Apicale afschuifspanning Verbeterd organisch kationtransport in menselijke OCT2/MATE1-Getransfecteerde Madin-Darby-canine-niercellen hebben betrekking op ciliaire detectie

Voor meer informatie:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz en Shuvo Roy

Afdelingen Bio-engineering en Therapeutische Wetenschappen (AJ, PS, DLK, SR) en Kindergeneeskunde (PRB),

Universiteit van Californië, San Francisco (UCSF), San Francisco, Californië;

en Afdeling Geneeskunde, Afdeling Nefrologie, Vanderbilt Universitair Medisch Centrum, Nashville, Tennessee (NF, WF)

ABSTRACT

Actief vervoer doornierproximale tubuli spelen een belangrijke rol bij de dispositie van geneesmiddelen. Tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen, schattingen vannieruitscheiding zijn essentieel voor het bepalen van de dosis. Nierbioreactoren die fysiologische neven van de nier reproduceren, zoals flow-geïnduceerde schuifspanning, kunnen het gedrag van geneesmiddelen in vivo beter voorspellen dan de huidige in vitro-modellen. In deze studie onderzochten we de rol van schuifspanning op het actieve transport van 4-(4-(dimethylamino)-styryl)-N-methylpyridiniumjodide (ASP plus) door Madin-Darby hondenniercellenexogeen tot expressie brengen van de menselijke organische kationtransporters, organische kationtransporter 2 (OCT2) en multidrug en toxine-extrusie-eiwit 1 (MATE1). Cellen gekweekt in een parallelle plaat onder continue mediaperfusie vormden een strakke monolaag met een hoge barrière tegen inuline. Als reactie op toenemende niveaus van schuifspanning (0.2-2 dyne/cm), vertoonden cellen een overeenkomstige toename in transport van ASP plus , waarbij een maximale 42--voudige toename werd bereikt bij 2 dynes/cm² vergeleken met cellen die onder statische omstandigheden zijn gekweekt. Dit transport werd geremd met imipramine, wat aangeeft dat actief transport aanwezig was onder schuifspanningsomstandigheden. Cellen blootgesteld aan schuifspanning van 2 dyne/cm² vertoonden ook een toename in RNA-expressie van zowel getransfecteerde mensen als endogene OCT2 (3.7- en 2.0--voudig, respectievelijk). Verwijdering van trilharen door ammoniumsulfaat elimineerde de effecten van afschuiving op ASP plus transport bij 0.5 dyne/cm² zonder effect op ASP plus transport onder statische omstandigheden. Deze resultaten geven aan dat schuifspanning het actieve transport van organische kationen innierbuisvormigepitheelcellen op een cilia-afhankelijke manier.

Cistanche is goed voor de nierfunctie

Invoering

Ondanks grote vooruitgang in preklinische methoden voor de selectie van optimale kandidaat-geneesmiddelen, blijft de ontwikkeling van geneesmiddelen een lang en duur proces met een zeer lage opbrengst aan op de markt gebrachte nieuwe moleculaire entiteiten (Watkins, 2011). Een groot nadeel van preklinische modellen is het onvermogen om de klaring en toxiciteit bij mensen te voorspellen. Ongeveer 30 procent van de geneesmiddelen die succesvol zijn in preklinische studies faalt bij mensen als gevolg van onverwachte klaringswaarden of toxiciteiten (Kola en Landis, 2004).

