Ontstekingsremmende principes van de naalden van Pinus Taiwanensis Hayata en in Silico Studies van hun potentiële anti-verouderingseffecten Ⅱ

De dennennaalden werden geëxtraheerd met methanol en verdeeld met hexanen, ethylacetaat en water om respectievelijk drie oplosbare lagen te verkrijgen. Deontstekingsremmendfractie, deethylacetaat laag, werd onderworpen aan continue conventionele chromatocombinatie van grafische technieken en vijf onbeschreven verbindingen werden gekarakteriseerdinclusief twee nieuwe lignanen, 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -dihydroxy-70 -(4-hydroxyfenyl)propaan-80 -yloxy]benzoëzuur (1), 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -dihydroxy-70 -(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-propaan-80 -yloxy]-2-hydroxybenzoëzuur (2), een nieuwe diterpenoïde, (13E,12R)-12 -hydroxyagathischzuur (3), één monoterpenoïde, 5-isopropyl-3-oxocyclohex-1-een-1-carbonzuur (4), en eenfenylpropaan, styraxinolzuur (5). De chemische structuren van deze nieuwe verbindingenwerden geconstrueerd met behulp van de NMR-spectrale opheldering en MS-spectrometrische analyse. Bovendien zijn er tweeënzeventig bekende verbindingen, waaronder één steroïde, -sitosterol (6); één sesquiterpenoïde, (-)-oplopan-4-één-10- -O- -D-glucoside (7); eencoumarine, umbelliferon (8); eenalkaloïde, indool-3-aldehyde (9); vier diterpenoïden,

Klik hier om anti-verouderingscrème van Cistanche te krijgen

3-methoxyfenyl)-1-propanon (64), 3-hydroxy-1-(4-hydroxyfenyl)-1-propanon (65),2-(4-hydroxyfenyl)azijnzuur (66), fenylazijnzuur (67), is vanillinezuur (68), benzoëzuurzuur (69), vanilline (70), p-hydroxyacetofenon (71), natriumsalicylaat (72), vanillinezuur4-O- -L-rhamnoside (73), trans-ferulinezuur (74), natriump-coumaraat (75), p-coumarischzuur (76), trans-methylp-coumaraat (77), respectievelijk, werden geïdentificeerd door het onderzoek vanhun fysische en spectroscopische gegevens met die eerder gepubliceerd (referenties van bekendeverbindingen werden verstrekt in aanvullende materialen bijlage B).

3.1. Structurele opheldering van verbindingen 1-5

Verbinding1 werd geïsoleerd als een optisch actieve kleurloze siroop, en de moleculaireformule werd toegewezen als C16H16O6 door HR-ESI-MS-analyse ([M− H]−, m/z 303.0855, berekend.voor C16H15O6, 303.0869, figuur S1). Het IR-spectrum geeft de aanwezigheid van een hydroxyl aan(3412cm−1 ) en een geconjugeerde carbonylgroep (1598 cm−1 ). De1H-NMR-gegevens (Figuur S2)toonden de seinen voor tweepara-gesubstitueerde aromatische groepen [δH 6.72 (2H, d, J = 8.4 Hz,H-30 , -50 ), 6.86 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2, -6), 7,24 (2H, d,J = 8.4 Hz, H-20 , -60 ), en 7,83(2H, d, J = 8.8 Hz, H-3, -5)], twee zuurstofhoudende methines [δH 4.48 (1H, m, H-80 ), en 4,85(1H, d, J = 5.6 Hz, H-70 )], en twee methines [δH 3.81 (1H, dd,J {{0}}.0, 4,0 Hz, H-90 a), en 3.86 (1H, dd,J {{0}}.0, 5,6 Hz, H-90 B)]. De13C- en DEPT NMR-spectra (Figuur S3)van1 vertoonde zestien koolstofatomen, overeenkomend met één methyleengroep, twee met zuurstofkoolstofatomen, twaalf aromatische koolstofatomen en één geconjugeerde carbonylgroep (Tabel1). De2 J- En3 J- HMBC-correlaties van H-2, -6 tot C-1 en 4; van H-3, 5 naar C-1 en 7; van H-20, 60 naarC-40 en 70 ; van H-70 naar C-80 en 90 ; en van H-80 tot C-1 werden respectievelijk waargenomen inhet HMBC-spectrum van1 (Afbeelding S4). Bovendien is een grote koppelingsconstante tussen H-70 en H-80 (J = 5.6 Hz) ondersteunde de relatieve configuratie van1 bij C-70 /C-80 alsdrie[44]. De absolute configuraties bij C-70 en C-80 van1 werden bepaald door elektronische circulairedichroïsme (ECD) analyse. Het positieve katoeneffect bij 230 nm (∆ε plus 0.17) onthulde een 8S configuratie voor1, volgens de gepubliceerde literatuur [37,38] en dus 70 R was ookbepaald. Andere 2D-spectra (figuur S5-S7) leverden de volledige toewijzing van proton enkoolstof signalen. Dienovereenkomstig is de structuur van1 is toegewezen als 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -dihydroxy-7 0 -(4-hydroxyfenyl)propaan-80 -yloxy]benzoëzuur zoals weergegeven in figuur1. 

