Stimuleren van de antikankeractiviteit van Aspergillus Favus "endofyt van Jojoba" Taxol via conjugatie met gouden nanodeeltjes gemedieerd door bestraling
May 30, 2023
Taxol Alternatieve Chinese Kruiden Cistanche
Trefwoorden:Aspergillus favus · Jojoba · Endofytische schimmels · Gouden nanodeeltjes · Taxol · -Bestraling · Voedingsoptimalisatie
Invoering
Taxol is een van de meest gecommercialiseerde breedspectrummedicijnenmedicijnen tegen kanker[1]. De activiteit van Taxol komt voort uit zijn unieke specificiteit voor binding met de cellulaire tubuline-subeenheden heterodimeer, waardoor tubulinepolymerisatie wordt bevorderd, waardoor de mitotische deling van tumorcellen wordt verstoord [2]. Taxol vertoonde een sterke activiteit tegen borst-, long-, hoofd- en halskanker, baarmoederkanker en gevorderde vormen van Kaposi-sarcoom [3]. Taxol werd eerst geproduceerd uit de bast van taxusbomen Taxus brevifolia "familie Taxaceae" [4, 5]; echter, de lagere opbrengst van Taxol is dat<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as astma,ontsteking, Enkanker[32]. Het hoofddoel van dit werk was dus het verkennen van een nieuw schimmelisolaat uit de jojobaplant met een unieke metabole stabiliteit voor de productie van taxol, het evalueren van de verschillende benaderingen om hun opbrengst aan taxol te maximaliseren en het verbeteren van de antiproliferatieve activiteit van geëxtraheerde taxolverbindingen. via conjugatie met gouden nanodeeltjes, gemedieerd door gammastraling.
Materiaal en methoden
Isolatie en kweken van de endofytische schimmels
Verschillende delen van jojoba (Simmondsia chinensis) zoals bladeren, blaffen, twijgen en knoppen werden verzameld van de Faculteit Landbouw, Universiteit van Caïro, en gebruikt als bron voor endofytische schimmels. De plantendelen werden verzameld en gewassen onder stromend kraanwater, het oppervlak werd gesteriliseerd met 70 procent ethanol gedurende 1 minuut en vervolgens gespoeld met steriel water [28]. De aan het oppervlak gesteriliseerde plantendelen werden onder steriele omstandigheden in kleine stukjes gesneden en op platen van aardappeldextrose-agar (PDA) medium, Czapek's-Dox en moutextract-agarmedium [33-36] geplaatst, en de platen werden gedurende 30 minuten bij 30 graden geïncubeerd. 10 dagen. De effectiviteit van oppervlaktesterilisatie van de plantendelen werd beoordeeld door het spoelwater te centrifugeren, vervolgens werd 500 µl steriel water aan het neerslag toegevoegd en uitgeplaat in PDA-medium [37]. De gezuiverde endofytische schimmelisolaten werden 7 dagen geïnoculeerd op PDA-hellingen en bewaard bij 4 graden Celsius.
Screening, extractie en kwantificering van taxol uit de endofytische schimmels
De herstelde endofytische schimmels die jojoba bewonen, werden gescreend op Taxol-productie door te groeien op aardappel-dextrose-bouillon (PDB) [38]. Eén plug van elk van de 7 dagen oude schimmel-isolaten werd geïnoculeerd in 100 ml PDB/250 ml Erlenmeyer-taken, gedurende 15 dagen geïncubeerd bij 30 ± 1 graad, onder schudomstandigheden (120 toerental). Na incubatie werden de kweken gefiltreerd en het filtraat werd aangepast met 0,2 procent natriumbicarbonaat om vetzuren neer te slaan. Taxol is geëxtraheerd met dichloormethaan en de organische fase is verzameld en drooggedampt en de residuen zijn opnieuw opgelost in methanol [17, 39]. Taxol werd gescheiden en geïdentificeerd door TLC met behulp van Merck 1 mm (20 x 20 cm) voorgecoate silicagelplaten (TLC Silicagel 60 F254, Darmstadt, Duitsland), gedetecteerd door UV-belichting bij 254 nm [39]. De vermeende vlekken van Taxol werden van de TLC-silicagelplaten geschraapt en opgelost in methanol, krachtig gevortext gedurende 10 minuten en gecentrifugeerd bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. De geprecipiteerde silicadeeltjes werden verwijderd en het supernatant werd genomen voor Taxol-kwantificering en controle van de zuiverheid door middel van HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quaternary Pump, Korea) van een C18-kolom met omgekeerde fase (Eclipse Plus C18 4.6 × 150 mm, 3,5 μm, catalogusnummer 959.963–902). De gebruikte mobiele fase was methanol/acetonitril/water (25:35:40, v/v/v) bij een stroomsnelheid van 1,0 ml/min gedurende 20 min [40], en taxolfracties werden gemeten bij 227 nm, en hun chemische identiteit en concentraties werden bevestigd op basis van de retentietijd en het absorptiepiekgebied in vergelijking met een authentiek monster.