De nier is een bijzonder belangrijk doelwit voor in vitro celcultuurmodellering omdat hij verantwoordelijk is voor de eliminatie van meer dan een derde van alle geneesmiddelen en de meeste metabolieten (Morrissey et al., 2013). Denierproximale tubulus is belangrijk voor het testen van geneesmiddelen tijdens de ontwikkeling omdat het het grootste deel van het actieve transport van kandidaat-geneesmiddelen uitvoert en bijzonder gevoelig is voor toxische schade (Giacomiet al., 2010). Denierbuisjeis een monolaag van epitheelcellen met filtraat dat over het apicale oppervlak stroomt. Een basaalmembraan ligt onder het tubulaire epitheel en aangrenzende peritubulaire capillairen zorgen voor de reabsorptie van water en salutes. De micro-omgeving van de proximale tubulus, met name vloeistofschuifspanning en apicobasale oncotische gradiënten, wordt onvolledig gereproduceerd door conventionele celkweektechnieken. Epitheelcelbioreactoren die opvallende in vivo fysiologie vastleggen, kunnen de nauwkeurigheid van klarings- en toxiciteitsvoorspellingen verbeteren die zijn afgeleid van in vitro-assays (Pfaller en Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Groeiend bewijs geeft aan dat de morfologie en functionaliteit van proximale tubuluscellen kan variëren met de groeiomgeving, zoals porositeit van het groeioppervlak, blootstelling aan vloeistof aan beide zijden en/of vloeistofschuifspanning. Eerder werk van Essig en Friedlander (2003), evenals van ons laboratorium (Ferrell et al.2010), heeft aangetoond dat tubulaire vloeistofstroom-geïnduceerde herschikking in het apicale actine-cytoskelet van proximale tubuluscellen (Ferrell et al., 2010) . Vervolgens hebben verschillende onderzoeken aangetoond dat schuifspanning de expressieniveaus en lokalisatie van meerdere opnames en effluxtransporters beïnvloedt, waaronder natrium-waterstof antiporter 3. Na/K-ATPase, glucosetransporters, epitheliaal natriumkanaal en de endocytosereceptoren, megaline en tubuline (Duan et al.,2010; Raghavan et al.,2014; Jansen et al..2016; Ernandez et al.,2018). Ander werk heeft aangetoond dat afschuifstroming in een buisvormig bioreactorsysteem oriënteert en verlengtnierbuisvormigcellen langs het stroompad (Venzac et al. 2018). In vitro bewijs geeft aan dat sommige veranderingen in de cytoskeletstructuur en transportfunctie waarschijnlijk verband houden met de mechanosensorische functie van cilia (Overgaard et al. 2009; Raghavan et al.2014); er zijn echter maar weinig onderzoeken die het effect van schuifspanning op geneesmiddeltransporteurs in niercellen hebben onderzocht. Verder is er weinig bekend over het effect van verschillende afschuifsnelheden op de celfunctionaliteit, met name bij langdurige blootstelling aan schuifspanning. De meeste onderzoeken hebben rekening gehouden met een enkele afschuifspanning en hebben alleen kortetermijnexperimenten uitgevoerd (1-6 uur), waardoor het moeilijk is om onderscheid te maken tussen de werkelijke effecten van afschuiving en de cellulaire stressrespons op abrupte veranderingen in de micro-omgeving (Duan et al.2010, Jang et al.2013: Maggiorani et al.2015).

Hier werd een microfluïdische bioreactor gebruikt om het effect van graduele niveaus van schuifspanning op de te onderzoekennierproximale tubuluscel medicijntransporters organische kationtransporter 2 (OCT2) en multidrug en toxine-extrusie-eiwit 1 (MATE1). We demonstreren dat toenemende apicale schuifspanning leidt tot toenemend organisch kationtransport en transporterexpressie en dat trilhaartjes betrokken zijn bij deze cellulaire reactie op schuifspanning.

Materialen en methodes

Fabricage en montage van apparaten. We hebben eerder ons ontwerp gepubliceerd voor een bioreactor met parallelle platen die een vloeistofstroompad van instelbare hoogte over de apicale zijde van de cellen en een statisch reservoir aan de basale zijde biedt (Brakeman et al., 2016). Voor het hier gepresenteerde werk hebben we ons vorige ontwerp aangepast om een ​​multiplexapparaat te maken met vier afzonderlijke stroompaden om vier biologische omstandigheden tegelijk te kunnen testen (Fig.1). Elk apparaat bestaat uit drie lagen: een basis met een apicaal reservoir van 5-ml, een middelste plaat voor het Snapwell-inzetstuk (Costar, Corning, Corning, NY) met een celoppervlak van 1,12 cm² en een bovenplaat met een basolateraal reservoir van 1-tot 2-ml. De borden

werden machinaal vervaardigd uit polysulfon om sterilisatie door autoclaveren mogelijk te maken. Lasergesneden siliconenpakkingen van 500- tot 1000-um hoogte werden tussen elke set platen geplaatst om de vloeistofcompartimenten af ​​te dichten en aan de apicale zijde om de kanaalhoogte te bepalen. De bioreactor werd met schroeven in elkaar gezet. Het mediareservoir en de bellenvanger waren een ingebouwde kolom. De in- en uitlaten waren met prikkeldraadverbindingen verbonden met Masterflex LS14 siliconenslangen met een binnendiameter van 1.6- mm (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Vloeistofstroom en dus apicale schaafspanning werden ingesteld en gecontroleerd door een peristaltische pomp (Cole Parmer).

Celcultuur en stroom. MDCK-cellen getransfecteerd met ofwel een lege vector of een paar opname- en effluxtransporters (hOCT2/hMATE1) (Konig et al..2011) werden geleverd door Dr. Martin Fromm (Erlangen, Duitsland) en gekweekt in minimaal essentieel medium met Earle's uitgebalanceerde zoutoplossing (UCSF Cell Culture Facility) met 10 procent foetaal runderserum (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) en 1 procent penicilline-streptomycine (UCSF Cell Culture Facility). Vijfhonderd microgram hygromycine per milliliter (UCSF Cell Culture Facility) en 100 mg/u ml geneticine (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) werd toegevoegd aan de media voor de dubbel getransfecteerde cellen. Voor flow-experimenten werd hOCT2/hMATE1 MDCK-cel werden uitgeplaat op de onderkant van Snapwell-inserts (Corning) met een dichtheid van 300,000 cellen/putje (250,000 cellen/cm"), gekweekt onder statische omstandigheden tot samenvloeiing en vervolgens in de bioreactor De apicale mediastroom werd gedurende 7 dagen verhoogd van 0,1 tot 1-6mlmin totdat de gewenste schuifspanning was bereikt en vervolgens 72 uur stabiel gelaten vóór het experiment Cellen werden onder statische omstandigheden gekweekt gedurende dezelfde tijd als de controles .

