Breedband elektrische spectroscopie om eencellige Ca2+-veranderingen als gevolg van ionomycinebehandeling in een skeletspiercellijn te onderscheiden Deel 1

Samenvatting:Veel skeletspierziekten zoals spierdystrofie, myalgische encefalomyelitis/chronisch vermoeidheidssyndroom (ME/cvs) en sarcopenie delen de ontregeling van calcium (Ca2+) als een belangrijk ziektemechanisme op cellulair niveau. Cytosolische concentraties van Ca2+ kunnen ontregeling in organellen signaleren, waaronder de mitochondriën, de kern en het sarcoplasmatisch reticulum in de skeletspieren. In dit werk wordt een behandeling toegepast om de Ca2+-toename na te bootsen die gepaard gaat met deze atrofiegerelateerde ziektetoestanden, en worden breedbandimpedantiemetingen uitgevoerd voor afzonderlijke cellen met en zonder deze behandeling met behulp van een microfluïdisch apparaat. De resulterende impedantiemetingen worden aangepast met behulp van een circuitsimulatie met één schaal om berekende bijdragen aan de elektrische diëlektrische eigenschappen weer te geven op basis van deze Ca2+-veranderingen. Hieruit werden vergelijkbare verdelingen gezien in de Ca2+ uit fluorescentiemetingen en de verdeling van de S-parameter bij een enkele frequentie, waarbij Ca2+ werd geïdentificeerd als de belangrijkste bijdrager aan de geïdentificeerde elektrische verschillen. Geëxtraheerde diëlektrische parameters vertoonden ook verschillende distributiepatronen tussen de onbehandelde en met ionomycine behandelde groepen; de algehele elektrische parameters suggereren echter de impact van door Ca2+-geïnduceerde veranderingen op een breder frequentiebereik.

Cistanche kan werken als een anti-vermoeidheids- en uithoudingsvermogenversterker, en experimentele studies hebben aangetoond dat het afkooksel van Cistanche tubulosa de leverhepatocyten en endotheelcellen die beschadigd zijn bij gewichtdragende zwemmende muizen effectief zou kunnen beschermen, de expressie van NOS3 zou kunnen opreguleren en hepatisch glycogeen zou kunnen bevorderen. synthese, waardoor een antivermoeidheidseffect wordt uitgeoefend. Fenylethanoïde glycoside-rijk Cistanche tubulosa-extract zou de serumcreatinekinase-, lactaatdehydrogenase- en lactaatniveaus aanzienlijk kunnen verlagen en de hemoglobine- (HB)- en glucoseniveaus bij ICR-muizen kunnen verhogen, en dit zou een rol tegen vermoeidheid kunnen spelen door de spierschade te verminderen. en het vertragen van de melkzuurverrijking voor energieopslag bij muizen. De samengestelde Cistanche Tubulosa-tabletten verlengden de gewichtdragende zwemtijd aanzienlijk, verhoogden de leverglycogeenreserve en verlaagden het serumureumniveau na inspanning bij muizen, wat het antivermoeidheidseffect aantoont. Het afkooksel van Cistanchis kan het uithoudingsvermogen verbeteren en de eliminatie van vermoeidheid bij trainende muizen versnellen, en kan ook de verhoging van serumcreatinekinase na belastingsoefening verminderen en de ultrastructuur van de skeletspieren van muizen normaal houden na inspanning, wat erop wijst dat het de effecten heeft van het verbeteren van fysieke kracht en anti-vermoeidheid. Cistanchis verlengde ook aanzienlijk de overlevingstijd van met nitriet vergiftigde muizen en verbeterde de tolerantie tegen hypoxie en vermoeidheid.

Klik op chronisch vermoeidheidssyndroom

【Voor meer informatie:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】

Trefwoorden:breedbandimpedantiespectroscopie; circuitmodellering; eencellige karakterisering; intracellulair calcium

