Anti-melanogeen effect van ethanolisch extract van sorghum bicolor op door IBMX geïnduceerde melanogenese in B16/F10 melanoomcellen

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hye Ju Han, Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong-Min Kim, Seul Ki Yoo en Ho Jin Heo

Abstract:Om de mogelijkheid te evalueren als een huidbleekmiddel van:Sorghum bicolor(S. bicolor), zijnantioxidantactiviteit en anti-melanogeen effect op door 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) geïnduceerdemelanogenesein B16/F10 werden melanoomcellen onderzocht. Het resultaat van het totale fenolgehalte (TPC) gaf aan dat 60% ethanolextract vanS. bicolor(ESB) heeft de hoogste gehalten dan andere ethanolextracten.antioxidantactiviteit werd geëvalueerd met behulp van het 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonzuur) diammoniumzout (ABTS)/1,1-difenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radicale wegvangende activiteiten en malondialdehyde (MDA) remmend effect. Deze resultaten toonden aan dat ESB significanteantioxidantactiviteiten. Het remmende effect tegen tyrosinase werd ook beoordeeld met behulp van L-tyrosine (IC50-waarde=89.25 µg/mL) en 3,4-dihydroxy-L-fenylalanine (L-DOPA) als substraten. Bovendien remde ESB-behandeling effectief de melanineproductie in IBMX-geïnduceerde B16/F10-melanoomcellen. Om het mechanisme van het anti-melanogene effect van ESB te bevestigen, hebben we melanogenese-gerelateerde eiwitten onderzocht. ESB gedownreguleerdmelanogenesedoor de expressie van microftalmie-geassocieerde transcriptiefactor (MITF), tyrosinase en tyrosinase-gerelateerd eiwit (TRP)-1 te verminderen. Ten slotte werden 9-hydroxyoctadecadieenzuur (9-HODE),1,3-O-dicaffeoylglycerol en tricine als de belangrijkste verbindingen van ESB geanalyseerd met behulp van de ultraperformante vloeistofchromatografie-ionenmobiliteitsscheiding-quadrupool vluchttijd/tandemmassaspectrometrie (UPLC-IMS-QTOF/MS2). Deze bevindingen suggereren dat ESB het fysiologische potentieel heeft om als huidbleekmiddel te worden gebruikt.

trefwoorden:anti-melanogenese; B16/F10 melanoomcel; hydroxyoctadecadieenzuur;Sorghumbicolor; 3-isobutyl-1-methylxanthine

Cistanche remt melaninevorming.

1. Inleiding

Melanine wordt gegenereerd door een proces, genaamdmelanogenesebinnen de intracellulaire melanosomen van melanocyten, en de productie en distributie van melanine bepalen de huid, ogen en haarkleur. Bovendien speelt melanine een vitale rol bij de bescherming van de huid tegen verschillende moleculen en prikkels, zoals ultraviolette (UV) straling, reactieve zuurstofsoorten (ROS), -melanocyten-stimulerend hormoon (-MSH) en cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) verhogende middelen, waaronder forskolinand. IBMX [1]. In het bijzonder beschadigt UV-straling, direct en indirect, huidcellen via ROS-generatie zoals hydroxylradicalen, superoxide-anionen en waterstofperoxide [2]. De gegenereerde ROS veroorzaakt enkel- en dubbelstrengs DNA-breuken en valt belangrijke cellulaire structurele moleculen zoals eiwitten en lipiden aan [2]. Dus melanine enantioxidantenzymen zoals glutathionperoxidase, superoxide dismutase en catalase handhaven een constant niveau door de geproduceerde ROS te verwijderen. Overmatige ROS-productie als gevolg van verschillende factoren activeert echter de melanogenese in de huid, en de abnormale ophoping van melanine veroorzaakt negatieve hyperpigmentatie-effecten, die ouderdoms- of levervlekken, vlekken en sproeten veroorzaken [3,4]. Momenteel worden natuurlijke verbindingen zoals kojiczuur, hydrochinon, arbutine en ascorbinezuur, die bekend staan ​​als melaninesyntheseremmers, gebruikt als additieven voor huidbleekmiddelen. Deze ingrediënten dringen echter niet alleen slecht door in de huid, maar veroorzaken bij langdurige toediening ook cytotoxiciteit en ontsteking [5]. In dit opzicht is het noodzakelijk om een ​​niet-irriterend en effectief bleekmiddel te ontwikkelen om hyperpigmentatie van de menselijke huid te behandelen, evenals om natuurlijke hulpbronnen hiervoor te bestuderen.

Menselijke huidcellen genereren gewoonlijk melanine als een fotoprotectiereactie. Melanogenese is een complex proces dat wordt gereguleerd via een verscheidenheid aan signaalroutes, en alle signalen reguleren uiteindelijk MITF. Aangezien geactiveerde MITF de expressie van de tyrosinasegenfamilie (tyrosinase en TRP's) bevordert,melanogenesebegint serieus [6]. Over het algemeen is de eerste stap in melanogenese dat tyrosinase de oxidatie van L-tyrosine tot 3,4-dihydroxy-L-fenylalanine (L-DOPA) katalyseert en vervolgens L-DOPA oxideert tot DOPA-chinon. En dan zet TRP-2 DOPA-chroom om in 5,6-dihydroxyindol-2-carbonzuur (DHICA) of 5,6-dihydroxyindol (DHI). Ten slotte worden DHICA en DHI geoxideerd door TRP-1, wat uiteindelijk leidt tot de productie van melanine [6].