Immunofluorescentie. Cellen werden gefixeerd met 4 procent paraformaldehyde (Thermo Fisher Scientific), gepermeabiliseerd met 0,1 procent Triton-Xin PBS (Sigma-Aldrich) en geblokkeerd met runderserumalbumine (Sigma-Aldrich). Ze werden vervolgens gedurende 60 minuten geïncubeerd met 1:50 verdunning van Alexa 488-gelabelde zonula-occludens -1 monoklonaal antilichaam van muizen (Life Technologies, Carlsbad, CA) of een primair geacetyleerd monoklonaal antilichaam van tubuline (Life Technologies). Cellen behandeld met het a-tubuline-antilichaam werden vervolgens geïncubeerd met een secundair 561 anti-muisgeit-antilichaam (Life Technologies) en falloïdine (Thermo Fisher Scientific) voor F-actine-kleuring. Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een Nikon (Tokyo, Japan) spectrale confocale microscoop met een 40x olie-objectief.

Barrière prestaties. Inuline, een polymeer van 5000 Da, is een bekende marker van de glomerulaire filtratiesnelheid en is een marker van de lekkage van de proximale tubulus in vivo (Sohtell et al, 1983):

FITC-gelabelde inuline (Sigma-Aldrich) werd aan de apicale media toegevoegd en liet men door de apparaten stromen. Monsters werden elke 24 uur uit het basale reservoir verzameld en geanalyseerd op inuline-gehalte met behulp van een Genios Pro-fluorescentieplaatlezer (Tecan, Mannedorf, Zwitserland). De barrièrefunctie van de celmonolaag werd berekend op basis van inulineniveaus gemeten in de apicale en basale compartimenten zoals beschreven door eq.1.Hier is Capital de concentratie van inuline in het apicale compartiment en C Mal is de concentratie in het basale compartiment. Inulinelek werd berekend als de concentratie in het basale (donor)compartiment gedeeld door het celoppervlak na 24 uur.

ASP plus Transport. Getransduceerde transportergenen werden 24 uur vóór een transportexperiment geïnduceerd met 10 mM Na-butyraat (Sigma-Aldrich), zoals eerder beschreven (Konig et al, 2011). Indien van toepassing werden cellen gedurende 30 minuten geïncubeerd met een remmer （500 M imipramine of 1 mM cimetidine (Sigma-Aldrich)) aan de basale kant, gevolgd door de toevoeging van 25 μM 4-（4-dimethylamino）- styryl-N-methylpyridinium (ASP plus) (Life Technologies) en incubatie gedurende 1 uur. Monsters werden verzameld uit de apicale en basale media. Cellen werden vervolgens driemaal gespoeld met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing en gelyseerd voor meting van ASP plus accumulatie en transport. Transportexperimenten werden gelijktijdig uitgevoerd op cellen onder schuifspanning en gekweekt onder statische omstandigheden. ASP plus-concentratie werd gekwantificeerd op een Genios Pro fluorescentieplaatlezer (Tecan) bij een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 590 nm.

Eiwit kwantificering. Cellen werden gelyseerd met 1 procent SDS-10 M NaOH-lysisbuffer terwijl ze 's nachts werden geschud. Het eiwitgehalte werd gemeten met behulp van een standaard Pierce BCA-eiwittestkit (Thermo Fisher). Waar van toepassing werd het eiwitgehalte genormaliseerd naar het celgroeigebied.

RNA-expressie. RNA werd uit cellen geëxtraheerd met behulp van een RNeasy RNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) en cDNA werd gegenereerd met behulp van een scriptkit (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNA werd gebruikt voor de detectie van OCT2 en MATE1 van mensen en honden en dog P-glycoproteïne (P-GP) door kwantitatieve reverse transcriptase-polymerase kettingreactie met behulp van een Tagman-assay en probes (Applied Biosystems) op het Fast Realtime PCR-instrument (Applied Biosystems). Ribosomaal eiwit S18 (RS-18) werd gebruikt als huishoudcontrole. Het effect van schuifspanning op transporterexpressie werd geanalyseerd met behulp van de 4ACt-methode met behulp van transporterniveaus uitgedrukt ten opzichte van RS -18 (Peters et al.2007; Schmittgen en Livak,2008). P-GP werd gebruikt als een maat voor de globale effecten van schuifspanning op transporterexpressie.