De molecuulformule van2 werd toegewezen als C17H18O8 op basis van HR-ESI-MSanalytische gegevens (m/z 349.0936 [M − H]−, figuur S8). De absorptie in het IR-spectrum(3425 en 1541 cm−1 ) gaf de hydroxyl- en geconjugeerde carbonylfunctionaliteiten aan,respectievelijk. In vergelijking met de NMR-spectra van1 En2, zou het kunnen waarnemen dat zebezat verschillende aromatische delen. Twee sets ABX-gekoppelde aromatische ringen en éénmethoxygroep kon worden gedetecteerd in de1H- (Afbeelding S9) en13C-NMR (Figuur S10) gegevensvan2 (Tafel1), en het suggereerde die verbinding2 bezat twee trisubstituted in plaats vanpara-digesubstitueerde aromatische delen. De significante HMBC-correlaties (Figuur S11) vanH-3 tot C-1, C-5 en C-7; van H-6 naar C-4; van OCH3-30 naar C-30 ; van H-60 naar C-40 EnC-70; van H-70 naar C-10 , C-20 , C-80 en 90 ; van H-80 respectievelijk C-1 hebben dat vastgesteldde structuur van2 was ook een skelet van neolignan. Door een combinatie van een grote koppelingconstant (J7,8 = 5.2 Hz) en positief Cotton-effect bij 230 nm (∆ε plus 1,14), het absoluteconfiguratie van2 werd aangewezen als dedrie- en (70 R,80 S)-vorm, hetzelfde als1 [44,45]. Ander2D-spectra (Figuur S12-S14) leverden de volledige toewijzing van proton- en koolstofsignalen.Deze bevindingen concludeerden de structuur van2 als 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -dihydroxy-70 -(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)propaan-80 -yloxy]-2-hydroxybenzoëzuur (Figuur1). 