IBMX en andere methylxanthinen stimuleren de melanogenese door fosfodiësterase te remmen en daardoor de cAMP-spiegels te verhogen [7]. cAMP geactiveerd door IBMX fosforyleert extracellulaire signaalgereguleerde kinase (ERK) en fosfoinositide 3-kinasen/eiwitkinase B (PI3K/Akt) signaalroutes en leidt uiteindelijk tot de activering van MITF in melanogeneseprocessen [7]. Daarom kan de neerwaartse regulatie van deze eiwitten worden beschouwd als een belangrijke factor voor het anti-witmakende effect.

Sorghum bicolor(S. bicolor), die behoort tot de familie Poaceae, wordt beschouwd als een belangrijk gewas in tropische gebieden, waaronder Afrika, Midden-Amerika en droge gebieden, en is het vierde belangrijkste graangewas ter wereld na tarwe, rijst en maïs [8] ]. Recente studies hebben aangetoond dat S. bicolor gunstig is voor de mens omdat het fytochemicaliën bevat zoals fenolische verbindingen, tannines en anthocyanines [9]. Deze fytochemicaliën hebben meer aandacht gekregen vanwege hunantioxidant,anti-obesitas, anti-diabetes, en anti-inflammatoire effecten [10-14]. Hoewel er verschillende onderzoeksresultaten zijn, zijn er nog geen onderzoeken uitgevoerd naar het huidblekende effect van S. bicolor. Daarom was de huidige studie gericht op het onderzoeken van de antioxidantactiviteit en anti-melanogene effecten vanS. bicoloren om hun effecten op door IBMX geïnduceerdemelanogenesein B16/F10-melanoomcellen.

2. materialen en methoden

2.1. Chemicaliën

Folin-Ciocalteu's reagens, L-DOPA, L-tyrosine, L-ascorbinezuur, arbutine, acarbose, dimethylsulfoxide (DMSO), runderserumalbumine, -glucosidase, paddenstoelentyrosinase, runderserumalbumine, 3-(4,{ {6}}dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) en IBMX werden gekocht bij Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, VS). MITF (bsm-51339M) en tyrosinase (bs-0819R) werden gekocht bij Bioss (Beijing, China). TRP-1 (sc-166857) en -actine (sc-69879) werden gekocht bij Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, VS). Secundaire antilichamen (anti-konijn en anti-muis) werden verkregen van Cell Signaling Technology (Danvers, MA, VS).

2.2. Monstervoorbereiding

S. bicolor(20 g) werd geëxtraheerd met verschillende ethanolconcentraties (0, 20, 40, 60, 80 en 95 procent; 1 liter) bij 40 graden gedurende 2 uur met behulp van een terugvloeikoeler. De extracten werden gefiltreerd met behulp van filtreerpapier (WhatmanInternational Limited, Kent, VK) en geconcentreerd met behulp van een vacuümverdamper (N-1000; EYELA Co., Tokyo, Japan). Nadat de extracten waren gevriesdroogd met behulp van een vacuümvriesdroger (Il Shin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea), werden de gedroogde extracten tot gebruik bij -20 graden bewaard.

2.3. In vitro antioxidant activiteit

2.3.1. Totale fenolinhoud (TPC)

Het totale fenolgehalte werd onderzocht op basis van het principe dat het reagens van Folin-Ciocalteu onder alkalische omstandigheden wordt gereduceerd tot een blauw reactieproduct. Een monster (1 ml) gemengd met Folin-Ciocalteu's reagens en 7 procent natriumcarbonaat. Het mengsel werd 2 uur geactiveerd en vervolgens werd de absorptie gemeten bij 760 nm met behulp van een spectrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan). TPC werd berekend uit de standaardcurve van galluszuur en de resultaten werden uitgedrukt als mg GAE g−1.

2.3.2. Radicale opruimingsactiviteit

ABTS-radicaalkationenoplossing werd geproduceerd door 2,45 mM kaliumpersulfaat en 7 mMABTS te mengen met 10{{10}} mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,4) die 150 mM bevat en ze reageren gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. De ABTS-oplossing werd vervolgens verdund met gedestilleerd water om een ​​absorptie van 0,700 ± 0,020 bij 734 nm te verkrijgen. Het monster mocht reageren met 980 µL van de ABTS-oplossing gedurende 10 minuten bij 37 graden en vervolgens werd de absorptie bij 734 nm gemeten met behulp van een spectrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan). DPPH-radicaaloplossing werd bereid door oplossen van 0,1 mM DPPH in 80 procent methanol. De DPPH-oplossing werd verdund tot een absorptie van 1,000 ± 0,020 bij 517 nm. 50 µL van het monster werd gemengd met 1,45 ml van de DPPH-oplossing en gedurende 30 minuten in het donker gereageerd. Na reactie werd het mengsel bepaald op 517 nm.

