Korte inhalatie van sevofluraan kan de vorming van gliale littekens verminderen na hypoxisch-ischemisch hersenletsel bij neonatale ratten, deel 2

Real-time PCR

Totaal RNA werd 12, 24 en 48 uur na de operatie uit de hippocampusweefsels van pups geëxtraheerd met behulp van TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS). Complementair DNA werd gesynthetiseerd met behulp van een geavanceerde Superscript II RT-PCR-kit (Invitrogen).

Hypoxisch-ischemisch letsel verwijst naar een pathologische toestand veroorzaakt door cerebrale ischemie, hypoxie, stofwisselingsstoornissen en zenuwcelbeschadiging als gevolg van aandoeningen van het cardiovasculaire en cerebrovasculaire systeem. Door de sociale vooruitgang en veranderingen in levensstijl komt hypoxisch-ischemisch letsel steeds vaker voor. Deze aandoening kan veel schade toebrengen aan de menselijke gezondheid, waaronder het aantasten van iemands intelligentie en geheugen.

Hoewel hypoxie en ischemie een achteruitgang van de hersenfunctie kunnen veroorzaken, betekent dit niet dat het geheugen negatief wordt beïnvloed. Integendeel, we kunnen het geheugen verbeteren en de efficiëntie van de hersenen vergroten met de juiste methoden. Hier zijn enkele manieren om uw geheugen te verbeteren:

1. Gezonde voeding: De impact van voeding op het geheugen is erg belangrijk. Voedingsmiddelen die rijk zijn aan eiwitten, vitamines en mineralen kunnen helpen een gezond zenuwstelsel en denkfunctie te behouden.

2. Beweeg meer: ​​Lichaamsbeweging kan de bloedcirculatie bevorderen, de zuurstofstroom verhogen, de immuniteit van het lichaam verbeteren en het risico op ziekten verminderen. Door oefening kunt u uw geheugenvermogen verbeteren.

3. Versterk het zelfvertrouwen: Vertrouwen is een belangrijke factor in het geheugen van een persoon. Als u gelooft dat u een bepaalde taak kunt voltooien, bereikt u gemakkelijk de gewenste resultaten en kunt u ook uw geheugen effectief verbeteren.

Het is duidelijk dat hypoxisch-ischemisch letsel geen aandoening is die onvermijdelijk het menselijk geheugen schaadt. Zolang we de juiste methoden beheersen en goed voor onze hersenen zorgen, kunnen we met een positieve instelling een gezonde toekomst omarmen. Het is duidelijk dat we het geheugen moeten verbeteren, en Cistanche deserticola kan het geheugen aanzienlijk verbeteren, omdat Cistanche deserticola antioxiderende, ontstekingsremmende en anti-verouderingseffecten heeft, die kunnen helpen oxidatie- en ontstekingsreacties in de hersenen te verminderen, waardoor de hersenen worden beschermd. gezondheid van het zenuwstelsel. Bovendien kan Cistanche deserticola ook de groei en het herstel van zenuwcellen bevorderen, waardoor de connectiviteit en functie van neurale netwerken wordt verbeterd. Deze effecten kunnen het geheugen, het leervermogen en de denksnelheid helpen verbeteren en kunnen ook de ontwikkeling van cognitieve stoornissen en neurodegeneratieve ziekten voorkomen.

Klik op manieren kennen om de hersenfunctie te verbeteren

Fluorescerende SYBR Green I-kleurstof (SYBR Green PCRMaster Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA, VS) en 1 μl omgekeerd getranscribeerd complementair DNA werden gebruikt om DNA-synthese te detecteren door realtime PCR met HIF-1 --specifieke primers.

In het real-time DNA-amplificatiesysteem met rotorgen (Corbett Research, Sydney, Australië) werd PCR uitgevoerd met de volgende cycli: denaturatie bij 95 graden gedurende 15 minuten; 40 cycli van 95 graden (20 seconden), uitgloeien bij 58 graden gedurende 25 seconden en pull-down op 72 graden gedurende 35 seconden. Controle van het fluorescerende product werd gedurende langere tijd bij 72 graden uitgevoerd.

