Gunstige effecten van echinacoside op diabetische cardiomyopathie bij diabetische Db/Db-muizen

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Xiang Zhang & Yarong Hao

Invoering

Diabetische cardiomyopathie (DCM) is een belangrijke complicatie van diabetes, met een hoge morbiditeit en een hoog risico op hart- en vaatziekten en mortaliteit bij diabetespatiënten.1 De incidentie van DCM bij patiënten met een voorgeschiedenis van diabetes Langer dan of gelijk aan 5 jaar is meer dan 44,4 procent, wat stijgt tot 56 procent na 8 jaar.2,3 DCM is een soort primaire cardiomyopathie, die zich manifesteert als structurele en functionele hartafwijkingen veroorzaakt door myocardiale fibrose-celapoptose en microvasculaire laesies bij diabetespatiënten zonder ischemische of hypertensieve hartziekte en kan hartritmestoornissen veroorzaken met shock van cardiale oorsprong en plotselinge dood bij hartfalen.4 Vanwege de complexe pathogenese van DCM en de diagnose ervan in gevorderde stadia, bestaan ​​er geen effectieve behandelingen.5 Hyperglykemie is de initiërende factor tijdens de pathogenese van DCM. Langdurige hyperglykemie resulteert in een verstoord glucose- en lipidenmetabolisme in de cardiomyocyten van diabetespatiënten, wat leidt tot beschadiging van vasculaire endotheelcellen en andere weefsels, wat pathologische veranderingen bevordert, waaronder hypertrofie, necrose, apoptose en interstitiële fibrose van het myocard.6,7 Glucose en lipiden stofwisselingsstoornissen zijn de sleutel tot de pathologische mechanismen van DCM. De effectieve controle van het energiemetabolisme in cardiomyocyten vormt daarom een ​​belangrijke therapeutische strategie voor DCM.

cistanche tubulosa traktatieDiabetische cardiomyopathie

Myocardiale lipidenophoping in DCM verergert de progressie van hartfalen. PPAR- is een belangrijke regulator van verschillende verwante genen in het vetzuuroxidatiesysteem van celperoxidasen, mitochondriën en microsomen, en speelt een sleutelrol tijdens het lipidenmetabolisme en de regulatie van ontsteking en immuniteit.8 PPAR- verbetert het lipidenmetabolisme door mitochondriale en peroxidase vetzuur beta-oxidatie, gemedieerd door carnitine palmitoyl transferase-I (CPT-I).9 De oxidatie van lange en vertakte vetzuren10 vermindert de synthese en assemblage van lipoproteïnen en VLDL.11 De indirecte regulatie van galzuursynthese bevordert de uitscheiding van cholesterol12 en remt de expressie van inflammatoire genen. PPAR-expressie in de lever is significant lager bij patiënten met niet-alcoholische leververvetting of in diermodellen met langdurige vetconsumptie.13,14 Everett et al toonden aan dat de niveaus van lever-geassocieerde vrije vetzuren significant toenamen in PPAR-knock-out muismodellen als gevolg van verzwakt lipidemetabolisme, wat leversteatose bevordert.15 Deze bevindingen suggereren dat PPAR- een belangrijke rol speelt in de pathogenese van lipidemetabolisme.

Echinoside (ECH) is een natuurlijke verbinding die wordt geïsoleerd uit de stengels vancistanche tubulosa.De actieve chemische stof van ECH is een fenylethanoïde, die antioxiderende, antivermoeidheids-, antitumor- en ontstekingsremmende effecten vertoont en de geheugen-, zenuw- en leverbescherming kan verbeteren en de immuunregulatie kan verbeteren.16,17 In de studie over db/db diabetische muizen, bleek dat ECH de insulineresistentie kon verbeteren, het HDL-niveau kon verhogen en de TG-, TC- en LDL-niveaus kon verlagen, wat aangeeft dat ECH het diabetische lipidenmetabolisme effectief zou kunnen verbeteren.18 Bovendien hebben Shimoda et al bewezen dat echinacoside zou het lipidenmetabolisme kunnen beïnvloeden door mRNA gerelateerd aan hepatobiliair steroltransport te reguleren