2.3.3. Remmend effect op lipideperoxidatie

Om het remmende effect op lipideperoxidatie in hersenweefsel te meten, werd de thiobarbituurzuur (TBA) reactieve stof methode gebruikt. Hersenweefsel werd gehomogeniseerd in 20 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,4) en 20 minuten bij 6000 x g gecentrifugeerd. Het supernatant werd toegevoegd aan 0,1 mM L-ascorbinezuur en 10 µM ferrosulfaat 37°C gedurende 1 uur incubatie. Vervolgens werden 30% trichloorazijnzuur en 1% TBA aan het mengsel toegevoegd, dat vervolgens gedurende 20 minuten in een waterbad bij 80°C werd geïncubeerd. Vervolgens werd het TBA-MDA-complex gemeten met een spectrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan) bij 532 nm.

2.4. Tyrosinase remmend effect

Het tyrosinaseremmende effect werd bepaald met L-tyrosine als substraat. Een monster werd toegevoegd aan een 96-well-plaat en gemengd met 0,1 M natriumfosfaatbuffer, tyrosinase en 0,1 mML-tyrosinesubstraat om bij 37 graden te reageren. Na incubatie werd de enzymactiviteit gemeten met behulp van een microplaatlezer (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, VS) bij 490 nm. Ook werd L-DOPA als substraat gebruikt om de tyrosinaseremmende activiteit te meten. 67 mM natriumfosfaatbuffer, tyrosinase en 10 mML-DOPA-substraat werden aan het monster toegevoegd om gedurende 10 minuten bij 37 graden te reageren. Tyrosinase-activiteit werd gemeten bij 415 nm.

Cistanche remt melaninevorming

2.5. -Glucosidase remmend effect

Het -glucosidase-remmende effect werd gemeten door 0,1 M natriumfosfaatbuffer en -glucosidase bij 37°C gedurende 10 minuten te mengen. Na activering werd het mengsel toegevoegd aan 5 mM 4-nitrofenyl- -D-glucopyranoside in buffer bij 37°C gedurende 5 minuten, en daarna werd de absorptie gemeten bij 405 nm met behulp van een microplaatlezer (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, VS).

2.6. Cel levensvatbaarheidstest

De cytotoxiciteit van het monster werd geschat met behulp van een MTT-assay. B16/F10-melanoomcellen werden 24 uur gekweekt bij 1 x 104 cellen/putje in een 96-putjesplaat. Daarna werden de monsters behandeld tot 1, 2, 5 en 10 µg/ml concentraties. Monsters werden 48 uur behandeld, waarna de cellen 3 uur werden behandeld met 10 µg/ml MTT-voorraadoplossing. Ten slotte werd het medium verwijderd en werd DMSO toegevoegd om het formazan op te lossen. De hoeveelheid formazan werd gekwantificeerd met behulp van een microplaatlezer (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, VS) bij 570 nm (excitatiegolflengte) en 655 nm (emissiegolflengte).

2.7. Meting van het cellulaire melaninegehalte

Om de hoeveelheid melanine te meten, werden B16/F10-melanoomcellen 24 uur gekweekt in een 24-well-plaat met een adensiteit van 4 x 104 cellen/well hierboven. Vervolgens werden de cellen gedurende nog eens 48 uur behandeld met 100 mM IBMX en ESB of positieve controle (arbutine). Na behandeling werden de cellen gewassen en geoogst met behulp van fosfaatbufferzoutoplossing (PBS). De geoogste cellen werden vervolgens gedurende 10 minuten bij 16 000 x g gecentrifugeerd en de verkregen pellet werd gedurende 20 minuten bij 90 graden opgelost met 1 N natriumhydroxide dat 10% DMSO bevatte. De melanine-inhoud werd gemeten bij 490 nm met behulp van een microplaatlezer (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, VS).

2.8. Western Blot-analyse

Voorbehandelde B16/F10-melanoomcellen werden gewassen met PBS en gelyseerd met behulp van RIPA-buffer met 1% proteaseremmers op ijs. Eiwitconcentraties werden bepaald door Bradford-eiwitassay en de gelijke eiwitten werden gedurende 10 minuten bij 95 graden gedenatureerd met een Laemmli-buffer. De gedenatureerde eiwitten werden gescheiden door 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en werden vervolgens overgebracht op polyvinylideendifluoride (PVDF) -membranen (Millipore, Billerica, MA, VS). Vervolgens werden membranen gedurende 1 uur geblokkeerd met 5 procent magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0, 1 procent Tween20 (TBST) en vervolgens overnacht bij 4 graden met primaire antilichamen gereageerd. De membranen werden gedurende 1 uur met de secundaire antilichamen gereageerd en de immuuncomplexen werden zichtbaar gemaakt met behulp van een verbeterd chemiluminescentiereagens (Bionote, Hwaseong, Korea). De bandbeelden werden gedetecteerd en geanalyseerd door Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, VS).

2.9. UPLC-IMS-QTOF/MS2-analyse

De belangrijkste verbindingen in de 60 procent ethanolische extracten vanS. bicolorwerden geanalyseerd door UPLC-IMS QTOF / MS2 (Vion, Waters Corp., Milford, MA, VS). Chromatografische scheiding werd uitgevoerd met behulp van een Acquity UPLC BEH C18-kolom (2,1 x 10{{1{0}} mm, 1,7 µm deeltjesgrootte; Waters Corp.) bij een stroomsnelheid van 0,35 ml/min. De mobiele fasen bestonden uit oplosmiddel A (0,1 procent mierenzuur in gedestilleerd water) en B (acetonitril), en de analyseomstandigheden omvatten de volgende tijdsgradiënt: 1 procent B bij 0-1 min, 1-100 procent B bij 1-7 min, 100 procent B bij 7-8 min, 100-1 procent B bij 8-8,2 min, 1 procent B bij 8,2-10 min. Massaspectrometrie werd uitgevoerd in de negatieve modus voor elektrospray-ionisatie (ESI) onder de volgende omstandigheden: brontemperatuur, 100 ◦C; temperatuur desolvatielijn, 400 ◦C; hellingbotsingsenergie, 10–30 V; capillaire spanning, 2,5 kV. Fenolverbindingen werden gedetecteerd door een volledige scan variërend van m/z 50 tot 1500.