Morfologische en moleculaire identificatie van de herstelde endofytische schimmels
De endofytische schimmelisolaten werden geïdentificeerd tot hun soortniveau op basis van hun macro- en micromorfologische kenmerken door te groeien op PDA, Czapek's-Dox en moutextractmedia volgens de sleutels van de referentie [33-36]. De identiteit van de krachtigste Taxol-producerende schimmelisolaten werd verder moleculair bevestigd op basis van de sequentie van interne getranscribeerde spacer (ITS) [41, 42]. Fungaal genomisch DNA (gDNA) werd geëxtraheerd door de mycelia (~0,2 g) in vloeibare stikstof te verpulveren en vervolgens in 1 ml CTAB-extractiebuffer (2 procent CTAB, 2 procent PVP40, { {21}}.2 procent 2-mercapto-ethanol, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0). De PCR-primersets waren ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ en ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. De PCR-reactie bevat 10 µl van het 2×PCR-mastermengsel (i-Taq™, cat.nr. 25027), 2 µl gDNA, 1 µl van elke primer (10 pmol/ul) en aangevuld tot 20 µl met steriel gedestilleerd water. De PCR was geprogrammeerd op initiële denaturatie bij 94 graden gedurende 2 minuten, denaturatie bij 94 graden gedurende 30 seconden, annealing bij 55 graden gedurende 10 seconden, extensie bij 72 graden gedurende 30 seconden gedurende 35 cycli en uiteindelijke verlenging bij 72 graden gedurende 2 minuten. min. De PCR-amplicons werden geanalyseerd met 1,5 procent agarosegel in 1 x TBE bufer (Ambion Cat # AM9864), met behulp van 1 kb DNA-ladder (Cat. # PG010-55DI) en gevisualiseerd door geldocumentatiesysteem. De amplicons werden gezuiverd en gesequenced door Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, versie 6.0 met dezelfde primersets. De verkregen sequenties werden BLAST niet-overtollig doorzocht in de NCBI-database, geïmporteerd in MEGA 6.0-software en uitgelijnd met het Clustal W-spieralgoritme [43] en de fylogenetische boom werd geconstrueerd met de buurverbindingsmethode van MEGA 6.0 [44].
Chemische structuur van het geëxtraheerde taxol
De vermoedelijke vlekken van Taxol werden van de TLC-silicagelplaten geschraapt en gezuiverd, en de zuiverheid en concentratie werden bepaald door de UV-Vis-analyses bij λ 227 nm (RIGOL, Ultra{2}} Series) in vergelijking met authentiek Taxol [39]. Blanco media onder dezelfde omstandigheden werden gebruikt als een negatieve basislijn voor de spectrofotometrische analyses. Het FT-IR-spectrum van de gezuiverde Taxol-monsters werd geanalyseerd door JASCO FT-IR 3600 spectrofotometer. Het Taxol-monster werd gemalen met KBr-pellets, onder vacuüm tot schijven geperst en de absorptie werd gemeten in het gebied van 400 tot 4000 cm−1 [3], vergeleken met de authentieke. De chemische structuur van geëxtraheerd taxol werd bevestigd door middel van HNMR-spectroscopie (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) in vergelijking met authentiek Taxol. De monsters werden opgelost in CDCl3, chemische verschuivingen worden gegeven in ppm (δ-schaal) en de koppelingsconstanten worden uitgedrukt in hertz (Hz).
Effect van verschillende soorten media op taxolproductie
Twee agarpluggen (9 mm) van 7 dagen oude culturen van elk schimmelisolaat werden in drievoud geïnoculeerd in 100 ml medium/250 ml Erlenmeyer-kolf van aardappeldextrose (PDB), Czapek's-Dox (CZD), M1D en moutextract (ME ) bouillonmedia. Niet-geïnoculeerde controles van elk medium die vrij zijn van schimmelsporen werden gebruikt als een negatieve controle, geïncubeerd bij 30 graden gedurende 15 dagen onder dezelfde omstandigheden. Na incubatie werden schimmelkweken gefilterd en werd Taxol geëxtraheerd en bepaald zoals hierboven vermeld.