1. Inleiding

De concentratie van calciumionen (Ca2+) in de context van de werking van spiercellen heeft verschillende complexe en dynamische functies. De Ca2+ in de cytoplasma-skeletspiercellen heeft een verscheidenheid aan zeer belangrijke functies, waaronder het reguleren van de mitochondriale functie en het controleren van signaalroutes tussen cellen. In skeletspiersystemen speelt Ca2+ een rol bij de excitatie-contractie (EC)-koppeling, de mitochondriale functie en als signaalregulator voor eiwitten en afbraak [1–3]. Deze functies worden zorgvuldig gecontroleerd door de ritmische beweging van Ca2+ van opslag in het sarcoplasmatisch reticulum (SR) naar het cytosol, bevorderd door een verscheidenheid aan goed gekarakteriseerde eiwitten in skeletspiercellen [4,5]. Zoals gezegd speelt Ca2+ een continue rol bij de spiercontractibiliteit en de ontwikkeling van mitochondriale afwijkingen die leiden tot ziekten die meestal worden gekenmerkt door symptomen die gepaard gaan met verlies van spiercontrole en vermoeidheid [6]. De natuurlijke spierstructuur verandert met de leeftijd, sarcopenie genoemd, of als gevolg van een genetische ziekte zoals Duchenne Muscular Dystrofy (DMD), of atrofie als gevolg van cachexie bij kanker of het verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) [4,5,7,8]. Bij deze ziekten resulteert de verhoogde cytoplasmatische Ca2+ in de uiteindelijke afbraak van spierfilamenten en proteolytische routes die de spierintegriteit en mitochondriale polarisatie behouden, wat helpt bij het energiebeheer [9]. Daarom impliceert het vermogen om Ca2+-veranderingen intracellulair te onderscheiden potentiële diagnostische en therapeutische vermogens.

Ionen zoals Ca2+ en andere geladen deeltjes kunnen de doorgang van intracellulaire ladingen en externe elektrische stimuli beïnvloeden. Elektrische diagnose vormt een veelbelovende methode voor het karakteriseren van eencellige cytoplasmatische veranderingen die verband houden met ziekten van de spierintegriteit en zou een uniek kwantitatief diagnostisch en evaluatief hulpmiddel kunnen ontwikkelen. De overstap naar elektrische metingen biedt ook de mogelijkheid om toekomstige diagnoses snel en labelvrij te benaderen. Het ontwikkelen van een gemodelleerd begrip van hoe bepaalde specifieke veranderingen in ziekteprogressie in skeletspiercellen de celimpedantie beïnvloeden, legt de basis voor het genereren van een ziektespecifiek elektrisch profiel dat zowel afstembaar als voorspellend zou kunnen zijn. Breedbandspectroscopie meet de celimpedantie over een breed scala aan frequenties die een prominente rol hebben gespeeld bij het onderscheiden van de kenmerken van eencellige cellen, vooral in de afgelopen tien jaar [10–13]. Door een brede bandbreedte aan frequenties te bestuderen met behulp van spectroscopie, kan de impedantiemeting de karakterisering van verschillende cellulaire compartimenten mogelijk maken op basis van de verstrooiing van het signaal en de diëlektrische eigenschappen van het compartiment. Biologisch weefsel en cellen hebben diëlektrische eigenschappen van geleidbaarheid (σ) en permittiviteit (ε), waarvan de belangrijkste intracellulaire verstrooiingsinvloeden uitgebreid worden besproken in overzichtsartikelen [14–16]. Verschillende onderzoeken hebben frequenties geïdentificeerd die van belang zijn voor de identificatie van ziekten [17]. Bij frequenties in het megahertzbereik is de dominante verstrooiingsmethode -verstrooiing, waardoor de primaire signaalveranderingen kunnen worden toegeschreven aan cytoplasmatische veranderingen op eencellig niveau [16]. Door dit begrip van breedbandmetingen te combineren met modellering van elektrische circuits, bestuderen we de fysiologische en diëlektrische eigenschappen van twee celpopulaties.

2. materialen en methoden

2.1. Cel cultuur

L6-myoblastcellen van ratten (ATCC, CRL-1458) werden gekweekt volgens de richtlijnen van de American Type Culture Collection (ATCC) [18]. De cellen werden gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) basis (Corning 10014CV, Corning, NY, VS) aangevuld met 10% FBS (Gibco 10082147, Billings, MT, VS) en 5% penicilline / streptomycine (Life Technologies 15140122, Carlsbad). , CA, VS) en geïncubeerd bij 37 ◦C met 5% CO2. Het medium werd regelmatig ververst en de cellen werden gesplitst wanneer confluentie op het flesoppervlak werd bereikt. In Figuur 1 wordt de lay-out geschetst van hoe deze hechtende cellen worden behandeld en gebruikt voor biologische en elektrische karakterisering.