2.10. Statistische analyse

Alle resultaten werden gepresenteerd als de gemiddelden ± standaarddeviatie (SD). Het statistische verschil tussen groepen werd bepaald door een eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met behulp van Duncan's nieuwe meervoudige bereiktest (p < 0.05)="" met="" sas-softwareversie="" 9.4="" (sas="" institute,="" cary,="" nc,="" vs)="" .en="" de="" onderlinge="" relatie="" tussen="">antioxidanteffecten (ABTS/DPPH radicale wegvangende activiteit en MDA-remmend effect) en het remmende effect vanmelanogenese-gemedieerde enzymen (tyrosinase en -glucosidase) werden geëvalueerd door Pearson-correlatieanalyse.

3. Resultaten

3.1. Totale fenolinhoud

om de te vergelijkenantioxidantactiviteit van elk ethanolisch extract vanS. bicolor, TPC werd onderzocht. Zoals weergegeven in figuur 1, waren TPC verschillend tussen de ethanolische extracten; het 60 procent ethanolische extract (150.08 ± 1.13 mg GAE/g) was significant hoger dan de andere extracties (0 procent; 70,83 ± 1,18, 20 procent; 100,42 ± 0,72, 40 procent ; 114,67 ± 1,46, 80 procent; 118,33 ± 3,17 en 95 procent; 73,67 ± 1,46 mg GAE/g). Daarom werd het 60 procent ethanolische extract gebruikt voor verdere experimentele analyses.

3.2. Radicale opruimingsactiviteit

Deantioxidantactiviteit van het 60 procent ethanolische extract vanS. bicolor(ESB) werd gemeten met behulp van de ABTS/DPPH-assay en MDA-assay, en de resultaten zijn weergegeven in figuur 2. De ABTS-radicaalafvangende activiteit van ESB vertoonde 97,98 procent bij een concentratie van 1000 ug/ml, en vitamine C (99,82 procent) , die wordt gebruikt als de positieve controle en ook vergelijkbare radicale wegvangende activiteit had bij dezelfde concentratie (Figuur 2A). En ESB vertoonde een remmingseffect van 50 procent (IC50-waarde) van het ABTS-radicaal bij een concentratie van 409,71 ug/ml. Zoals getoond in figuur 2B, werd de DPPH-radicaalafvangende activiteit van ESB 79,44 procent getoond bij een concentratie van 1000 ug/mL, en de IC50-waarde werd aangegeven op 612,53 ug/mL. Het remmende effect van MDA-productie van ESB vertoonde een remmend effect van 89,54 procent bij een concentratie van 50 ug/ml en vertoonde een hoger remmend effect dan de catechine (71,03 procent), de positieve controle, bij dezelfde concentratie (Figuur 2C). Bovendien werd de IC50-waarde van MDA waargenomen bij 16,56 ug/ml ESB-concentraties.

3.3. Remmend effect van door melanogenese gemedieerde enzymen

Het remmende effect vanmelanogenese-gemedieerde enzymen werden geëvalueerd met behulp van tyrosinase en -glucosidase (Figuur 3). Om de remmende activiteit van tyrosinase tegen melaninesynthese te meten, werden experimenten uitgevoerd met L-tyrosine en L-DOPA als substraat onder celvrije omstandigheden. Als resultaat was de IC50-waarde 89,25 µg/ml wanneer L -tyrosine werd gebruikt als substraat (Figuur 3A), maar L-DOPA kon niet dat meer dan 50 procent van het remmende effect werd waargenomen (Figuur 3B). Op dat moment was de IC50-waarde van de positieve controle (arbutine) voor L-tyrosine 74,35 µg/ml, wat hoger was dan ESB. ESB bleek een beter remmend effect op tyrosinase te hebben bij gebruik van L-tyrosine dan bij gebruik van L-DOPA als substraat. Daarom wordt, op basis van de resultaten van de test met twee substraten, aangenomen dat het tyrosinaseremmende effect van ESB verband houdt met de oxidatie van L-tyrosine tot L-DOPA in plaats van de oxidatie van L-DOPA tot DOPA-chinon bij melanogenese. Tyrosinase-remmend effect met L-DOPA als substraat en radicale wegvangende activiteit (ABTS; 0.943, p <0.05, dpph;="" 0.952,="" p=""><0.05) duidden="" op="" de="" positieve="" sterke="" correlaties="" in="" tabel="">

Om het remmende effect van de te metenmelanogenese-gemedieerd enzym, werd de remmende activiteit tegen -glucosidase van ESB gemeten. Zoals weergegeven in figuur 3C, remde ESB -glucosidase met 33,72 procent bij een concentratie van 200 µg/ml. En de IC50 van ESB was 46,29 µg/ml, wat ongeveer vijf keer hoger is dan acarbose (216,05 µg/ml). Deze resultaten geven aan dat ESB een betere glucosidaseremmende activiteit heeft dan acarbose als een positieve controle. En -glucosidaseremmend effect onthulde sterke positieve correlaties met MDA-remmend effect (0,966, p <0,05) in="" tabel="">