Verbinding3 werd verkregen als een kleurloos poeder en de moleculaire formule wastoegewezen als C20H30O5 op basis van HR-ESI-MS analytische gegevens (m/z 349.2024 [M − H]−, figuur S15). Verbinding3 vertoonde absorptiepieken bij 3450 (OH) en 1648 (carbonzuurzuur) cm−1 in zijn IR-spectrum. Dat bleek uit de13C-NMR-spectrum (Figuur S16) inwaarbij twee carboxylfunctionaliteiten werden waargenomenδC 167,2 (C-15) en 181,5 (C-19). Inzijn1H-NMR (Figuur S17), de resonanties bijδH 4.03 (1H, dd,J = 9.2, 2,8 Hz, H-12) enδC 75,5 (C-12) duidde op de aanwezigheid van een secundaire alcoholgroep. Het terminale methyleengroep kon worden vastgesteld vanwege de protonresonanties bijδH 4,53 (1H, s, H-17a) en4,91 (1H, s, H-17b), en de koolstofsignalen opδC 106,9 (C-17) en 150,2 (C-8), respectievelijk.Twee methylgroepen opδH 0.63 (3H, s, CH3-20) en 1.21 (3H, s, CH3-18) waren verbondende quaternaire koolstofatomen (C-10 en C-4) die blijken uit de HMBC-correlaties (Figuur S18).Het afschermende effect van de carboxylgroep op C-4 resulteerde in de opwaartse verschuiving van CH3-20 (δH 0.63), suggereert zijn-configuratie [46]. Bovendien is de chemische verschuiving van H-17a (δH 4.53) verscheen in het upfield-gebied, wat de 12R configuratie [47]. In zijn HMBCspectrum, de correlaties van H-12 tot C-9, C-14 en C-16; van H-17 naar C-7 en C-9;van CH3-16 naar C-12 en C-14; van CH3-18 naar C-3, C-4 en C-19; van CH3-20 naar C-1, C-5,C-9 en C-10 construeerden respectievelijk de vlakke structuur van3 zoals eerder gemeldvoor 12-hydroxyagathinezuur [46]. De C-13-configuratie van3 was vastberadenalsE door de NOESY analytische gegevens (Figuur S19), die de NOE-effecten onder lieten zienH-5/H-9, H-5/H-18 en H-12/H-14. Bovendien is de NOE tussen H-14 en CH3-16, die moet worden opgenomen in 12-hydroxyagathic acid [46], werd niet gedetecteerd in3. Ander2D-spectra (Afbeelding S20–S21) leverde de volledige toewijzing van proton- en koolstofsignalen.Kortom, de structuur van3 werd opgericht als (13E,12R)-12-hydroxyagathinezuur alsgetoond (figuur1).

Het HR-ESI-MS-spectrum van4 exposeerde een [M− H]− ion piek opm/z 181.0855 (Figuur S22), consistent met de pseudomoleculaire formule van C10H13O3. De absorptiepieken op 3456 en 1635 cm-1 in zijn IR-spectrum vertoonde hydroxyl en geconjugeerd carbonylrespectievelijk groepen. Twee methine protonen opδH 2,09 (1H, m, H-5) en 6,32 (1H, dd,J = 2.4, 1,2 Hz, H-2), twee methyleengroepen opδH 1.84 (1H, m, H-4a), 2.02 (1H, m, H-4b), 2.50 (1H, dddd,J = 19.2, 9.2, 4.8, 2.4 Hz, H-6a) en 2.70 (1H, dddd,J = 19.2, 5,2, 5,2, 1,2 Hz,H-6b), en één set isopropylprotonen opδH 0.88 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH3-10) en 2,31 (1H, hept,J = 6.8 Hz, H-8) verscheen in de1H-NMR-spectrumvan4 (Figuur S23). Bovendien is een geconjugeerde carbonylkoolstof opδC 174,8 (C-7), en ééncarboxylkoolstof opδC 205.7 (C-3) kon worden waargenomen in zijn13C- en DEPT NMR-spectra(Afbeelding S24). De waargenomen HMBC-correlaties (Figuur S25) van H-2 tot C-7; van H-4 naarC-3; van H-6 naar C-1, C-2 en C-5; van CH3-9 tot C-5, en CH3-10; van CH3-10 naar C-8,respectievelijk, construeerde de structuur van4 als 5-isopropyl-3-oxocyclohex-1-een-1-carbonzuurzuur (figuur1). Andere 2D-spectra (Figuur S26-S28) leverden de volledige toewijzing van protonen koolstofsignalen. De stereochemie bij C-5 bleef echter onbepaald.