en metabolisme.19 Eerdere studies hebben aangetoond dat ECH de expressie van TGF- en zijn stroomafwaartse genen reguleert om nierfibrose bij db/db-muizen te verbeteren.20 In deze studie, om de beschermende effecten van ECH op myocardcelbeschadiging bij DCM en om de potentiële moleculaire mechanismen ervan te onderzoeken, gebruikten we db/db-muizen als een DCM-ziektemodel en onderzochten we de regulerende mechanismen van ECH op eiwitten die glucose- en lipidemetabolismestoornissen, oxidatieve stress en apoptose in cardiomyocyten beheersen. Ons doel was om een ​​theoretische basis te bieden voor de effectieve behandeling van DCM.

cistanche tubulosa

Materialen en methodes

Chemicaliën en reagentia

ECH-poeder (94% zuiverheid gedetecteerd door HPLC, batchnummer 190906) (supplement figuur 1) werd verkregen van Shanghai Medical Science Company, Ltd. (Shanghai, China). ECH werd opgelost in water tot 2 mg/ml en in het donker bewaard bij 4 graden. ECH werd toegediend in een dosis van 100-500 mg/kg·d en significant verlaagd

bloedglucose en verbeterde bloedlipideniveaus.18 ECH vertoonde dosisafhankelijke hypoglykemische en anti-hyperlipidemische effecten.

Proefdieren en behandeling

Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH Pub. No 85-23, herzien 1996). Protocollen werden goedgekeurd door de experimentele dierethiekcommissie en het Animal Feeding Center van Renmin Hospital van de Wuhan University (Wuhan, China, nr. 20190517). Volwassen mannelijke C57BLKS/J db/db-muizen en db/m-muizen (SPF-kwaliteit) werden gekocht bij Nanjing University-Nanjing Biomedical Research Institute (Nanjing, Volksrepubliek China, nummer: SCXK (Sue) 2018-0001). Dieren werden gekooid in het Animal Center van Renmin Hospital (Wuhan, Volksrepubliek China) bij kamertemperatuur (20 graden), relatieve vochtigheid van 50 procent -60 procent en onderworpen aan een 12-u licht/ donkere cyclus. Adaptieve voeding werd gedurende 1 uur uitgevoerd en er werden geen hypoglycemische geneesmiddelen toegediend.

Na quarantaine werden db/db-muizen willekeurig toegewezen aan de diabetesmodelgroep (db/db-groep, n{{0}}), ECH-behandelingsgroep (db/db plus ECH-groep, n=11 ) of db/m-controlegroep (db/m, n=9). Na 8 weken kregen muizen in de db/db- en db/m-groep gedurende 10 weken oraal 0,05 ml/10g lichaamsgewicht zoutoplossing toegediend, terwijl muizen in de db/db plus ECH-groep 300 mg/(kg/d) oraal toegediend kregen.

ECH volgens lichaamsgewicht gedurende 10 weken. De lichaamsgewichten van de drie groepen muizen werden wekelijks gecontroleerd en voeding, drinken en activiteit werden beoordeeld. Nadat muizen 8 uur hadden gevast, werden om de 2 weken bloedmonsters (~ 50 ul) genomen van het einde van de staart met een bloedglucosemeter en testpapier (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, VS) om de bloedglucosespiegels te bepalen . Na 10 weken interventie werden muizen verdoofd door intraperitoneale injectie met 2 procent pentobarbital-natrium (Shanghai Harvest Company, Shanghai, Volksrepubliek China) (100 mg/kg). Bloed werd verzameld na het inbrengen van een capillaire naald en serum werd snel gescheiden en bewaard bij -80 graden voor analyse. Na hartperfusie met koude PBS om het bloed te verwijderen, werd vrij PBS verwijderd met filtreerpapier. Hartweefsel werd gescheiden en gewogen, en het droge gewicht van het hart werd gemeten. De buik van muizen werd geschoren, de buik werd geopend na desinfectie met alcohol (70 procent) en het onderhuidse vetweefsel van de buik werd snel verwijderd en nat gewogen. Het scheenbeen van de muizen werd geïsoleerd en gemeten. Harthypertrofie werd beoordeeld door de verhouding van het hartgewicht tot de tibiale lengte (HW/TL) (mg/mm). Hartweefsels werden gefixeerd met 4 procent paraformaldehyde (Google biotechnologie, Wuhan, Volksrepubliek China) en er werden biopsieën uitgevoerd om de morfologie van myocardweefsel te volgen. Het resterende hartweefsel werd gedurende 1 uur in vloeibare stikstof geplaatst en bewaard bij -80 graden voorafgaand aan RT-PCR en Western-blot-analyse.