3.4. Levensvatbaarheid van cellen en cellulaire melaninesynthese

Om de cytotoxiciteit van ESB te bevestigen, werden B16/F10-melanoomcellen gedurende 24 uur behandeld met ESB bij 1, 2, 5, 10 en 20 µg/mL-concentraties. De resultaten toonden aan dat ESB de levensvatbaarheid van de cellen bij de aangegeven concentraties niet beïnvloedde in vergelijking met de controle (Figuur 4A). Daarom werden experimenten uitgevoerd door concentraties van 2, 5 en 10 µg/mL te selecteren. Vervolgens werden B16/F10-melanoomcellen behandeld met IBMX om het effect van ESB op de melanineproductie te analyseren. Zoals te zien is in figuur 4B, nam het melaninegehalte toe tot 316,85 procent bij behandeling met IBMX. Aan de andere kant vertoonde de met ESB behandelde groep (108,60 procent) bij een concentratie van 10 µg/ml een significant verlaagd melaninegehalte vergeleken met de met IBMX behandelde groep, en vergelijkbare melaninegehalten vergeleken met de arbutinegroep (101,79 procent) als positieve controle.

3.5. Melanogenese-route in B16/F10-melanoomcellen

Melanogeneseis een essentieel proces om de menselijke huid te beschermen tegen prikkels van buitenaf, en dit proces wordt gereguleerd door verschillende mechanismen. In deze studie hebben we het expressieniveau van melanogenese-regulerende moleculen gemeten om het potentiële remmende mechanisme van door ESB onIBMX geïnduceerde melanineproductie in B16/F10-melanoomcellen te bevestigen (Figuur 5). De resultaten toonden aan dat ESB de door IBMX geïnduceerde MITF-expressie effectief verminderde (Figuur 5A, B). Zo werd de expressie van tyrosinase (Figuur 5A, C) en TRP -1 (Figuur 5A, D) gedownreguleerd door verminderde MITF met ESB-behandeling. Dientengevolge reguleerde ESB-behandeling de expressie van verwante eiwitten in IBMX-geïnduceerde melanogenese in B16/F10-melanoomcellen.

3.6. UPLC-IMS-QTOF/MS2-analyse

Een profiel van de belangrijkste verbindingen van ESB werd gescand door LC/MS in een bereik van m/z 50-1500, en de basispiekchromatogrammen worden getoond in figuur 6. Verdere identificatie en karakterisering van de verbindingen werd uitgevoerd in vergelijking met literatuurgegevens met behulp van MS2-fragmentatiegegevens (tabel 2). Op basis van de fragmenten in eerdere literatuur was piek 2 1-O-caffeoylglycerol (m/z 253.07, 179.03, 161.02 en 135.04) [15]; piek 3, dicaffeoylglyceriden (m/z 415,10, 253,07, 179,03 en 135,04) [16]; piek 4, 1,3-O-dicaffeoylglycerol (m/z 415.10, 253.07, 179.03, 161.02 en 135.04) [16];piek 5, p-coumaroyl-caffeoylglycerol (m/z 399.10, 253.07, 179.03, 161.02 en 135,04) [17]; piek 6,feruloyl-caffeoylglycerol (m/z 429,12, 253,07, 193,05, 161,02 en 134,03) [18]; piek 7, tricine (m/z 329.23.314.04, 299.01 en 271.02) [19]; en piek 9, 9-hydroxyoctadecadieenzuur (9-HODE) (m/z 295,22, 277,21 en 171,10) [20], respectievelijk. Onder hen werden 1, 3- O-dicaffeoylglycerol (Figuur 6B), tricine (Figuur 6C) en 9- HODE (Figuur 6D) geïdentificeerd als belangrijke verbindingen.

effecten van cistanche:anti-oxidatie

4. Discussie

Melanogenesewordt naar verluidt veroorzaakt door verhoogde oxidatieve stress door externe stimuli. Oxidatieve stress veroorzaakt oxidatie van DNA en eiwitten, lipideperoxidatie en verhoogde onverzadigde vetzuren. Deze stress leidt ook tot een onnodige toename van de melaninesynthese in melanocyten op de huid. Overmatige melanine die wordt gegenereerd, kan dus pigmentatie veroorzaken en kan leiden tot huidkanker. IBMX stimuleert de melanogenese door fosfodiësterase te remmen en daardoor de cAMP-niveaus te verhogen [7]. Naarmate het cAMP-niveau in cellen toeneemt, veroorzaakt het activering van de ERK- en PI3K/Akt-signaleringsroutes die de aanmaak van eiwitten die verband houden met melanogenese bevorderen. Daarom hebben we het whitening-effect van ESB op IBMX-geïnduceerde melanogenese in B16/F10-melanoomcellen onderzocht.