Verbinding5 bezat de molecuulformule C11H14O5 bepaald uit een gedeprotoneerdepiek van moleculaire ionen in de negatieve modus HR-ESI-MS-analyse (m/z 225.0767 [M − H]−, figuurS29). In zijn IR-spectrum is hydroxyl (3421 cm−1 ) en carboxyl (1572cm−1 ) functionaliteiten kunnen worden gedetecteerd. De1H-NMR-spectrum (Figuur S30) onthulde twee langeafstandsspectrumskoppeling van aromatische protonen aanδH 6.86 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4) en 7,31 (1H, d,J = 2.4 Hz, H-6), één methoxygroep opδH 3.56 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-9), en een set vanpropanol protonen opδH 1.82 (2H, tt,J {{0}}.0, 6,8 Hz, H-8), 2,61 (2H, t,J {{0}}.0 Hz, H-7) en 3,56(2H, t, J = 6.8 Hz, H-9). Bovendien bevond zich één carboxylgroep opδC 176,2 (C-10) binnenzijn13C-NMR-spectrum (Figuur S31). De vlakke structuur van5 werd opgericht door de significanteHMBC-correlaties (Figuur S32) van OCH3-3 tot C-3; H-6 naar C-2, C-4, C-7 en C-10; H-7naar C-4, C-5 en C-8; H-9 tot respectievelijk C-7 en C-8. Andere 2D-spectra (Figuur S33-S35)leverde de volledige toewijzing van proton- en koolstofsignalen. Het bovenstaande bewijs suggereertde structuur van5 als 2-hydroxy-5-(3-hydroxypropyl)-3-methoxybenzoëzuur (Figuur1), dat in de eerdere synthetische literatuur al als styraxinolzuur werd vermeld [48]. Niettemin is dit onderzoek het eerste rapport van5 uit natuurlijke bronnen.

3.2. Ontstekingsremmende activiteit

Ontsteking is een van de belangrijkste zelfverdedigingsmechanismen die worden gestimuleerd door bacteriën,virus, wonden of verschillende andere omgevingsfactoren. Het is een eerste reactie van het immuunsysteemsysteem tegen infectie en irritatie. Neutrofielen behoren tot een overvloedige soortvan macrofagen en spelen een belangrijke rol bij ontstekingen, en zijn meestal de eerste lymfocytes om het geïnfecteerde gebied te bereiken [49]. Neutrofielen scheiden een reeks cytotoxinen af, zoalssuperoxide-anion en elastase als reactie op de activering van het immuunsysteem [50]. Inde afgelopen jaren is aangetoond dat verschillende ziekten bij de mens verband houden met neutrofielenoverexpressie [51–55]. De relatie tussen ontsteking en kanker is vastgesteld, en de auteurs wezen erop dat de vorming van kankercellen direct verband hieldtot ontsteking [49]. Daarom zijn nieuwe ontstekingsremmers de moeite waardverder onderzoek naar de behandeling van kanker. Drieënveertig geïsoleerde verbindingen werden geëvalueerdde remming van de vorming van superoxide-anionen en de afgifte van elastase door menselijke neutrofielenals reactie op fMLF/CB [56] (zie aanvullende materialen, tabel S2). De significante invoorlopige resultaten (Tabel2) toonde dat alleen aan45, 47, 48, 49, En50 (Figuur2) weergegeveneen significante remming van de vorming van superoxide-anionen, met IC50 waarden variërend van3.3 ± 0.9 naar7.7 ± 0.9 µM vergeleken met de positieve controle LY294002 (IC50 1.1 ± 0.3 µM). Bovendien,48, 50, En51 (Figuur2) onthulde de significante remming van de afgifte van elastasemet IC50 waarden variërend van 5,3± 0.2 tot 8.3± 0.8 µM vergeleken met de positievecontrole LY294002 (IC50 3.2 ± 1.0 µM) (Tabel2). verbindingen48 En50 beide weergegevenremmingen van superoxide-anionvorming en elastase-afgifte, wat hun veelvoud aangeeftanti-inflammatoire biologische activiteiten. De naalden vanP. morrisonicolazijn gemeld te hebbeneen ontstekingsremmend effect in RAW 264.7 macrofagen [13]. Dat stelden de auteurs voorepicatechine enp-coumarinezuur geïdentificeerd inP. morrisonicolakunnen de actieve ingrediënten zijn.In het huidige onderzoek bevatten alle actieve verbindingen de flavon-ruggengraat vergelijkbaaraan die van epicatechine en dep-coumaroylgroep kon ook worden waargenomen in49, 50, En51. Dit geeft aan dat de flflavonoïde enp-coumaroyl functionele groepen kunnen bijdragende ontstekingsremmende biologische activiteit in de huidige studie. Deze bioassayresultaten suggereren datflavonoïden spelen hierin een sleutelrolpinussoorten voor biologische activiteit tegen ontstekingen.