Echocardiografie

Echografie (VisualSonics, Toronto, ON, Canada) werd aan het einde van het experiment uitgevoerd voor echocardiografische metingen. Muizen werden gedurende een half uur verdoofd door intraperitoneale injectie van 4 procent chloraalhydraat bij 30 mg/kg,21 geschoren om de borstkas bloot te leggen en op een vlakke plaat gefixeerd. De linker ventriculaire systolische diameter (DVD's), LV diastolische diameter (LVD), LV ejectiefractie (EF) en LV fractionele verkorting (FS) werden bepaald.

Metabolische en biochemische parameters

Op een leeftijd van 18 weken werden bloedmonsters gedurende 20 minuten bij 4 graden gecentrifugeerd voor het verzamelen van serum. Een totale geautomatiseerde biochemische analysator (ADVID2400, Tokyo, Japan) werd gebruikt om totaal cholesterol (TC), triglyceriden (TG), vrije vetzuren (FFA's), high-density lipoproteïne-cholesterol (HDL-c) en lage dichtheid te detecteren lipoproteïne-cholesterol (LDL-c) in het serum.

Anti-oxidatie: cistanche tubulosa

Oxidatie-index en antioxidantniveaus

Verse linkerventrikel myocardiale weefsels (50 mg) van elke groep werden verkregen. De niveaus van SOD, GSH-px en MDA in de myocardiale cellen werden bepaald met behulp van commerciële kits (Nanjing Jiangcheng Bioengineering Institute, China).

Trichrome, Tunel en Sudan II-kleuring Het linkerventrikelgebied van het myocardiale weefsel van elke groep muizen werd 24 uur gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde, in paraffine ingebed, in coupes gesneden en HE-gekleurd. Pathologische en morfologische veranderingen van de myocardiale vezels van elke groep muizen werden waargenomen onder lichtmicroscopie (JEOL, Tokyo, Japan). Cardiale myocyte-apoptose werd gedetecteerd door Tunel-assays (nummer 11684817910, Roche, VS). Hartweefsel werd voorbehandeld met paraformaldehyde, ingebed en in plakjes gesneden. Secties werden gewassen met xyleen I (Shanghai, Volksrepubliek China) (20 min) -xyleen II (20 min) - watervrije ethanol I (10 min) - watervrije ethanol II (10 min) −95 procent alcohol (5 min){{ 14}} procent alcohol (5 min)-80 procent alcohol (5 min) −70 procent alcohol (5 min) en gedestilleerd water. De coupes werden door schudden gedroogd en histochemische borstelringen werden gebruikt om vloeistofverlies te voorkomen. Protease K werd aan de ringen toegevoegd om het weefsel te bedekken. Na incubatie gedurende 15 minuten bij 37°C werden de objectglaasjes in PBS (pH 7,4) geplaatst en gewassen in een ontkleurende schudder (driemaal gedurende 5 minuten). Reagentia 1 (TdT) en 2 (dUTP) werden gemengd in een verhouding van 1:9 en toegevoegd aan de binnenbekleding van het weefsel. De mengsels werden gedurende 60 minuten bij 37°C in een waterbad geïncubeerd. Een kleine hoeveelheid water werd toegevoegd om de vochtigheid te handhaven. Dia's werden gespoeld in PBS en DAPI gekleurd (Aspen biologisch, Wuhan, Volksrepubliek China) gedurende 5 minuten in het donker. De objectglaasjes werden gespoeld in PBS en gemonteerd met behulp van een anti-fluorescentiedovend middel. Secties werden gevisualiseerd door fluorescentiemicroscopie en afgebeeld. Soedan II-kleuring werd gebruikt om lipidenaccumulatie in de hartmyocyten waar te nemen. Linkerventrikelweefsels werden gedurende 30 minuten gefixeerd in 10 procent paraformaldehyde, gekleurd met Sudan rood II (Gefen, Shanghai, Volksrepubliek China) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, ontkleurd met 75 procent alcohol en opnieuw gekleurd in PBS gedurende 15 minuten . De verhouding van de myocardiale fibrose tot het totale oppervlak in Masson's gekleurde trichroomcoupes werd bepaald met behulp van Image-Pro Plus kwantitatieve software. Dia's werden gemonteerd met behulp van glycerinegelatine en afgebeeld via microscopie.