Fenolverbindingen als secundaire metabolieten van planten hebben de eigenschap te worden gestabiliseerd door een resonantiestructuur wanneer ze reageren met radicalen [21]. Ook werken fenolische verbindingen als belangrijke factoren voor de antioxidantactiviteit, zoals ABTS/DPPH radicalen wegvangende activiteit, en werken ze als remmers van pigmentvorming omdat ze een chemische structuur hebben zoals die van L-tyrosine [22,23]. Een ABTS/DPPH-assay is de meest gebruikelijke en eenvoudigste methode om in vitro te schattenantioxidantwerkzaamheid. In deze studie heeft ESB een hoge TPC (Figuur 1) en ABTS/DPPH radicale wegvangende activiteit getoond (Figuur 2A, B). Vooral ESB was hoger in de ABTS radicalen wegvangende activiteit dan de DPPH radicale wegvangende activiteit. De DPPH-assay wordt gebruikt om de radicaalafvangende activiteit van hydrofobe verbindingen te meten, terwijl de ABTS-assay het mogelijk maakt om de radicaalafvangende activiteit tegen zowel hydrofobe als hydrofiele verbindingen te meten [24]. Daarom werd bevestigd dat de radicaalafvangende activiteit van ESB meer werd beïnvloed door de hydrofiele verbinding.

Blootstelling aan UV-straling veroorzaakt ROS-productie en heeft directe en indirecte effecten op de huid. In het bijzonder induceert ROS lipideperoxidatie door onverzadigde vetzuren aan te vallen, die componenten zijn van celmembranen [2]. De ophoping van lipideperoxiden leidt tot de vernietiging van het antioxidantsysteem van de huid, waardoor pigmentatie, ontsteking en veroudering ontstaat [25]. In deze studie toonde ESB een uitstekende remming van lipideperoxidatie (Figuur 2C). Van de fenolische verbindingen in natuurlijke planten werd gemeld dat ze geassocieerd zijn met radicalen wegvangende activiteit [26]. Ook Maresca et al. [27] meldde dat de verwijdering van ROS met antioxidanten effectief is bij het remmen van de biosynthese van melanine. Een recente studie meldde dat de ethylacetaat- en aglyconfracties van Dendropanax morbifera-blad kunnen werken als huidcelbeschermende middelen en natuurlijke antioxidanten door HaCaT-cellen te beschermen tegen oxidatieve stress [28]. Bovendien vertoonde behandeling met dezelfde fracties een beter anti-melanogeen effect dan arbutine, gebruikt als een positieve controle, tegen -MSH-geïnduceerde overmatige melaninegeneratie in B16/F10-melanoomcellen [28].

Er zijn verschillende mechanismen geassocieerd met:melanogeneseen het gemeenschappelijke doel van huidbleekmiddelen is de regulatie van tyrosinase, een belangrijk enzym bij melanogenese. Tyrosinase, een koperhoudend enzym, katalyseert twee reacties in deze route: de hydroxylering van L-tyrosine tot L-DOPA en de oxidatie van L-DOPA tot DOPA-chinon [6]. Bij blootstelling aan grote hoeveelheden UV of ROS wordt de activiteit van tyrosinase verhoogd en wordt ook de melaninesynthese verhoogd. Daarom toonden de resultaten van het meten van het remmende effect van tyrosinase in relatie tot melaninesynthese aan dat ESB een beter remmend effect op tyrosinase bleek te hebben met L-tyrosine dan met L-DOPA als substraat (Figuur 3A,B). Een recente studie rapporteerde de correlatie tussen TPC en tyrosinaseremming omdat fenolische verbindingen een chemische structuur hebben die vergelijkbaar is met die van L-tyrosine, een substraat van tyrosinase. Volgens Choi et al. [29], werd waargenomen dat de efficiëntie van de activiteit van vrije radicalen en het remmende effect van tyrosinase toenam in verhouding tot de fermentatietijd van Cheonggukjang, wat te wijten was aan de hoeveelheid TPC die toenam met de fermentatietijd. Im & Lee [30] merkten op dat de ethylacetaatfractie van 75 procent ethanolisch extract van Taraxacum core num een ​​overvloedige TPC- en antioxidantactiviteit had, en dat het tyrosinaseremmende effect superieur was aan andere fracties (hexaan, chloroform, butanol en waterig).