Bioprocesoptimalisatie van de voedingscondities om de taxolopbrengst te maximaliseren
Optimalisatie van de mediumsamenstelling voor het maximaliseren van de taxolopbrengst door het krachtige schimmelisolaat werd uitgevoerd door responsoppervlakmethodologie met behulp van Placket-Burman-ontwerp gevolgd door centraal composietontwerp [17–20, 45]. Van de RSM-ontwerpen werden de positieve en significante variabelen die de Taxol-productie door het krachtige schimmelisolaat beïnvloeden beoordeeld met behulp van het statistische softwarepakket van Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, VS). Elk experiment werd uitgevoerd in drie biologische herhalingen en de gemiddelde waarden werden in aanmerking genomen. Na incubatie onder de gewenste omstandigheden werd schimmelbiomassa gefiltreerd en werd Taxol geëxtraheerd en gekwantificeerd door TLC en HPLC zoals hierboven beschreven.
Placket-Burman-ontwerp
Het placket-Burman-ontwerp is vaak gebruikt voor de optimalisatie van de mediacomponent voor schimmelgroei en productie van bioactieve secundaire metabolieten, waarbij de significante variabelen die de taxolproductie beïnvloeden, werden geëvalueerd [18, 20, 46]. De keuze van de factor was gebaseerd op media die werden gebruikt bij kwalitatieve en kwantitatieve screening. Er zijn elf factoren meegenomen; moutextract, pepton, sucrose, sojaton, glutamine, rundvleesextract, en waarden en factoren voor temperatuur, pH, incubatietijd en schudsnelheid werden gevarieerd over twee niveaus, en de minimale en maximale niveaus werden geselecteerd. De statistische Design-Expert 7.0 werd gebruikt om een set van 12 experimenten te genereren. Voor elk experiment werd de taxolproductie bepaald in drie biologische herhalingen en werd de gemiddelde taxolopbrengst in aanmerking genomen.
Regressieanalyse van de gegevens werd uitgevoerd met behulp van statistische software. Het effect van elke variabele werd berekend (Biometrika, 2020), met behulp van de volgende vergelijking:
waarbij E het effect is van een testvariabele, M plus , en M− de taxolconcentratie van proeven is waarbij de parameter respectievelijk op zijn hogere en lagere niveaus was, en N het aantal experimenten is dat is uitgevoerd. Het effect van elke variabele op de productie werd bepaald door hun respectievelijke E-waarden te berekenen.
Waar Tot hoog het totale aantal reacties op het hoge niveau is, Tot laag het totale aantal reacties op het lage niveau en Nee het aantal pogingen.
Centraal samengesteld ontwerp en interacties tussen factoren die de productie van taxol beïnvloeden
De meest significante positieve factoren die de taxolproductie door het geselecteerde schimmelisolaat beïnvloeden, werden geoptimaliseerd met behulp van een experimenteel ontwerp van het CCD-model van het reactieoppervlak [47]. Door CCD te gebruiken, werden de concentraties van de mediumcomponenten geoptimaliseerd en werden hun bestudeerde interacties gebruikt om in totaal 20 experimenten voor de drie variabelen te genereren. Om de optimale niveaus van de variabelen voor taxolproductie uit het krachtige schimmelisolaat te bepalen, werden driedimensionale (3D) responsoppervlakcurven uitgezet om de interactie tussen de verschillende factoren te bestuderen en om de variabele conditie van elke factor die de taxolproductie beïnvloedt te bepalen. De 3D-grafieken werden uitgevoerd door de constanten van drie factoren op een ideaal niveau te houden en de verkregen respons van Taxol-opbrengst uit te zetten voor variërende niveaus van de andere twee factoren.
Effect van gammabestraling op taxolopbrengst
De krachtige endofytische isolaten die Taxol produceren, werden blootgesteld aan -bestraling met 60 kobaltbron (gammacel 4000-A-India) bij verschillende doses gammastraling (0.25–3,0 kGy) vergeleken met aan de controle van de niet-bestraalde cultuur; een dosistempo van 1,2 kGy/h ten tijde van de experimenten. De geoptimaliseerde media werden geïnoculeerd door de bestraalde kweek onder standaard kweekomstandigheden, vergeleken met het niet-bestraalde spore-inoculum als controle. De kweken werden 15 dagen bij 30 ± 2 graden geïncubeerd op een roterende schudder (120 rpm). Na incubatie werden de kweken gefiltreerd en werd Taxol geëxtraheerd, gezuiverd en gekwantificeerd met TLC en HPLC zoals hierboven beschreven.