2.2. Ionomycine-behandeling

Cellen werden losgemaakt van de kweekflessen en onderworpen aan een eerder vastgesteld Ionomycine-behandelingsprotocol [19,20]. Voor elektrische metingen werden afgedraaide en losgemaakte cellen gesuspendeerd in 1 µM Ionomycine (MilliporeSigma, Bedford, MA, VS, 56092-81-0) in een oplossing van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met Ca2+ ( 1,5 mM). De cellen bleven 10 minuten bij kamertemperatuur in deze oplossing voordat ze werden gespoeld met Ca2+-vrij PBS en werden voorbereid voor elektrische metingen in een oplossing van 8,5% sucrose en 0,3% dextrose. Soortgelijke stappen werden uitgevoerd op hechtende cellen na de introductie van de Ca2+ beeldvormende middelen, zoals weergegeven in Figuur 1.

2.3. Ca2+ Beeldvorming

Voor metingen van de intracellulaire calciumconcentratie ([Ca{0}}]i werden de cellen gezaaid in een 96-putjesplaat in de eerder beschreven kweekmedia met een dichtheid van 1{{43 }}00 cellen per putje gedurende drie dagen bij 37 ◦C met 5% CO2. De cellen werden geïncubeerd met een fysiologische oplossing die (mM) NaCl 140, KCl 2,8, CaCl2 2, MgCl2 2, glucose 10, Hepes-NaOH 10, pH 7,4 bevatte, genaamd normale externe oplossing (NES) met 10 mg ml−1 runderserumalbumine en 5 µM Fura-2 AM (Molecular Probes, Eugene, OR, VS) gedurende 45 minuten. Vervolgens werden de cellen gespoeld door incubatie in NES met Ca2+ gedurende 40 minuten bij 37 °C om de-esterificatie van de kleurstof in de cellen mogelijk te maken. Ca2+-beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van epifluorescentiemicroscopie die helpt bij het verkrijgen van de Fura-2-emissiefluorescentie bij zowel een excitatie van 340 nm als vervolgens bij een excitatie van 380 nm. Deze excitaties en metingen werden uitgevoerd met behulp van een Xenon-lamp en een monochromator-golflengteschakelaar Polychrome II (Till Photonics, Gräfelfing, Duitsland) om de relevante golflengte te isoleren. De emissie-fluorescerende beelden werden verzameld met behulp van een 40x olie-objectieflens, verkregen door een geïntensiveerde CCD-camera of een C6790 gekoelde CCD-camera (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan), gedigitaliseerd en opgeslagen in een gekoppelde computer. De software Aquacosmos (versie 2.0) werd gebruikt om de resulterende emissiefluorescentieverhouding (f [340/380]) op geselecteerde representatieve cellulaire gebieden te analyseren na het aftrekken van de achtergrondfluorescentie. Nadat een initiële basislijn was vastgesteld, werd gedurende 10 minuten 1 µM Ionomycine in 1,5 mM Ca2+ toegevoegd terwijl de fluorescentie werd gemeten. Deze metingen werden uitgevoerd in een tijdsreeks die spectrale metingen genereerde die de celfluorescentieverhouding aantoonden vóór behandeling met ionomycine, tijdens een behandeling van 10 minuten, na een wasbeurt met Ca2+--vrij PBS en na incubatie in een 8,5% sucrose en 0,3% dextroseoplossing. oplossing. De gemiddelde initiële waarden en waarden na de behandeling werden berekend met behulp van 25-tijdspunten op het initiële plateau en het plateau na het wassen, die werden gebruikt om de verhouding te berekenen. De acquisitietijd voor elke fluorescentie-emissie was 0,5 s en de totale beeldvorming duurde 1,5 uur. Er werden aanvullende experimenten uitgevoerd met behulp van een sucrose-oplossing met 10 mM EGTA, een calciumchelator, om elke mogelijke externe Ca2+-interferentie na behandeling met ionomycine te voorkomen, waarbij vergelijkbare resultaten werden getoond.