Tyrosinase, een van de glycoproteïnen, wordt geglycosyleerd wanneer polypeptideketens zich verplaatsen naar het endoplasmatisch reticulum. Verschillende enzymen zijn bij dit proces betrokken, en onder hen zou remming van -glucosidase de vouwing van tyrosinase kunnen remmen om een ​​inactieve structuur zonder koper te vormen. Als gevolg hiervan kan tyrosinase niet naar het melanosoom worden getransporteerd en remt het de melanineproductie. Het aanwezige polyfenol in planten is niet alleen in staat om oxidatieve stress te verminderen, maar remt ook koolhydraat hydrolyserende enzymen zoals -glucosidase door te binden aan eiwitten [31]. Een eerdere studie gaf aan dat B16/F10-melanoomcellen in de aanwezigheid van glycosyleringsremmers resulteren in een verlaging van de melanogenese door het totale tyrosinasegehalte te verlagen [32]. En Choi et al. [33] rapporteerde dat deoxynojirimycine, een van de -glucosidaseremmers, de glycosylering van tyrosinase blokkeerde en de migratie van tyrosinase naar melanosomen remde. Ando et al. [34] hebben aangetoond dat het mogelijk is om de melaninesynthese in melanoomcellen te remmen door de glycosylering van tyrosinase door glucosidaseremmers zoals glutathion, ferritine en geldanamycine te regelen. Kim et al. [35] rapporteerde de goede correlaties voor bijenpollen als een natuurlijkeantioxidanttussen TPC en tyrosinase remmend effect ({{0}}.973,p < 0.05),="" en="" ook="" tpc="" gaf="" de="" positieve="" correlatie="" met="" dpph="" radicalen="" wegvangende="" activiteit="" (0,897,="" p="">< 0,05).="" en="" de="" resultaten="" suggereren="" dat="" polyfenolen="" als="" natuurlijke="" antioxidanten="" potentieel="" effectief="" kunnen="" zijn="" voor="" het="" bleken="" van="" de="" huid="" op="" basis="" van="" hun="" uitstekende="" antioxiderende="" activiteit.="" in="" onze="" studie="" bleek="" het="" antioxiderende="" effect="" van="" esb="" in="" het="" proces="" van="" remming="" van="" de="" werking="" van="" tyrosinase="" sterk="" gecorreleerd="" te="" zijn="" door="" remming="" van="" de="" oxidatie="" van="" l-dopa="" tot="" dopa-chinon="" en="" de="" glycosylering="" van="" tyrosinase="" (tabel="" 1).="" effect="" van="" esb="" heeft="" een="" effect="" op="" het="" blekende="" effect="" van="" de="" huid="" door="" de="" remming="" van="">melanogenese-gemedieerde enzymen.

natuurlijke antioxidant: cistanche tubulosa

De PKA-signaleringsroute is het belangrijkste proces dat betrokken is bij melanogenese en dit wordt geactiveerd door IBMX, een cAMP-verhogend middel. De PKA-signaleringsroute kan transcriptiefactoren reguleren, zoals MITF en cAMP-responsief element-bindend eiwit, die betrokken zijn bij de expressie vanmelanogeneseregelgevers zoals tyrosinase, TRP-1 en TRP-2. Bijgevolg verhoogt IBMX-behandeling de expressie van MITF en de tyrosinase-genfamilie (tyrosinase en TRP-1) door cAMP-activering [7]. Park et al. [36] toonde aan dat de hoeveelheid melaninesynthese van PapenfusiellaCuomo-ethanolisch extract (65,17 ± 13,40 procent) bij een concentratie van 40 µg/ml vergelijkbaar was met kojiczuur (72,30 ± 3,92 procent) als een positieve controle, en rapporteerde dat het potentieel vertoonde als natuurlijk bleekmiddel. In deze studie toonde ESB een effectief remmend effect op de melaninesynthese, vergelijkbaar met dat van de positieve controle bij lage concentraties (Figuur 4). Daarna werd, om het gedetailleerde anti-melanogene effect van ESB te beoordelen, western-blot-analyse uitgevoerd op melanogenese-gemedieerd eiwit met behulp van B16/F10-melanoomcellen.

Akt, dat betrokken is bij verschillende mechanismen, speelt een sleutelrol in meerdere cellulaire processen zoals apoptose, glucose en huidmetabolisme. In het bijzonder vermindert de toename van cAMP door IBMX-behandeling de Akt-fosforylering en de activering ervan. Geïnactiveerd Akt induceert ook de activering van GSK-3 , wat betekent dat fosforylering niet wordt bereikt, dat wil zeggen dat het niveau van p-GSK-3 wordt verlaagd [7]. Volgens eerdere literatuur verlaagt het bovengrondse deel van Pueraria thunbergia MITF door de Akt/GSK-3-signaalroute in B16/F10-melanoomcellen te activeren [37]. Ook Huang et al. [38] toonde aan dat [6]-school p-Akt-expressie bevorderde en melanogenese-signalering in B16/F10-melanoomcellen remde. Geactiveerde GSK-3 reguleert de familie van de tyrosinasegenen door Ser289 van MITF te fosforyleren, waardoor de melanogenese wordt bevorderd. MITF is een belangrijke transcriptiefactor die bindt aan een promotor van het tyrosinasegen, en het verhoogt vervolgens de expressie van enzymen die verband houden met de proliferatie van melanocyten enmelanogenese[7]. Wanneer de expressie van tyrosinase wordt bevorderd door MITF, leidt dit vervolgens tot een verhoging van de niveaus van TRP-1 en TRP-2, en als resultaat produceren deze melanogene enzymen melanine [6]. Oxidatieve stress veroorzaakt door UV-licht stimuleert de melaninepigmentatie in de huid. Daarom is de wegvangende activiteit van radicalen of ROS effectief om de melanineproductie te onderdrukken, en polyfenolen met antioxiderende activiteit kunnen uitstekende whitening-effecten hebben [38]. Choi et al. [39] toonde aan dat Koreaanse bamboestengels (Phyllostachys nigra variëteit henosis) PKA/CREB-gemedieerde MITF downreguleerden via het wegvangen van ABTS/DPPH-radicalen. En een 70 procent ethanolisch extract van Nelumbo nucifera G. Leaf remde de expressie van MITF, tyrosinase en TRP's met antioxiderende activiteiten zoals het vermogen om elektronen te doneren en remming van xanthine-oxidase [40]. In dit experiment werd aangetoond dat ESB-behandeling de expressie van de MITF- en tyrosinase-genfamilie (tyrosinase en TRP-1) verminderde, die de oxidatie van DHICA tot DHI in de melanogeneseroute bevorderen (Figuur 5). Op basis van deze resultaten is aangetoond dat ESB IBMX-gemedieerde melanogenese downreguleert op basis van zijn superieureantioxidantEffecten.