Resultaten

Effecten van ECH op Db/Db-muizen

Muizen in de db/db-groepen vertoonden duidelijke polyfagie en polyurie. De lichaamsafmetingen waren ook significant groter dan die van de db/m-muizen. Het lichaamsgewicht in de db/db-groep nam significant toe ten opzichte van de db/m-groep (Figuur 1A; **p<0.01). body="" weights="" of="" the="" db/db="" +="" ech="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" of="" the="" db/="" db="" group="" after="" 10="" weeks="" of="" ech="" treatment="" (figure="" 1a;=""><0.05). at="" week="" 15,="" the="" difference="" in="" body="" weight="" of="" each="" group="" gradually="" appeared="" after="" ech="" intervention.="" the="" abdominal="" fat="" thickness="" of="" mice="" in="" the="" db/db="" group="" was="" higher="" than="" those="" in="" the="" db/m="" group="" (figure="" 2b;=""><0.01). ech,="" therefore,="" improves="" obesity="" in="" db/db="" mice,="" the="" specific="" mechanisms="" of="" which="" require="" further="">

De nuchtere bloedglucosespiegels werden wekelijks beoordeeld. Zoals getoond in figuur 1B, vergeleken met db/m-muizen, namen de nuchtere bloedglucosespiegels van de db/db-muizen significant toe met de leeftijd en vertoonden duidelijke hyperglykemie (Figuur 1B; *p<0.01). over="" a="" 10="" week="" period,="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/db="" and="" db/db="" +="" ech="" group="" increased,="" whilst="" glucose="" levels="" in="" the="" db/m="" group="" remained="" stable.="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/="" db="" +="" ech="" group="" were="" slower="" than="" those="" of="" the="" db/db="" group="" (figure="" 1b;=""><0.01), suggesting="" that="" ech="" markedly="" improved="" hyperglycemia="" in="" db/db="" diabetic="" mice.="" we="" speculated="" that="" ech="" could="" promote="" the="" synthesis="" of="" liver="" glycogen="" and="" inhibited="" the="" activity="" of="" α-glucosidase="" to="" suppressed="" glucose="" transport="" in="" the="" small="" intestine,="" significantly="" contributing="" to="">