Afweging. Cellen werden tot confluentie gekweekt en vervolgens 24 uur geïncubeerd in de afwezigheid of aanwezigheid van 30 mM ammoniumsulfaat (Fluka AG) vóór meting van ASP plus transport (Oxergard et al 2009). De aanwezigheid van trilhaartjes werd bepaald door beeldvorming van a-tubuline zoals reeds hierin beschreven.

Statistieken. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd met minimaal twee technische herhalingen binnen elk experiment. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD en grafisch weergegeven als box- en whiskerplots. Statistische analyses werden uitgevoerd door ongepaarde eenrichtings- of tweerichtingsanalyse van variantie en een P-waarde van<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Resultaten

Celmorfologie en barrièrefunctie. Immunofluo's recente analyse van cellen die onder stroom waren geplaatst, onthulde uniforme monolaagvorming met het tight-junction-eiwit, zonula occludens -1, gelokaliseerd in de nauwe verbindingen tussen cellen onder zowel statische als stroomomstandigheden (Fig. 2, A-C). Kwantificering van het totale eiwitgehalte toonde tot een 1,6-voudige toename van het eiwitgehalte per vierkante centimeter van de monolaag aan als reactie op schuifspanning (Fig. 2D). Vervolgens hebben we de permeabiliteit van inuline, een marker van proximale tubuluslekken, over de monolaag gemeten. Apparaten behielden een barrièreprestatie van 97,9 procent 6 1,42 procent gedurende 7 dagen kweken onder maximaal 2 dyne/cm2 schuifspanning (Fig. 2E), wat resulteerde in een uiteindelijke inulineleksnelheid op dag 6 van { {15}}.13–0.69 mg/cm2 per dag.

Effect van schuifspanning op organisch kationtransport. Transport van ASP plus , een auto-fluorescerend substraat van OCT2 en MATE1, werd gedurende 1 uur gemeten bij verschillende niveaus van schuifspanning（0.2-2 dynes/cm²）. MDCK-cellen die exogeen hOCT2 en hMATE1 tot expressie brengen, vertoonden een 4 2--voudige toename in ASP plus transport als reactie op schuifspanning van 2 dynes / cm² zoals weerspiegeld in metingen van zowel cellulaire accumulatie (Fig. 3A) als transcellulair transport (Fig. 3B). Het effect van schuifspanning op ASP plus accumulatie of transcellulair transport was vergelijkbaar bij een schuifspanning van 0.5 en 2 dyne/cm². Om te bepalen of actief ASP plus transport was verhoogd, werd het transport van ASP plus door cellen blootgesteld aan 0,2 dyne/cm schuifspanning gemeten met of zonder voorbehandeling met 500 uM imipramine, een OCT{{20} } en MATE1-specifieke remmer. ASP plus transport werd geremd door imipramine 60,3 procent ± 15,8 procent onder schuifspanningsomstandigheden vergeleken met 47,6 procent ± 19,7 procent onder statische omstandigheden (Fig. 3C).

Om deze waarneming beter te begrijpen, werd het effect van schuifspanning op de expressie van OCT2 bij de mens (getransfecteerd), OCT2 bij honden (endogeen) en P-GP bij honden (endogeen) gemeten in cellen die 72 uur na een langzame toename van afschuiving gedurende 7 dagen (Fig. 4). In vergelijking met cellen die onder statische omstandigheden waren gekweekt, vertoonden MDCK-cellen die waren blootgesteld aan afschuiving een verhoogde expressie van getransfecteerde menselijke en endogene OCT2 (respectievelijk tot 3.7- en 2.0--voudig), zonder significant effect op de expressie van getransfecteerd MATE1 of endogeen P-GP.

De rol van Cilia als reactie op Shear. Beeldvorming toonde aan dat dubbel getransfecteerde MDCK-cellen cilia tot expressie brengen onder zowel statische als stroomomstandigheden (Fig. 5, A en E). Blootstelling van de cellen aan 30 mM ammoniumsulfaat gedurende 24 uur veroorzaakte een volledig verlies van trilhaartjes (Fig. 5, C en G). Belangrijk is dat deciliatie geen grove effecten had op celmembraanverbindingen, zoals gemeten door beeldvorming van F-actine, dat tight-junction-eiwitten verankert op de celmembraanverbindingen in epitheelcellen (Fig. 5.D en HD (Stevenson en Begg. 1994). Hoewel er enige verdikking van de F-actine-kleuring in deze afbeeldingen is, was dit geen consistente bevinding, en daarom hebben we dit effect niet gekwantificeerd. Deciliatie had geen effect op het transport door cellen die onder statische omstandigheden werden gekweekt. elimineerde de effecten van schuifspanning op ASP plus transport in cellen blootgesteld aan 0,5 dyne/cm² schuifkracht (Fig. 6).