Op basis van de eerdere literatuur werden de belangrijkste fenolische verbindingen in ESB geïdentificeerd die 1,3-O-di-caffeoylglycerol (Figuur 6B), tricine (Figuur 6C) en 9-HODE (Figuur 6D) [16 ,19,20]. Onder hen is 9-HODE, de meest voorkomende verbinding in ESB, een van de metabolieten van linolzuur en vertoont een witmakend effect op geïrriteerde huid door tyrosinase te remmen [41]. Ook is gemeld dat 9-HODE, in tegenstelling tot andere alifatische verbindingen, stabiel is in alle oxidatie-experimenten en een witmakend effect heeft op ROS-schade [41]. Ondertussen tricine (5,7-dihydroxy- 2-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)-4H-chromeen{{24 }}one) staat al lang bekend om zijn gunstige gezondheidseffecten, zoals antioxiderende, antivirale en antitumor-/antikankeractiviteiten [42-44]. Mu et al. [45] rapporteerde dat tricine een beter remmend effect op tyrosinase-activiteit vertoonde in vergelijking met arbutine als positieve controle. Bovendien, Meng et al. [46] meldde dat tricine geïsoleerd uit het methanolextract van jonge groene gerst (Hordeum vulgare L.) de melaninebiosynthese en tyrosinase-activiteit in B16/F10-melanoomcellen remde via de hydroxylgroep op de C-4'-positie en methoxygroepen aan de C-3',5'posities van het tricineskelet. Fenylpropanoïden zoals 1-O-caffeoylglycerol, dicaffeoylglyceriden en 1,3-O-dicaffeoylglycerol zijn organische verbindingen die door planten worden gesynthetiseerd uit fenylalanine en tyrosine. Van fenylpropanoïde en hun geglycosyleerde vormen werd gemeld dat ze krachtige antioxidanten zijn, hetzij door ROS direct op te vangen of door te werken als ketenbrekende peroxylradicaalvangers [47].

p-coumarinezuur, dat een chemische structuur heeft die lijkt op L-tyrosine, concurreert met L-tyrosine voor actieve plaatsen op tyrosinase [48]. Het staat bekend als een sterke tyrosinaseremmer en er werd gemeld dat het anti-melanogenese-effect sterker is dan structureel vergelijkbare verbindingen zoals kaneelzuur [48]. Daarnaast hebben An et al. [48] ​​meldde dat p-coumarinezuur, een bestanddeel van Sasa quelpaertensisNakai, de tyrosinase-activiteit remde met L-DOPA als substraat en de melanineproductie in B16/F10-melanoomcellen verminderde. Daarom kan worden aangenomen dat ESB een uitstekend witmakend effect heeft door middel van p-coumarinezuur. Verder vertoonden de MS-spectra van 1-O-caffeoylglycerol en 1-3-O-dicaffeoylglycerol vergelijkbare fragmentatiepatronen bij m/z 179, 161 en 135, en deze fragmenten werden gerapporteerd als cafeïnezuurresidu. Ze hebben een UV-spectrum dat vergelijkbaar is met dat van een cafeïnezuurderivaat met een λmax bij ongeveer 326 nm, en worden daarom beschouwd als een cafeïnezuurderivaat [48]. Er werd gemeld dat cafeïnezuur, een derivaat van verschillende verbindingen, een krachtige antioxidant is in vitro/in vivo en de tyrosinase-activiteit enmelanogenesein B16/F10-melanoomcellen. Bijgevolg kan worden aangenomen dat het anti-melanogene effect van ESB te wijten is aan:antioxidantenen huidblekende stoffen zoals asalifatische en fenolische verbindingen.

effecten van cistanche: anti-oxidatie

5. Conclusies

Om de mogelijkheid te evalueren als huidbleekmiddel van:Sorghum bicolor, antioxiderende en anti-melanogene effecten van ESB op door IBMX geïnduceerde melanogenese werden geëvalueerd in B16/F10-melanomacellen. ESB vertoonde significanteantioxidantactiviteiten in ABTS/DPPH radicale wegvangende activiteit en MDA-remmend effect. ESB verhinderde de eerste stap vanmelanogenesedoor remming van -glucosidase en tyrosinase met L-tyrosine en L-DOPA als substraten. De anti-melanogene effecten van ESB op IBMX-geïnduceerdmelanogenesewerden geëvalueerd in B16/F10-melanoomcellen, en de resultaten toonden aan dat ESB IBMX-geïnduceerde melanogenese in B16/F10-melanoomcellen remde. Ophoping van melanine werd geremd door neerwaartse regulatie van de expressie van MITF en de tyrosinase-genfamilie (tyrosinase en TRP-1) in IBMX-geïnduceerde melanogenese. De belangrijkste verbindingen van ESB werden geanalyseerd als 1,3-O-di-caffeoylglycerol, tricine en 9-HODE. Bijgevolg toonde ESB in vitro:antioxidantactiviteit en een anti-melanogeen effect in B16/F10-melanoomcellen, en zou dus kunnen worden gebruikt als een bleekmiddel voor de huid op de cosmeticamarkt.

anti-oxidatiecistanche tabletten