2.4. Elektrische meting

Vóór de celvoorbereiding of -behandeling werd een coplanaire golfgeleider (CPW) elektrode-inrichting samengesteld door een polydimethylsiloxaan (PDMS) -kanaal aan het CPW-oppervlak te bevestigen, uitgelijnd met een serieopening. Verdere details over de CPW en het kanaalontwerp zijn te vinden in eerdere publicaties [21–23] en een vereenvoudigd schema is te zien in figuur 2. Het geassembleerde apparaat werd op een microscooptafel geplaatst en een isotone oplossing van 8,5% sucrose en {{ Er werd 5}},3% dextrose in gedeïoniseerd water doorheen geleid om de afdichting van het samenstel te testen vóór de toevoeging van monsters. Cellen behandeld met ionomycine en gewassen met Ca2+-vrij PBS werden gesuspendeerd in dezelfde sucrose- en dextrose-oplossing bij een concentratie van 500,000 cellen/ml en een monster werd opgenomen in een spuit voor injectie in de kanaalmontage. Op basis van eerder onderzoek blijven de cellen maximaal een uur intact, waardoor continue metingen mogelijk zijn.

Zodra alle componenten op hun plaats waren, werden de cellen in het kanaal geïntroduceerd met een monsterstroomsnelheid van {{0}},1 µl/min, samen met een stroom mantelsucrose met een snelheid van 0,2 µl/min. Een elektrisch diëlektroforetisch (DEP) signaal van -9 dBm met een frequentie van 500 MHz werd geïntroduceerd tussen de serieopening in de elektroden om de cel op te vangen. Vervolgens werd een breedbandsignaal van −15 dBm van 9 kHz tot 9 GHz toegepast om de S-parameters te meten met en zonder de aanwezige cel met behulp van een virtuele netwerkanalysator (Keysight E5080A, Santa Rosa, CA, VS). De S-parameters omvatten de reflectiecoëfficiënt (S11) en de transmissiecoëfficiënt (S21). S11 is representatief voor het vermogen dat door het systeem naar de voedingsingangspoort 1 wordt gereflecteerd, terwijl S21 representatief is voor het vermogen dat door het systeem naar poort 2 gaat [24]. Deze metingen werden herhaald na het vrijkomen van de eerder gevangen cel om de achtergrondmeting van de sucroseoplossing voor deze parameters te bepalen. De differentiële S-parameters met en zonder de aanwezige cel, ∆S11 en ∆S21, vertegenwoordigen de celbijdrage aan vermogensreflectie en -transmissie. De S-parameterspectra als functie van de sweepfrequentie werden verder aangepast aan een circuitmodel om de impedantie te extraheren die met de cel is geassocieerd.

De ruwe signalen van ∆S11 en ∆S21 afkomstig van de Keysight-netwerkanalysator voor elke cel op alle 201 frequenties verschijnen als spectra. Met behulp van de impedantiemetingen voor deze spectra werd curve-aanpassing met behulp van gesimuleerde circuitmodellering gebruikt om diëlektrische parameters te verkrijgen.

2.5. Gesimuleerde circuitmodellering

Simulatie van een single-shell circuitmodel werd uitgevoerd om de optimale pasvorm van de cytoplasmaweerstand en capaciteit voor elke elektrisch gemeten cel te vinden met behulp van Advanced Design System (ADS, versie 2023.01) software van Keysight. De circuitontwerpen voor de simulaties zijn te zien in figuur 2b,c. Voor elk achtergrondbestand werden variabelen afgestemd op de eigenschappen van het elektrodesysteem en de oplossing in een representatief circuit om de beste waarden te bepalen om de cel zelf te blijven matchen. Gebruikmakend van de optimale achtergrondkarakteristieken werd een circuit gebruikt dat de cellagen van membraan en cytoplasma modelleerde als weerstand-condensatorparen om de beste schatting van de cytoplasma-eigenschappen te vinden. Op basis van eerdere metingen van L6-cellen werden de membraanweerstand en capaciteit constant gehouden op 235 MOhm en 34,5 pF [25]. Het aanpassingsproces werd geautomatiseerd door het bestandsnummer als een variabele te behandelen voor elk overeenkomend paar achtergrond- en celmetingsbestanden in lijsten. De in Tabel 1 beschreven doelgewichten werden toegewezen door een gemeenschappelijk doel te stellen voor elke optimalisatie en elk signaaltype en de fout te minimaliseren zodat deze geschikt was voor alle frequenties en een interessegebied. De toegepaste gewichten werden bepaald door de fout te vergelijken die werd gegenereerd door het aanpassen van een willekeurige kleinere subset van spectra om de achtergrond en spectravorm het beste weer te geven (figuren A1 en A2). De gekozen gewichtswaarden om de algehele aanpassingsfout voor de differentiële delta (∆) spectra te verminderen, die uiteindelijk vijf keer de achtergrondgewichten bedroegen (Figuur A3). De meer specifieke en zwaar gewogen doelen werden toegepast op frequentiebereiken waar de behandelde en onbehandelde cellen het grootste onderscheid vertonen in de S-parameterspectra. Deze frequentiebereiken komen overeen met het theoretische begrip van de frequenties waarin de cytosolbijdrage domineert [26]. Bovendien werd een algehele gewichtstoename gebruikt om de pasvorm van ∆S11 te beoordelen ter compensatie van de kleinere gemeten waarden.