Tafel 2.Remmende effecten van gezuiverde verbindingen op de vorming van superoxide-anionen en de afgifte van elastasedoor menselijke neutrofielen als reactie op fMLF/CB.

Figuur 2.Structuren van ontstekingsremmende principes45, 47, 48, 49, 50, En51. 

3.3. Moleculaire Docking-studie

De leeftijdsgerelateerde afname van GH-waarden wordt beschouwd als een symptoom van neuro-endocrienouder worden [57]. Dit fenomeen komt voor bij verschillende zoogdiersoorten, zoals mensen, huisdierenhonden en laboratoriumknaagdieren [57]. Bij de mens beginnen de GH-spiegels in het plasma af te nemenmet de leeftijd na volledige fysieke rijping en gaat door gedurende de decennia van het leven [57]. Ghreline wordt geïdentificeerd als de endogene ligand voor de GHSR en is een belangrijke regulator vanGH-secretie [18,19]. Ghreline is betrokken bij verschillende fysiologische en pathofysiologischemechanismen bij mensen zoals veroudering [24,25]. Bovendien kan aan ghreline worden gedachtverband houden met de ontstekingsremmende werking. Immuuncelactivering werd beperkt door ghrelinebehandeling door remming van NF-κB-activering en daaropvolgende MCP-1-secretie [26]. Er is melding gemaakt van een synthetisch ghreline-analoog groeihormoon-releasing peptide-2 (GHRP-2)om de ontstekingsfactoren bij jichtige ratten te verminderen, en het ondersteunt dat de immuuncellenwerden gemedieerd door de activering van ghreline-receptoren [27]. Neves et al. ook voorgesteldde regulatie van ontstekingen als een anti-verouderingsinterventie [58]. Dus volgens deanti-inflammatoire bioassay experimentele gegevens,45, 47, 48, 49, 50, En51 (Figuur2) liet ziensignificante remmende effecten en werden geselecteerd om hun bindingsvermogen aan deghreline-receptor. Voor de docking-simulatie werd de native ligand (8QX) opgenomen in de 6KO5Het PDB-bestand is opnieuw gekoppeld voor validatie. De interacties tussen 8QX en 6KO5 en debeste pose van berekende resultaten vertoonde een hoge gelijkenis en herhaalbaarheid met native data(data niet weergegeven). De resultaten wijzen op de hoge nauwkeurigheid van het bestaande simulatiesysteemen ondersteunde verdere berekeningen.