Rotorgenanalysesoftware (Corbett Research) werd gebruikt om het huishoudgen GAPDH te standaardiseren en de relatieve genexpressie te kwantificeren. Alle primersequenties worden weergegeven in Tabel 1.

Nissl-kleuring
Rattenhersenen werden 28 dagen na de operatie in plakjes gesneden, zoals hierboven beschreven voor immunohistochemie. Elke hersenen werd achtereenvolgens doorgesneden en drie vergelijkbare delen van de hersenen werden geselecteerd voor Nissl-kleuring.

Met behulp van een Nikon C1 digitale microscoopcamera (Nikon Corporation, Tokyo, Japan) werden typische microfoto's gemaakt van CA1-, CA3- en DG-gebieden in de hippocampus. Verschillende cellen die in elk van de drie secties werden geteld, werden op een geblindeerde manier uitgevoerd met behulp van ImageJ-software.

Gedragstesten

Ratten werden na drie weken gespeend, verdeeld in drie tot vijf groepen en in kooien gehouden volgens de groepsindeling. Gedragstests werden uitgevoerd op P28-P33-ratten (dwz 21-26 dagen na de operatie), zoals eerder beschreven (Wang et al., 2019a). ), maar met een kleine wijziging. Om de invloed van de loopsheid op het gedrag van knaagdieren uit te sluiten, werden alleen mannelijke ratten getest.

Morris waterdoolhof

Morris-waterdoolhoftesten werden gebruikt om de ruimtelijke leer- en geheugencapaciteiten van P28-P33-ratten te evalueren (Wang et al., 2019a).

Het testen bestond uit twee fasen, waaronder het trainingsgedeelte en de ruimtelijke zoektest. Gedurende vijf opeenvolgende dagen werden er dagelijks vier trainingssecties geïmplementeerd, beginnend om 8:00am. Voor platformdetectietests werden 10 ratten uit elke groep individueel op verschillende locaties in het water geplaatst, stochastisch, met hun gezicht naar de wand van het zwembad.

Als een rat het platform binnen 90 seconden met succes had gedetecteerd, werd hij gedwongen 20 seconden op het platform te blijven en werd de tijd die nodig was om het platform te detecteren geregistreerd als de ontsnappingslatentie. Elke testronde duurde 90 seconden en de ontsnappingslatentie werd gemeten als de tijd vanaf het moment dat de rat in het water werd geplaatst tot het succesvol betreden van het platform.

Als de rat er niet in slaagde het platform binnen 90 seconden te vinden, werd de opname gestopt en werden leer- en geheugenbegeleiding uitgevoerd (de experimentator gebruikte een lange staaf om de rat naar het platform te leiden en liet hem 20 seconden op het platform blijven om te leren). Tijdens de test werd de ontsnappingslatentie van ratten die er niet in slaagden het podium te betreden, geregistreerd als 90 seconden.

Bij de ruimtelijke sondetest die op de zesde testdag werd uitgevoerd, werd het platform verwijderd en werd de rat in het tegenovergestelde kwadrant geplaatst en mocht hij gedurende 90 seconden zwemmen. De snelheid van het zwemmen, de ontsnappingslatentie en het aantal keren dat ze de plaats overstaken waar het platform zich eerder bevond, werden opgenomen door het videovolgsysteem (Shanghai Mobile Datum Ltd., Shanghai, China).

Opschortingstest

De suspensietest werd uitgevoerd op P28-P32-ratten om hun motorische functie te beoordelen, elke dag vanaf 15.00 uur. Een horizontaal plastic touw met een diameter van 0,5 cm werd op een afstand van 45 cm van de grond geplaatst en ratten werden geleid om het plastic touw met beide bovenste ledematen vast te houden, waarna de tijd totdat de rat viel werd gemeten als de latentie van de opschorting. De test eindigde als: (i) de rat tuimelde; (ii) de opschortingslatentie bedroeg meer dan 60 seconden; of (iii) het touw werd vastgehouden door de achterste ledematen.