Discussie

De nier speelt een centrale rol bij de eliminatie van medicijnen in het menselijk lichaam. Het is belangrijk om de complexiteit van de nierfysiologie nauwkeurig na te bootsen voor in vitro geneesmiddelentests, met name met betrekking tot de vloeistofstroom. Er is aangetoond dat schuifspanning door vloeistofstroom de celmorfologie en ionentransporters in vitro beïnvloedt, maar er is weinig bekend over de effecten op medicijntransporters (Duan et al., 2010; Ferrell et al., 2012; Jansen et al., 2016) . Bovendien hebben de meeste eerdere onderzoeken alleen het effect van korte-termijn afschuiving (1-6 uur) gemeten, wat waarschijnlijk niet de effecten van schuifspanning volledig isoleert van andere cellulaire stressreacties (Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al..2015). In deze onderzoeken hebben we ons gericht op de effecten van aanhoudende (7 dagen) schuifspanning van de vloeistofstroom op medicijntransport om de aanhoudende schuifspanning die ervaren wordt doornierbuisvormigcellen in vivo.

Inzicht in hoe medicijntransporters reageren op aanhoudende schuifspanning kan in vitro voorspellingen van in vivo medicijnbehandeling door de nieren verbeteren. Nauwkeurig ontworpen in vitro-modellen van de nieren kunnen preklinische tests standaardiseren en het aantal falende geneesmiddelen verminderen.

In dit werk werd een microfluïdische bioreactor met parallelle platen gebruikt om de effecten te bepalen van aanhoudende schuifspanning op organisch kationtransport door OCT2 en MATE1 in eennierbuisjecellijn. Voor deze onderzoeken werden verschillende cellijnen overwogen, waaronder menselijke cellijnen zoals menselijke proximale tubuluscellen van de Hopfer-groep (Orosz et al, 2004) en RPTECs (CRL-4031: American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser et al., 2008), maar de dubbel getransfecteerde hOCT2 / hMATE1 MDCK-cellen werden om verschillende redenen als de meest geschikte keuze voor deze studie beschouwd. Ten eerste demonstreren de MDCK-cellen consequent een robuuste bevestiging aan de transwell-inserts, waardoor ze bestand zijn tegen de initiële spanning van de vloeistofstroom. Ten tweede vormen deze cellen strakke monolagen, wat lekkage voorkomt en essentieel is voor de studie van transcellulair transport van markersubstraten. Ten slotte zorgt exogene expressie van transporters voor een verbeterde detectie van actief transport en het effect van verstoringen.

Cellen die onder de stroom waren geplaatst, vormden een samenvloeiende monolaag en plaatsten een tight-junction-eiwit in de periferie van de cel. Ze behielden ook een hoge barrièrefunctie, zoals gemeten aan de hand van de inulinepermeabiliteit. Het vermogen van de epitheelcellen om een ​​monolaag te vormen die vloeistof- en eiwitlekken voorkomt, is uiterst belangrijk voor de goede werking van de tubulus. Hier was het lek door de MDCK-cellen minimaal met minder dan 1 ug/cm² per dag en significant lager dan dat door menselijke cellen. We hebben eerder aangetoond dat monolagen van menselijke niercellen een 10-20 ug/cm² per dag inulinelek hebben (Brakeman et al., 2016), wat de conclusie ondersteunt dat de hOCT2/hMATE1 MDCK-cellen een robuuste monolaag vormden.

Het transport van ASP plus was significant verhoogd in hOCT2/hMATE1 MDCK-cellen die gedurende 72 uur waren blootgesteld aan verschillende niveaus van schuifspanning in vergelijking met statische controles. ASP plus wordt opgenomen door OCT2(SLC22A2) en uitgestoten door MATE1 (SLC47A1), twee organische kationtransporters die samenwerken om deniersecretie van veelgebruikte medicijnen, zoals metformine en cisplatine (Biermann et al.2006; Wittwer et al.2013). Vergelijkbare effecten van schuifspanning zijn gemeld voor proximale tubulus-iontransporters. Verhogingen van de opname van albumine, de reabsorptie van ionen en de expressie en functie van megaline en tubuline zijn gemeld als reactie op verhoogde schuifspanning (Overgaard et al.2009; Duan et al.2010: Ferrell et al.2012:Raghavan et al., 2014). Blootstelling vannierproximale tubuluscellen aan schuifspanning worden ook geassocieerd met verminderde apoptose en sneller herstel van acute cisplatinetoxiciteit en verhoogde remming van organisch aniontransport (Jang et al.2013). Aangezien schuifspanning van de vloeistofstroom constant aanwezig is in de proximale tubulus, ondersteunen deze bevindingen gezamenlijk het gebruik van meer fysiologische in vitro modelsystemen om de dispositie en toxiciteit van niermedicijnen te voorspellen. Het is opmerkelijk dat er geen significant verschil is in transporterfunctie tussen 0.5 en 2.0 dynes/cm² schuifspanning. Eerdere studies door Essig en Friedlander (2003) hadden uitgewezen dat een minimum afschuivingsniveau van 0,17 dyne/cm2 vereist is om een ​​verandering in celmorfologie teweeg te brengen, en andere studies hebben effecten gemeten op fysiologie tot 1 dyne/cm² (Duan et al., 2010). Dit is de eerste studie die de effecten van een reeks hogere en aanhoudende schuifspanningsniveaus op de functionaliteit van renale geneesmiddeltransporteurs onderzoekt, en het is mogelijk dat de grootte van het biologische verschil tussen de 0,5 en 2,0 dyne/cm² schuifspanning die we geëvalueerd, was niet groot genoeg om de identificatie van verschillen tussen deze niveaus van schuifspanning in onze tests mogelijk te maken. Hoewel verder onderzoek nodig is, werpen onze resultaten licht op de vereiste voorwaarden voor fysiologisch relevante modellen en de effecten van verhoogde schuifspanningsniveaus als gevolg van de ziekte op de behandeling van niermedicijnen.