De laagste bindingsenergie van elke ligand werd als de beste conformatie beschouwd. Debindingsaffiniteiten staan ​​vermeld in de tabel3. Groeihormoon-releasing peptide 6 (GHRP-6) wasgebruikt als een positieve controle voor koppeling aan de bindende pocket van de ghreline-receptor zoals in onzevorig verslag. Hoewel AutoDock Vina niet is gemaakt om tussen peptiden te koppelenen eiwitten zijn in eerdere rapporten verschillende succesvolle resultaten gepubliceerd [59–61]. Daarom werd in dit onderzoek eerst GHRP-6 berekend om de nauwkeurigheid van dehuidige dockingmodel en de resultaten vielen goed samen (Figuur3A). Vergeleken met GHRP-6,de bindende energieën van49, 50, En51 waren lager dan−10,3 kcal/mol (tabel3). Ditstelt49, 50, En51 zou kunnen dokken in de zak van de ghreline-receptor vergelijkbaar ofzelfs beter dan die van GHRP-6. Voor49, de waterstofbruggen konden worden waargenomen tussentwee carbonylgroepen (C-4 enp-coumaroyl) en Arg283, C-5 hydroxyl en Gln120,C-7 hydroxyl en Tyr313, en C-40 hydroxyl en Cys304, respectievelijk. Arg199 vormde eenconventionele waterstofbinding met een carbonylgroep vanp-coumaroyl. In aanvulling,49 wasgekoppeld aan de Arg283-, Arg102-, Asp99-, Phe279-, Phe312-, Leu181- en Pro200-residuen vande ghreline-receptor via verschillende effecten zoals deπ-kation,π-anion,π–π T-vormig, enπ-alkyl interacties. Deze toegestane verbinding49 en eiwit om een ​​stabiel complex te vormen(Figuur3B). 50 was gebonden met Asp99, Arg102, Gln120, Arg283, Leu103, Asn305 enArg199 via verschillende waterstofbruggen, terwijl andere interacties (π-kation,π–anion,π–π T-vormig, enπ-alkyl) werden ook waargenomen met Asp99, Arg102, Arg283, Phe279, Phe312,Leu181 en Leu210 (Figuur3C). 51 bracht ook waterstof- of koolstof-waterstofbindingen tot standmet Tyr313, Ser123, Arg283, Arg102 en Asn305, samen met andere interacties (π-kation,π-anion,π-sigma,π–π T-vormig, enπ-alkyl) om te koppelen met Asp99, Arg283, Arg102, Leu181,Phe312- en Pro200-residuen van de ghreline-receptor konden worden gedetecteerd (Figuur3D). In vergelijking totverbindingen45, 47, En48 met49, 50, En51, bezat de eerste groep een flflavonoïdeskelet alleen terwijl de laatste groep suiker- en coumaroylgroepen had. Dat werd gemeldde coumaroylgroep die aan de suiker was gehecht, was cruciaal voor de bindingsaffiniteit met de ghrelinereceptor [34]. De spleetstructuur van GHSR die interageert met de acylzuurgroep van ghrelineresulteerde in de transformatie van de ghrelinereceptor in een actieve configuratie [43]. Bovendien wordt de bindende pocket van GHSR gesplitst door de zoutbrug tussen Glu124en Arg283, en dit gebied is rijk aan hydrofobe aminozuren [43]. Volgens onzegegevens, de dockingscores van49, 50, En51 waren hoger dan die van45, 47, En48, welkesuggereerde een beter bindend vermogen. De belangrijkste structurele kenmerken waren decoumaroylgroepen in plaats van de suikergroepen en dit zou verder kunnen worden aangetoond door deonderzoek van meer verbindingen met coumaroylfunctionaliteiten. In deze studie is deActieve ingrediënten49, 50, En51 bezat niet alleen anti-inflammatoire biologische activiteit maar ookhet bindingspotentieel van de ghrelinereceptor. Dit gaf aan dat de geclaimde anti-verouderingseffecten vandennennaaldenthee kan ook gebaseerd zijn op deze thee-ghreline-achtige verbindingen.

4. Conclusies

In totaal werden zevenenzeventig isolaten, bestaande uit vijftien onbeschreven verbindingen, gezuiverd.geverifieerd uit de methanolextracten vanP. taiwanensisnaalden. Hun structuren werden gekarakteriseerddoor middel van spectroscopische en spectrometrische analyses. Drieënveertig gezuiverde verbindingen warenonderzocht op hunontstekingsremmend activiteitDoor deremming van de vorming van superoxide-anionenEnelastase-afgifte op het neutrofielenmodel. De resultaten suggereren dat45, 47, 48, 49, 50, En51 aanzienlijk bezittenontstekingsremmende mogelijkheden. Verdere moleculaire koppelingcomputerresultaten ondersteund49, 50, En51 een bindingsaffiniteit met de actieve stof vertonenzak van de ghreline-receptor. Daarom zijn de ruwe extracten en gezuiverde bestanddelen vanP. taiwanensishebben het potentieel om te worden ontwikkeld als nieuwe ontstekingsremmende loodgeneesmiddelen ofvoedsel ingrediënten.