Synthese en karakterisering van gouden nanodeeltjes (AuNP's); Conjugatie met Taxol
Antikankeractiviteit van Taxol
De activiteit van de gezuiverde Taxol- en Taxol-PVP-AuNP's-conjugaten tegen levercarcinoom (HPG2) en borstcarcinoom (MCF7) werd bepaald door 3- (4,5-dimethylthiazol- 2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-assay [48]. De 96-putjesplaat werd bezaaid met 103 cellen per putje en 's nachts bij 37 graden geïncubeerd, vervolgens werden verschillende concentraties van het geneesmiddel toegevoegd en werden de platen opnieuw 48 uur geïncubeerd. Het MTT-reagens (25 µl) werd toegevoegd en gedurende 2 uur geïncubeerd, en de paarse kleur van het ontwikkelde formazancomplex werd gemeten bij A570 nm. De IC50-waarde werd uitgedrukt door de hoeveelheid geneesmiddel die de groei van 50 procent van een initieel aantal tumorcellen reduceerde tot positieve controle.
Antimicrobiële activiteit van Taxol en Taxol-AuNPs-conjugaten
De antimicrobiële activiteit van Taxol- en Taxol-AuNPs-conjugaten werd beoordeeld aan de hand van verschillende bacteriële isolaten; Bacillus subtilis ATCC 6633 en Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli en Enterobacter agglomerans, naast Candida albicans. De geteste bacteriecellen werden gesuspendeerd in steriel peptonwater om een standaard inoculum te verkrijgen van ~0.5 McFarland (1–1,5)× 1{{10}}8 CFU/ml bij λ6{{18 }}0 nm. De groeiremming (mm) van de groei van microbiële pathogenen werd beoordeeld met behulp van de agarschijf-diffusiemethode. Steriele standaard antibiotische schijven met een diameter van 6,0 mm werden gebruikt als positieve controles. Steriele antibiotische schijfjes (6,0 mm) werden geladen met 20 µl methanol en amoxicilline-clavulaanzuur (AMC) als negatieve en positieve controle. Schijven werden geladen met dezelfde concentratie Taxol, Taxol-PVP-AuNP's en AuNP's (1,0 ug/ml). Er werden drie biologische replica's bereid. De platen werden 24 uur bij 37 graden geïncubeerd en de remmingszones werden gemeten. Amoxicilline clavulaanzuur (AMC) en nystatine werden gebruikt om de antimicrobiële activiteit van Taxol te normaliseren. De remmingszone van groei werd bepaald met een schuifmaat (mm).
Statistische analyse
Fisher's minst significante verschil van post hoc test.
Schimmelafzetting
Resultaten
Isolatie van endofytische schimmels van Jojoba; Screening op taxolproductie
Vierentwintig endofytische schimmelisolaten werden gewonnen uit de blaffen, twijgen, bladeren en knoppen van jojoba geladen op PDA-, CZD- en ME-medium. Deze schimmelisolaten waren afgeleid van blaffen (6 isolaten), twijgen (7 isolaten), bladeren (4 isolaten) en knoppen (7 isolaten) zoals weergegeven in Tabel 1. Deze schimmelisolaten werden aanvankelijk geïdentificeerd tot hun soortniveau op basis van hun morfologische kenmerken. kenmerken volgens de universele sleutels, behorend tot drie geslachten, namelijk Aspergillus, Penicillium en Fusarium. Onder deze isolaten was de prevalentie van het geslacht Aspergillus (83,4 procent), terwijl Fusarium en Penicillium vertegenwoordigd waren met 8,3 procent. Het geslacht Aspergillus werd vertegenwoordigd door vijf soorten, namelijk A. favus (3 isolaten), Aspergillus oryzae (5 isolaten), A. niger (5 isolaten), A. fumigatus (4 isolaten) en A. terreus (3 isolaten). De productiviteit van Taxol door de teruggewonnen schimmelisolaten werd beoordeeld door kweken op PDB, incubatie onder de standaardomstandigheden, extractie en kwantificering van Taxol door TLC en HPLC (Fig. 1). Uit de resultaten werd de maximale Taxol-productiviteit gerapporteerd door A. favus Bd1 (88,65 µg/l), gevolgd door P. polonicum Br1 (54,42 µg/l), A. niger Lv1 (43,95 µg/l), A. oryzae Bd1 (38,87 µg/l), F. oxysporum Tw1 (26,80 µg/l), A. niger Lv2 (23,01 µg/l) en A. fumigatus Bd2 (17,62 µg/l) ik). De structurele chemische identiteit van Taxol van de hoogste schimmelproducenten werd onthuld uit hun UV-Vis-spectra, vergeleken met het chemische spectrale van het authentieke Taxol. Bovendien is de