Open veldtest

Tests in het open veld werden uitgevoerd op P28-ratten met behulp van buitenapparatuur bestaande uit een plexiglasdoos (100 cm x 100 cm; Borj Sanat, Teheran, Iran) omgeven door een 45- cm hoge muur, met een vloer die in 16 vierkanten was verdeeld. Het centrale gebied was het gebied van 50 cm x 50 cm in het midden van de arena. Elke rat werd individueel in het midden van de arena geplaatst en mocht gedurende 10 minuten zonder beperkingen verkennen.

Er werd gebruik gemaakt van een videovolgsysteem (Borj Sanat) om het totale reisschema (als indicator van bewegingsactiviteit) en de tijd doorgebracht in het centrale gebied (als indicator van angstgedrag) vast te leggen en te analyseren (Zhai et al., 2019).

Golgi-kleuring

Na voltooiing van de gedragstesten (dwz 26 dagen na de operatie) werden vijf ratten willekeurig uit elke groep geselecteerd. Golgi-kleuring werd uitgevoerd op 150-μm dikke bevroren hersencoupes met behulp van een FD Rapid Golgi Stain Kit (FDNeuroTechnologies, Columbia, MD, VS) volgens het protocol van de fabrikant.

ImageJ-software werd gebruikt om de wervelkolomdichtheid (aantal wervelkolom per 10 μm) van elk neuron te analyseren. Stekels werden geteld op twee of drie secundaire dendrietsegmenten.

statistische analyse

SPSS 17.0 voor Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, VS) werd gebruikt om de gegevens te analyseren, die worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). De Shapiro-Wilk-test werd gebruikt om de aanname van normaliteit tussen alle continue variabelen te testen. Bovendien werd in een reeks experimenten een eenrichtingsvariantieanalyse, gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstests, benaderd.

Als de gegevens niet aan de normaliteitsaanname voldeden, werd de Kruskal-Wallis H-test of Mann-Whitney U-test afzonderlijk uitgevoerd. De ontsnappingslatentie werd geanalyseerd op basis van een tweewegsvariantieanalyse voor iteratieve metingen. P-waarden < 0.05 werden als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

SPC verbetert het verlies van neuronale cellen in de hippocampus

De hippocampus, inclusief de drie onderzochte regio’s, wordt geassocieerd met leren en geheugen (Jung et al., 2020). Na gedragstesten werd Nissl-kleuring uitgevoerd om de architectuur van de hippocampus te onderzoeken.

In de HI-groep was de levensvatbare neuronale dichtheid verminderd vergeleken met de schijngroep. Het aantal neuronen was echter toegenomen bij dieren die waren blootgesteld aan SPC; dit effect werd omgekeerd door YC-1, waardoor de neuronale dichtheid verminderde (Figuur 1A). Dit fenomeen werd waargenomen in de CA1-, CA3- en DG-regio's van de hippocampus (P< 0.05; Figure 1B–D).

SPC verbetert en vermindert de dichtheid van de dendritische wervelkolom in het CA1-gebied van de hippocampus

Golgi-kleuring werd gebruikt om CA1-piramidale neuronaldendritische wervelkolomdichtheid te detecteren (Figuur 2A). Omdat de afmetingen van de stekels sterk variëren (bijvoorbeeld vertakte dendrieten, dun of paddenstoelen), hebben we alleen vastgesteld dat de dichtheid van de dendritische stekels aanzienlijk was toegenomen in de HIS-groep vergeleken met de HI-groep (P < 0.{{6 }}5), terwijl de dichtheid van dendritische stekels verlaagd was in de HIS + YC-1 groep vergeleken met de HIS groep (P <0,01; Figuur 2B).
SPC verbetert de expressie van PSD95 en GAP43 in de hippocampus

We evalueerden de expressie van synaps-geassocieerde eiwitten GAP43 en PSD95 om te bepalen of ze werden geremd door gliale littekens. HI verminderde de eiwitexpressie van PSD95 (P < 0.01) en GAP43 (P <0,05) aanzienlijk vergeleken met de schijngroep (Figuur 2C–E). Vergeleken met de HIS-groep waren de expressieniveaus van PSD95 en GAP43 aanzienlijk verlaagd na YC-1-injectie.