Aanvullende materialen:De volgende zijn online beschikbaar op, Bijlage A: Volledige extractie- en isolatieprocedures,Bijlage B: Referentiesvan bekende verbindingen, Tabel S1: Voorlopige screening op bioactiviteit van naalden vanP. taiwanensisop superoxideanionvorming en afgifte van elastase door menselijke neutrofielen als reactie op fMLF/CB,Tabel S2: Remmende effecten van gezuiverde verbindingen op de vorming van superoxide-anionen en elastaseafgifte door menselijke neutrofielen als reactie op fMLF/CB, figuur S1-S35: HRMS- en NMR-spectra vannieuwe samenstellingen

1–5. Bijdragen van auteurs:Conceptualisatie, P.-CK en JTCT; Methodologie, P.-CK en T.-LH;Onderzoek, Y.-CL, AMK en M.-LY; Middelen, S.-YW; Gegevensbeheer, Y.-CL en G.-HY;Schrijven—voorbereiding origineel concept, P.-CK en Y.-CL; Schrijven - beoordelen en bewerken, P.-CK Allauteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en gaan ermee akkoord.

Financiering:Deze studie werd gesponsord door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (MOST). Deonderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Higher Education Sprout Project, Ministerie van Onderwijs aan deHoofdkwartier van de universitaire vooruitgang aan de National Cheng Kung University (NCKU).

Verklaring van de institutionele beoordelingsraad:De studie werd uitgevoerd met de goedkeuring van de instellingReview Board of Chang Gung Memorial Hospital (IRB nr. 201800369A3).Geïnformeerde toestemmingsverklaring:De verklaring kan op verzoek worden verstrekt.

Verklaring gegevensbeschikbaarheid:Originele gegevens zijn op verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.

dankbetuigingen:De auteurs zijn ook het Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1B0281~3,CMRPF1D0442~3, CMRPF 1F0011~3, CMRPF1F0061~3 en BMRP450 toegekend aan T.-LH) voor degedeeltelijke financiële ondersteuning van het huidige onderzoek. De auteurs erkennen dankbaar het gebruik van NMRapparatuur van het Instrument Center van de National Cheng Kung University.

Belangenconflicten:De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Referenties

1. Xie, Q.; Liu, Z.; Li, Z. Chemische samenstelling en antioxiderende activiteit van etherische olie van zespinustaxa afkomstig uit China.Moleculen2015, 20, 9380–9392. [KruisRef] 

2. Kim, KY; Chung, HJ Smaakstoffen van thee van pijnboompitten en thee van dennennaalden.J. Agric. Voedsel Chem.2000, 48, 1269–1272. [KruisRef] 

3. Park, G.; Paudyal, DP; Hwang, ik.; Tripathi, GR; Yang, Y.; Cheong, H. Productie van gefermenteerde naaldextracten van rode den enhun functionele karakterisering.Biotechnologie. Bioproces Eng.2008, 13, 256. [KruisRef]

4. Idžojti´c, M.; Kajba, D.; Franji´c, J. Differentiatie van F1-hybridenP. nigraJF Arnold× P. sylvestrisL., P. nigraJF Arnold× P. densifloraSiebold en Zucc.,P. nigraJF Arnold× P. thunbergianaFranco en hun ouderlijke soort door vluchtige naaldsamenstelling.Biochem.Systeem Ecol.2005, 33, 427–439. [KruisRef] 

5. Kim, YS; Shin, DH Vluchtige componenten en antibacteriële effecten van dennennaald (Pinus densiflfloraS. en Z.) uittreksels.Voedsel Microbiol.2005, 22, 37–45. [KruisRef] 

6. Dob, T.; Berramdane, T. Essentiële oliesamenstelling vanPinus halepensisMolen. uit drie verschillende regio's van Algerije.J Essent. Olie onderzoek.2007, 19, 40–43. [KruisRef] 

7. Nam, AM; Tomi, F.; Gibernau, M.; Casanova, J.; Bighelli, A. Samenstelling en chemische variabiliteit van de naaldolie uitPinus halepensisgroeit op Corsica.Chem. Biodivers.2016, 13, 380–386. [KruisRef] 

8. Sezik, E.; Üstün, O.; Demirci, B.; Ba¸ser, KHC Samenstelling van de essentiële oliën vanPinus nigraArnold uit Turkije.Turk. J Chem.2010, 34, 313–325.