chemische structuur van Taxol geëxtraheerd uit de vier krachtigste schimmelisolaten gevalideerd door FT-IR-analyses (fig. 1). Opmerkelijk genoeg vertoonde het geëxtraheerde Taxol uit de krachtige schimmelisolaten hetzelfde spectrale paradigma van authentiek Taxol. De piek bij 3393,3 cm-1 werd toegewezen aan de hydroxylgroep (OH). Terwijl de pieken bij 2923,5 werden toegewezen aan het alifatische CH-rek, komen de pieken bij 1661,0 cm−1 overeen met de C=O-rekfrequentie. De waargenomen piek bij 1452,0–1404,0 cm-1 was te wijten aan de NH-strekfrequentie. De carbonylgroep-zuurstof strekfrequentie werd waargenomen bij 1109 cm-1. De waargenomen pieken in het bereik van 1020–979,7 cm-1 waren te wijten aan de aanwezigheid van aromatische C- en H-bochten. Uit de chromatografische en spectrale analyses kon worden geconcludeerd dat het geëxtraheerde Taxol identiek is aan het authentieke. Blijkbaar fluctueerde de metabolische activiteit van dezelfde schimmelsoort sterk met de verschillende planten, wat zorgde voor de unieke biologische interactie en afgifte van specifieke signalen van het plantendeel om de expressie van het machinesysteem van Taxol-biosynthese te activeren. Interessant is dat de fluctuatie op het metabolische systeem niet alleen afhankelijk is van de plantendelen, maar ook van de interactie tussen isolaat en isolaat. Taxol was nul voor het A. niger-isolaat uit de plantenschors.
Morfologische en moleculaire identificatie van de krachtige taxolproducenten
Morfologische kenmerken van het krachtige schimmelisolaat dat Taxol produceert, werden onderzocht volgens de macroscopische en microscopische beschrijvende sleutels, zoals beschreven in Materialen en methoden, en onthulden de morfologische nabijheid ervan met A. favus (Fig. 2). Het schimmelisolaat werd gedurende 10 dagen op PDA bij 30 graden gekweekt en de macroscopische en microscopische kenmerken onthulden zijn identiteit zoals conidiale koppen, wijze van vertakking, de identiteit van stigma en conidiale ontologie en vorming van vruchtlichamen, volgens de universele morfologische sleutels [33], en bleken identiek te zijn aan Aspergillus favus. Het krachtige Taxol-producerende isolaat A. favus werd verder geïdentificeerd op basis van hun ITS-sequenties, waarbij gDNA als sjabloon werd gebruikt. De PCR-amplicons (~ 550 bp) van A. favus werden gescheiden, gezuiverd en gesequenced (Fig. 2). De ITS-sequentie van A. favus werd niet-redundant doorzocht in de NCBI-database en vertoonde 99 procent gelijkenis met A. favus, met nul E.-waarden en 95 procent querydekking. Dus, uit de microscopische en moleculaire analyses, werd het doelisolaat bevestigd als A. favus en gedeponeerd op GenBank met toegangsnummer MW485934.1, en het isolaat is gedeponeerd bij Assiut University Mycological Center (AUMC), Egypte met een depositienummer AUMC13892. Het huidige isolaat had 99 procent gelijkenis met A. favus isolaten MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,
Fig. 1 Een morfologisch beeld van de jojobaplant. B Plaatculturen van de krachtige Taxol-producerende endofytische schimmels; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) en A. oryzae Bd (25) op PDA na 8 dagen incubatie bij 30 graden. De schimmelisolaten werden gekweekt op PDB en geïncubeerd onder de standaardomstandigheden, en Taxol werd geëxtraheerd en gecontroleerd met TLC (C). D HPLC-chromatogram van Taxol van de krachtige schimmelisolaten. E Opbrengst aan taxol zoals gekwantificeerd uit HPLC. F, UV-Vis spectrale analyse van geëxtraheerd taxol uit de schimmelisolaten. G FT-IR-analyse van geëxtraheerd Taxol in vergelijking met authentieke
Fig. 2 A Macromorfologische kenmerken van A. favus, een endofyt van jojoba na 3, 5 en 8 dagen groei op PDA. Micromorfologische kenmerken, conidiale kop van A. favus met 400x vergroting. C PCR-amplicon van A. favus ITS-regio van 500 bp, normaliserend tot 1 kb ladder (cat.nr. SM0312). D Fylogenetische analyse van ITS A. favus volgens methode met maximale waarschijnlijkheid [44]