Vorming van astrogliose en gliale littekens beschadigen de architectuur van de hippocampus na HI

Vervolgens probeerden we te verifiëren of sevofluraan de leer- en geheugenfunctie verbeterde door de hippocampale architectuur te beschermen en astrogliose te verzwakken. Neonatale HIE induceerde neuronale apoptose in de hippocampus, evenals reactieve astrogliose in het infarctgebied dat zich vervolgens ontwikkelt tot een gliaal litteken (Rolls et al., 2009).

In de HI-groep vertoonden de CA1- en CA3-piramidale lagen en het DG-gebied duidelijke afnames in neuronen (P < 0.01, P < 0.001; Figuren 3E en 4C), evenals een verhoogd aantal astrocyten met duidelijke morfologische veranderingen (P <0,001; figuren 3C en 4B). We evalueerden de expressie van GFAP en NeuN in de drie gebieden van de linker hippocampus met behulp van immunohistochemie en western blotting-analyse.

Onze resultaten toonden aan dat, vergeleken met de schijngroep, astrocyten werden geactiveerd in de HI-groep, ingevoegd in de CA1 (Figuur 4A) en CA3 (Figuur 3A) piramidelaag, en omgeven neuronen in de DG (Figuur 3B). Overmatige astrogliose resulteerde in een verdere uitbreiding van gliale processen naar normale neuronale structuren, waardoor een afwijkend wandachtig astrocytennet ontstond (figuren 3A, B en 4A).

Bovendien waren de GFAP-immunoreactiviteit (figuren 3C, D en 4B, E) en eiwitniveaus verhoogd (P < 0.01; Figuur 4E), terwijl de NeuN-immunoreactiviteit daalde (P < {{7} }.01 ofP <0,001; figuren 3E, F en 4C). Om de vorming van gliale littekens verder te verifiëren, evalueerden we de expressieniveaus van neurocanproteïnen en de immunoreactiviteit in de hippocampus (figuren 5A, B en 6A).

Resultaten van dubbellabelende immunofluorescentie brachten opmerkelijke verschillen aan het licht in de fluorescentie-intensiteit van neurocan+/GFAP+-immunokleuring tussen HI- en sham-groepen (P < 0.001, P < 0,05, P < 0,01; Figuren 5G, H en 6D), consistent met Western-blot-resultaten (P< 0.01; Figure 6F).

SPC verzwakt astrogliose en gliale littekenvorming in de hippocampus

Vervolgens onderzocht onze studie of SPC de gliale littekenvorming verzwakte. Vergeleken met de HI-groep was de immunoreactiviteit van GFAP (figuren 5C, D en 6C) en neurocan (figuren 5E, F en 6B) in de HIS-groep aanzienlijk gedownreguleerd in de hippocampus (P < 0.{{6} }1 of P < 0,001).

Daarentegen was de expressie van GFAP en neurocanen in de HIS + YC-1-groep opmerkelijk verhoogd vergeleken met de HIS-groep en verschilde niet van de HIS + YC-1- en HI-groepen (P > 0.05; Figuur 6E en F).

Bovendien werd de NeuN-immunopositiviteit opgereguleerd en leken de structuren ordentelijker in de HIS-groep vergeleken met de HI-groep, wat werd omgekeerd door YC-1 (figuren 3E, F en 4C).

For more information:1950477648nn@gmail.com