er werd een relatieve voudige toename van pro-inflammatoire factoren, IL-1 alfa en IL-6 (A), en ontstekingsremmende factoren, IL-10 en TGF-bèta 1 (B) gedetecteerd zoals beschreven in de experimentele procedures; PBS werd gebruikt als controle. Alle waarden vertegenwoordigen de gemiddelden plus SD van drie onafhankelijke experimenten. ** p < 0,01 vs. PBS-bevattend medium zonder CP.# p < 0,01 versus alleen met SDS behandelde HEK's. HEK, menselijke epidermale keratinocyt; SDS, natriumdodecylsulfaat; ELISA, enzym-gekoppelde immunosorbenttest; PBS, met fosfaat gebufferde zoutoplossing; IL, interleukine.IGF, transformerende groeifactor.

2.4. Huidabsorptie-eigenschappen van CP Gel In Vitro

Om de mogelijke klinische toepassing van CP-gel voor anti-verouderingseigenschappen te evalueren, onderzochten we het vermogen van CP-gel om te worden opgenomen in het stratum corneum (SC), de buitenste huidlaag, en de epidermis en dermis binnen te gaan. Om dit aspect aan te pakken, werd CP-gel met 5 ug/ml fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabeld CP topisch aangebracht op een gereconstrueerde 3D-menselijke huid, keraskin@-FT(figuur 4A). Zoals weergegeven in figuur 4B, vertoonden de huidsecties die waren behandeld met FlTC-gelabelde CP-bevattende gel na 1 uur aanbrengen een significante groene fluorescentie door de epidermis, samen met onschadelijke fluorescentie in het dermale weefsel, wat suggereert dat CP-gel kan worden geabsorbeerd. in de SC en worden geïnternaliseerd in de epidermis en dermis. Na 6 en 24 uur werd een meer prominente groene fluorescentie waargenomen in de epidermis en dermis van huidsecties behandeld met CP-gel. Daarentegen werd geen significante fluorescentie waargenomen wanneer alleen PBS topisch werd aangebracht.

Figuur 4. Huidabsorptie van CP-gel in in vitro gereconstrueerde 3D menselijke huid, keraskin@-FI. (APBS of CP-gel (met FITC-gelabeld CP) werd aangebracht op het stratum corneum van keraskin@-FTB) Fluorescentiebeelden toonden de mate van absorptie van CP-gel aan. PBS (onbehandeld) of CP-gel met FITC-gelabeld CP) werd topisch aangebracht gedurende de aangegeven duur. Bevroren delen van huidproblemen werden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop. Schaalbalk=1 mm

Vraag voor meer:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950