Een van de beperkingen van onze experimentele methoden is dat we alleen transport bij pH 7,4 hebben aangepakt met behulp van media met pH 7,4 aan zowel apicale als basale zijden, die de experimentele methoden nabootsen die eerder zijn beschreven voor de hOCT2 / hMATE1 MDCK-cellen (Konig et al..2011). Een apicale tot basale pH-gradiënt kan de OCT2- en MATE1-functie beïnvloeden, en er is typisch een pH-gradiënt onder fysiologische omstandigheden (Muller et al., 2013). Onze methoden beperkten daarom ons vermogen om de interactie tussen een apicale tot basale pH-gradiënt en schuifspanning op de OCT2- en MATE1-functie te evalueren. Aangezien we in alle experimentele omstandigheden een consistente pH van 7,4 hebben gebruikt, is het onwaarschijnlijk dat dit ontbreken van een pH-gradiënt onze bevindingen heeft beïnvloed, maar mogelijk beperkt het de toepasbaarheid van onze bevindingen op OCT2- en MATE1-transport in de aanwezigheid van een apicale tot basale pH-gradiënt.

Verrassend genoeg was de mRNA-expressie van getransfecteerd menselijk en endogeen OCT2 verhoogd in cellen die waren blootgesteld aan alle niveaus van schuifspanning in vergelijking met statische controles. Deze opregulatie van transporterexpressie was specifiek, zonder meetbaar effect op endogene P-GP-expressie of getransfecteerde MATE1. De opregulatie van transporterexpressie geeft inzicht in het mechanisme achter het verhoogde transport en kan het gevolg zijn van verhoogde mRNA-stabiliteit of verhoogde mRNA-transcriptie. Het is interessant om op te merken dat zowel de getransfecteerde als de endogene transporters opgereguleerd waren, wat onverwacht is aangezien getransfecteerde OCT2 tot expressie werd gebracht onder een cytomegalovirus-promoter en niet onderhevig zou moeten zijn aan endogene regulerende mechanismen voor genexpressie. Hoewel verrassend, is deze waarneming niet ongekend. Een vergelijkbaar effect op met OAT1 getransfecteerde proximale tubuluscellen die zijn blootgesteld aan perfusie is gemeld, maar het mechanisme voor de verhoogde expressie blijft onduidelijk (Jansen et al., 2016). In een ander onderzoek bleek Nrf2-signalering een rol te spelen bij het verhogen van de endogene MATE 2- K-expressie als reactie op schuifspanning (Fukuda et al., 2017). Nader onderzoek hiernaar is geboden en zal onderwerp zijn van toekomstig onderzoek.

We hebben ook vastgesteld dat de introductie van apicale afschuifstroom het eiwitgehalte per vierkante centimeter cellen verhoogde. Dit effect was even groot voor zowel 0,5 als 2 dynes/cm² shear, vergelijkbaar met het effect dat werd waargenomen voor mRNA-expressie en ASP plus transport. Er is enig bewijs dat schuifspanning leidt tot groterenierepitheelcellen, wat zou resulteren in een groter volume cellen per vierkante centimeter en dus een waarschijnlijke toename van eiwit per vierkante centimeter; dit eerder gepubliceerde fenomeen was echter slechts een kleine observatie in een grotere hoeveelheid gegevens en niet gekwantificeerd (Long et al., 2017). De toename van het totale eiwit in cellen die worden gekweekt in de aanwezigheid van apicale afschuifstroom, kan het normale eiwitgehalte voor gezond vertegenwoordigennierbuisvormigepitheelcellen die alleen kunnen worden bereikt door de cellen bloot te stellen aan apicale afschuifstroming. Daarom kunnen de lagere niveaus van eiwitgehalte in cellen die in statische kweek zijn gekweekt, een abnormale cellulaire toestand vertegenwoordigen, zoals klinisch zou kunnen voorkomen in situaties met een lage apicale filtraatstroom, zoals acuut nierletsel. Dit fenomeen verdient nader onderzoek.