Voor elk paar werden de achtergrondvariabelen afgestemd door het verschil tussen de in Tabel 1 beschreven bereiken te minimaliseren door de beschreven doel- en gewichtswaarden toe te passen. De fitvariabelen werden vervolgens toegepast om het celcircuitmodel te fitten op basis van de resterende doelen om Rc en Cc te vinden. Uit de geëxtraheerde variabelen werden de diëlektrische permittiviteit (σ) en de geleidbaarheid (ε) van het cytoplasma berekend met behulp van vergelijkingen (1) en (2), zoals te zien in eerdere fittingen met één schaal [21].

In dit single-shell-model helpt de gemiddelde celradius, zoals bepaald door microscopische beeldanalyse (r0), bij het berekenen van de cytoplasmatische diëlektrische permittiviteit (εc) en geleidbaarheid (σc).

2.6. Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van het Python (3.11.2) pakket Scipy. statistieken (v1.10.1) om gemiddelden te vergelijken met behulp van een ongepaarde Students's t-test. Statistische vergelijking van verdelingen werd bereikt met behulp van een Kolmogorov-Smirnov-test. Voor beide werd een p-waarde van minder dan 0,05 als statistisch significant beschouwd.

3. Resultaten

Om de Ca{{0}}-verandering te bepalen, werd de fluorescentie in de loop van de tijd gevolgd en de gemiddelde f[34{{20}}/380] in de perioden vóór ionomycine toevoeging en na de maximaal bepaalde experimentele lengte van 1,5 uur, gebaseerd op de levensvatbaarheid in sucrose, zoals weergegeven in Figuur 3a. Hoewel de cel langzaam terugkeerde naar het aanvankelijke fluorescentieniveau, werd er in veel van de cellen nog steeds een verhoging waargenomen. Na het meten van deze gemiddelde waarden vóór en na de behandeling voor elke behandelde cel, werd de verdeling geanalyseerd om te bepalen hoe de behandeling de f[340/38{{30}}] of relatieve Ca veranderde {{10}} concentratie, weergegeven in figuur 3b. De verdeling van f[340/380] vertoont een lichte piekverschuiving naar hoger na behandeling met ionomycine en een opmerkelijk bredere verdelingsspreiding. De gemiddelde en standaardverdeling van f[340/380]-signalen van cellen vóór en na de ionomycinebehandeling zijn respectievelijk 0,083 ± 0,008 en 0,084 ± 0,025. Hoewel het gemiddelde van het fluorescentiesignaal voor de populatie slechts iets hoger is na de behandeling met ionomycine, is er een significante verandering in de vorm van de verdeling zelf (p=0.012). Als we echter kijken naar de verdeling in het midden van de periode waarin elektrische metingen plaatsvinden, is er een significante stijging van het gemiddelde naar 0,102 ± 0,041 (p < 0,0009) en een significante verschuiving in de verdeling (p < 0,0008). Dit geeft aan dat, hoewel de cellen uiteindelijk terugkeren naar het oorspronkelijke Ca2+-niveau, er een toename is voor de periode waarin de meting plaatsvindt. Door L6-skeletspiercellen gedurende een korte periode met ionomycine te behandelen, leidde de Ca2+-mobiliteit tot een verlengde toename van het cytoplasmatische Ca2+ door het verschuiven van het noodzakelijke elektrische potentieel voor gated kanalen [19]. Op basis van dit eerdere werk blijft de membraanhyperpolarisatie beperkt tot de eerste drie minuten van de behandeling, waarbij ionomycine tijdelijke buitenwaartse stromen kan veroorzaken, zoals Ca2+-geactiveerde K+-stroom (IKCa), zoals aangetoond in ons vorige artikel [19]. Uit eerder onderzoek is echter ook gebleken dat het stabiele membraanpotentieel binnen 10 minuten wordt hersteld. Als gevolg hiervan en door de externe toevoeging van calcium is de lichte verschuiving in de distributie voornamelijk het gevolg van de internalisatie van extern beschikbaar calcium. Ondanks de zichtbare verschuiving in de distributie is er nog steeds een aanzienlijke overlap, iets wat ook te zien is in de distributie van latere elektrische metingen.