Discussie

Diabetische cardiomyopathie wordt over het algemeen verdeeld in vier fasen. In de eerste fase nam de linkerventrikelmassa toe, diastolische disfunctie en ejectiefractie (EF) normaal. Zelfs klinisch asymptomatisch nam de myocardiale fibrose toe, nam de vroege diastolische vulling af en nam de einddiastolische druk van het linkerventrikel toe.22 De tweede fase wordt gekenmerkt door een toegenomen linkerventrikelmassa, verdikte ventriculaire wanden, systolische en diastolische disfunctie (EF<50%), mild="" cardiac="" dilatation.="" in="" the="" third="" stage,="" diastolic="" dysfunction="" and="" arterial="" hypertension="" contribute="" to="" systolic="" dysfunction="" and="" microangiopathy.="" stage="" iv,="" moderate-severe="" systolic="" dysfunction,="" cardiac="" dilatation,="" fibrosis,="" and="" microvascular="" and="" macrovascular="" lesions="" cause="" severe="" and="" irreversible="" changes="" in="" heart="" tissue="" ultimately.26="" myocardial="" cell="" apoptosis,="" necrosis,="" hypertrophy,="" and="" fibrosis="" increase="" leading="" to="" disorders="" of="" diastolic="" and="" systolic="" functioning.6,27="" this="" eventually="" develops="" into="" ischemic="" heart="" disease="" and="" heart="" failure.28="" in="" this="" study,="" blood="" glucose="" and="" serum="" lipid="" levels="" of="" db/db="" mice="" significantly="" increased="" in="" the="" db/db="" group.="" symptoms="" of="" obesity="" were="" also="" observed,="" including="" body="" weight="" changes="" and="" increases="" in="" the="" rate="" of="" hw/tl="" compared="" to="" the="" db/m="" group.="" he="" staining="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" of="" the="" heart="" showed="" obvious="" pathological="" changes="" in="" the="" cardiac="" myocytes="" of="" the="" db/db="" group,="" including="" hypertrophy="" and="" necrosis,="" disordered="" cardiac="" myocytes,="" and="" high="" levels="" of="" extracellular="" matrix="" deposition.="" these="" data="" indicate="" that="" db/db="" mice="" exhibit="" early="" dcm="" under="" long-term="">

ATP is de basisenergiebron voor het hart. Cardiale energie wordt geleverd door de oxidatie en afbraak van FA, die goed is voor ~70 procent van de cardiale energievoorziening.29 De rest wordt geleverd door koolhydraten zoals glucose en melkzuur.30 Diabetische harten zijn onderhevig aan een verhoogd energieverbruik en onevenwichtigheden in myocardcapaciteit, de belangrijkste oorzaak van metabole aandoeningen van het hart, waaronder een verlaagd glucosemetabolisme en een verhoogd FA-metabolisme. Dit leidt tot een verhoogde opname en oxidatie van FA, wat leidt tot ophoping van vet en de vorming van giftige vetstoffen, wat direct leidt tot DCM-laesies.31

conclusies

Bij db/db-muizen met diabetisch myocardium is het glucose- en lipidenmetabolisme ontregeld, wat leidt tot verhoogde niveaus van oxidatieve stress en apoptose. Deze studie bevestigde dat ECH langdurige hyperglykemie bij db/db-muizen aanzienlijk kan verminderen door middel van PPAR/M-CPT-1/GLUT-4-signalering. Ondertussen verbeterde ECH de oxidatieve stress en remde het myocardiale apoptose bij db/db DCM-muizen, wat mogelijk verband houdt met een verbeterd energiemetabolisme. Hoewel de onderliggende mechanismen voor deze effecten niet zijn ontdekt, bieden deze bevindingen een nieuwe richting voor de behandeling van DCM en de beschermende rol van ECH bij het verbeteren van myocardletsel.

Referenties

1. Bauters C, Lamblin N, Mc Fadden EP, Van Belle E, Millaire A, de

Groote P. Invloed van diabetes mellitus op het risico en de uitkomst van hartfalen. Cardiovasculaire Diabetol. 2003;1(8):1–2. doi:10.1186/1475- 2840-2-1

2. Tate M, Grieve DJ, Ritchie RH. Zijn gerichte therapieën voor diabetische cardiomyopathie in het verschiet? Clin Sci. 2017;131(10):897-915. doi:10.1042/CS20160491

3. Khan H, Anker SD, Januzzi JJ, et al. Epidemiologie van hartfalen bij patiënten met diabetes mellitus zonder coronaire hartziekte. J-kaart mislukt. 2019;25(2):78–86. doi:10.1016/j.cardfail.2018.10.015

4. Sheila K, Patel B. Het CTGF-gen −945 G/C-polymorfisme is niet geassocieerd met hart- of niercomplicaties bij personen met type 2-diabetes. Cardiovasculaire Diabetol. 2012;1(11):42.