Van cilia is bekend dat ze mechanosensorische rollen hebben in de proximale tubulus (Raghavan en Weisz,2016). Om te bepalen of ze een cruciale rol spelen in het verhoogde OCT2- en MATE1-gemedieerde transport dat hier wordt gerapporteerd, werd daarom het effect van trilhaarverwijdering op de transporterfunctie gemeten. De volledige blokkade van afschuifafhankelijke toename van ASP plus transport door verwijdering van trilhaartjes in onze onderzoeken is vergelijkbaar met het effect dat werd gevonden in onderzoeken van Raghavan et al. (2014), die een cilia-afhankelijke opregulatie in endocytose aantoonde als reactie op vloeistofstroom. Ammoniumsulfaat heeft waarschijnlijk andere niet-gekarakteriseerde effecten op het celgedrag en de functionaliteit die indirect van invloed kunnen zijn op het transport van opgeloste stoffen. Ondanks mogelijke off-target effecten, test deze methode van deciliatie de rol van ciliaire sensing op de transporter-gemedieerde beweging van organische opgeloste stoffen. Het mechanisme van signalering tussen de mechano-sensorische eiwitten in de cilia en de transporter is momenteel onbekend. Een hypothese is dat de functie van de organische kationtransporters wordt veranderd door veranderd ionentransport. Het is bekend dat het verwijderen van trilhaartjes de beweeglijkheid van opgeloste stoffen in de proximale tubuluscellen verandert, met name door Nat/K plus te verminderen. ATPase-membraanlokalisatie en modificatie van paracellulair transport (Overgaard et al., 2009). Het is mogelijk dat dit resulteert in veranderingen in de MATE1-functie, een antiporter die afhankelijk is van de H-gradiënt. Een andere hypothese is dat detectie van schuifspanning de expressie van organische kationtransporters beïnvloedt. Schuifspanning moduleert MATE 2- K-functie via Nrf2-signalering (Fukuda et al., 2017). Andere organische kationtransporters kunnen op dezelfde manier reageren op schuifspanning, die zou worden geëlimineerd wanneer de mechanosensorische trilhaartjes worden verwijderd. Veel hiervan is onbekend en verdient nader onderzoek. Interessant is dat verwijdering van trilharen geen significant effect had op ASP plus transport door cellen blootgesteld aan 0,2 dyne/cm² schuifspanning, maar een robuust effect werd waargenomen wanneer schuifspanning werd verhoogd tot 0,5 dyne/cm². Dit suggereert dat de trilharen een drempelwaarde voor schuifspanning voelen; op hun beurt signaleren cilia veranderingen in transporterexpressie en -functie voordat meetbare effecten op transport worden verwacht. Over het algemeen geeft de afhankelijkheid van organisch kationtransport van ciliaire detectie van schuifspanning inzicht in de betrokken mechanosensorische signaalroute en het minimale stressniveau dat nodig kan zijn om een ​​robuuste respons op schuifkracht teweeg te brengen.

Samengevat tonen deze gegevens aan dat schuifspanning van vloeistofstroom een ​​significant effect heeft op de functie en expressie van organische kationentransporters in MDCK-cellen. Bovendien was de opregulatie van organisch kationtransport afhankelijk van de aanwezigheid van trilhaartjes. We stellen voor dat apicale schuifspanning een belangrijk onderdeel is van elke in vitro modellering vannierbuisvormigcellen en is waarschijnlijk een belangrijk onderdeel van het modelleren van de renale secretoire klaring en nefrotoxiciteit van geneesmiddelen. Het specifieke mechanisme waarmee mechanische stresssignalen de activiteit en expressie van de transporter verhogen, is nog onduidelijk en vereist verder onderzoek.

Referenties

Astashkina A, Mann B en Grainger DW (2012) Een kritische evaluatie van in vitro celcultuurmodellen voor high-throughput drugscreening en toxiciteit. Pharmacol Ther 134:82-106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E en Ciarimboli G (2006) Karakterisering van regulerende mechanismen en toestanden van menselijke organische kationtransporter 2. Am J Physiol Cell Fysiol 290:C1521-C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH en Ferrell N (2016) Een modulaire microfluïdische bioreactor met verbeterde doorvoer voor evaluatie van gepolariseerde nierepitheelcellen. Biomicrofluïdica 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S en Wang T (2010) Door schuifspanning geïnduceerde veranderingen van lokalisatie en expressie van membraantransporters in proximale tubuluscellen van muizen. Proc Natl Acad Sci VS 107:21860-21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY en Feraille E (2018) Union-nefrectomie en apicale vloeistofschuifspanning verminderen de ENaC-abundantie in het verzamelen van hoofdcellen van het kanaal. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763-F772.

Essig M en Friedlander G (2003) Tubulaire schuifspanning en fenotype van renale proximale tubulaire cellen. J Am Soc Nephrol 14 (Suppl 1): S33-S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD en Fissell WH (2010) Een microfluïdische bioreactor met geïntegreerde transepitheliale elektrische weerstand (TEER) meetelektroden voor evaluatie van nierepitheelcellen. Biotechnol Bioeng 107:707-716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT en Fissell WH (2012) Albuminebehandeling door renale tubulaire epitheelcellen in een microfluïdische bioreactor. Biotechnol Bioeng 109:797-803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT en Fissell WH (2012) Een microfluïdische bioreactor voor epitheelcelstudies onder vloeistofschuifspanning. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M en Kawamata Y (2017) Vloeistofschuifspanning stimuleert MATE2-K-expressie via Nrf2-padactivering. Biochem Biophys Res Commun 484:358-364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM, et al.; International Transporter Consortium (2010) Membraantransporters bij de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nat Rev Drug Discov 9: 215-236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY en Ingber DE (2013) Proximale tubulus-op-een-chip van de menselijke nier voor geneesmiddelentransport en beoordeling van nefrotoxiciteit. Integr Biol 5:1119-1129.

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF, et al. (2016) Bioengineered niertubuli scheiden efficiënt uremische toxines uit. Wetenschappelijke Rep 6:26715.

Kola I en Landis J (2004) Kan de farmaceutische industrie het verloop verminderen? Nat Rev Drug Discov 3:711-715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C en Fromm MF (2011) Dubbel getransfecteerde MDCK-cellen die menselijke OCT1 / MATE1 of OCT2 / MATE1 tot expressie brengen: determinanten van opname en transcellulaire translocatie van organische kationen. BrJ Pharmacol 163:546-555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ en Weisz OA (2017) Proximale tubulus apicale endocytose wordt gemoduleerd door vloeistofschuifspanning via een mTOR-afhankelijke route. Mol Biol-cel 28:2508-2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL, et al. (2015) Door schuifspanning geïnduceerde verandering van epitheliale organisatie in menselijke niertubulaire cellen. PLoS Een 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L en Giacomini KM (2013) Niertransporters bij de ontwikkeling van geneesmiddelen. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503-529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K en Fromm MF (2013) De rol van organische kationtransporter OCT2 en multidrug- en toxine-extrusie-eiwitten MATE1 en MATE2-K voor transport en geneesmiddelinteracties van het antivirale lamivudine. Biochem Pharmacol 86:808-815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI, et al. (2004) Groei, onsterfelijkheid en differentiatiepotentieel van normale volwassen menselijke proximale tubuluscellen. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22-34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A en Yeaman C (2009) Deciliatie wordt geassocieerd met dramatische hermodellering van epitheelcelverbindingen en oppervlaktedomeinen. Mol Biol-cel 20:102-113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR en Day MJ (2007) Ontwikkeling en toepassing van meerdere interne referentie (huishoudster) genassays voor nauwkeurige normalisatie van genexpressieonderzoeken bij honden. Dierenarts Immunol Immunopathol 117:55-66.

Pfaller W en Gstraunthaler G (1998) Nefrotoxiciteitstesten in vitro--wat we weten en wat we moeten weten. Environ Health Perspect 106 (Suppl 2): ​​559-569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD en Weisz OA (2014) Afschuifstress-afhankelijke regulatie van apicale endocytose in proximale niertubuluscellen gemedieerd door primaire cilia. Proc Natl Acad Sci VS 111:8506-8511.

Raghavan V en Weisz OA (2016) De rol van mechanosensorisch onderscheiden bij het reguleren van de proximale tubulusfunctie. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1-F5.

Schmittgen TD en Livak KJ (2008) Analyse van real-time PCR-gegevens met de vergelijkende C(T)-methode. Nat Protoc 3:1011-1108.

Sohtell M, Karlmark B en Ulfendahl H (1983) FITC-inuline als marker voor niertubuli bij de rat. Acta Physiol Scand 119:313-316.

Stevenson BR en Begg DA (1994) Concentratie-afhankelijke effecten van cytochalasine D op tight junctions en actinefilamenten in MDCK-epitheelcellen. J Cell Sci 107: 367-375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S, et al. (2018) Engineering van kleine buisjes met veranderingen in diameter voor de studie van de organisatie van niercellen. Biomicrofluïdica 12: 024114.

Watkins PB (2011) Drugsveiligheidswetenschappen en het knelpunt in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Clin Pharmacol Ther 89:788-790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J en Grillari-Voglauer R (2008) hTERT alleen vereeuwigt epitheelcellen van proximale niertubuli zonder hun functionele kenmerken te veranderen. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y en Giacomini KM (2013) Ontdekking van krachtige, selectieve multidrug- en toxine-extrusietransporter 1-remmers (MATE1, SLC47A1) door middel van profilering van geneesmiddelen op recept en computationele modellering. J Med Chem 56:781-795.