Na de introductie van de ionomycinebehandeling als een methode om de intracellulaire Ca2+ in de L6-spiercellijn te verhogen, werd breedbandimpedantiespectroscopie toegepast als een methode voor snelle celvangst en karakterisering van intracellulaire eigenschappen. De verzameling spectra voor elke cel werd onderzocht en vervolgens samengesteld voor statistische vergelijking van de gemiddelde curven en afwijkingen in signalen tussen behandelingstypen, zoals weergegeven in figuur 4. In deze figuur gaat de gemiddelde ononderbroken lijn vergezeld van een lichter gearceerd gebied dat de afwijking tussen elektrisch gemeten cellen bij elke frequentie. Hoewel de overlap tussen groepen aanwezig is bij de meeste frequentiewaarden, onderscheiden verschillende regio's in deze figuur onbehandelde L6-cellen (UNT) en de met ionomycine behandelde cellen (TRT), inclusief het bereik van 10 MHz tot 1 GHz voor het ∆S11-signaal (figuur 4a) en het bereik van 1 MHz tot 10 MHz voor het ∆S21-signaal (Figuur 4b). Deze bereiken zijn relevant voor de cytoplasma-eigenschappen, rekening houdend met de verstrooiingseigenschappen van de meeste biologische materialen. Bij deze frequenties wordt aangenomen dat verstrooiing het elektrische signaal domineert [16]. Hoewel ze op verschillende gebieden visueel verschillend zijn, met name in het MHz-gebied, worden de verschillen beter gekarakteriseerd en verklaard door het gebruik van circuitmodellering om de diëlektrische veranderingen in het compartiment te extraheren.

De overlap als gevolg van de subtiele verschillen tussen de UNT- en TRT-populaties kan ook worden gevisualiseerd uit de impedantiemetingen die vergelijkbaar zijn met de fluorescerende Ca2+-verdeling, weergegeven in Figuur 3. Hoewel de duur van de elektrische meting langer is dan die van calciumbeeldvorming werd er geen signaaldrift waargenomen bij het vergelijken van cellen gemeten aan het begin of einde van het uur, wat aangeeft dat de lekstroom, indien aanwezig, zwak is na het wassen van de cellen. De invloed van lekstroom op de cytoplastische impedantie tijdens de detectieperiode wordt dus verwaarloosd. Kijkend naar één relevant frequentiepunt op 190 MHz, lijkt de ∆ S11-signaalverdeling vergelijkbaar met de spreiding in Figuur 5, waar de TRT-populatie een bredere verdeling heeft, met name in de toenemende signaalrichting. De UNT-populatie heeft een ∆S11-signaal van 3,5 ± 3,3 × 10−4 vergeleken met de TRT-populatie, die een significant hoger signaal had van 8,1 ± 4,5 × 10−4 gemeten bij 190 MHz (p=0.021 ). Bij deze frequentie is er een significante verschuiving in de distributie die de Ca2+ verschuiving weerspiegelt, wat duidt op een gevoeligheid voor ionische veranderingen (p=0.017). In het MHz-bereik kan het elektrische signaal het celmembraan binnendringen voor metingen van het cytoplasma, en in het lagere MHz-bereik is er minimale meetinterferentie door de organelstructuur of grote moleculen in de cel, waardoor 190 MHz een ideale frequentie is om naar te kijken de diëlektrische eigenschappen van het cytoplasma zelf [15,16].

Om de implicaties van de verzamelde ∆S11- en ∆S21-spectra beter te begrijpen, past een single shell-circuitmodel de elektrische eigenschappen van de cytoplasmaweerstand (Rc) en capaciteit (Cc) aan. Het circuitmodel is gebaseerd op de veronderstelling dat de geïnduceerde toename van Ca2+ de membraankarakteristieken niet beïnvloedt of dat het membraan snel terugkeert naar zijn typische homeostase. Deze aanname wordt ondersteund door de geleidelijke terugkeer van Ca2+ in de loop van de tijd naar de initiële concentratie, terwijl de homeostaseprocessen de individuele cellen reguleren. Door het model op elke curve toe te passen, kan de manier waarop eigenschappen de spectra beïnvloeden worden onderzocht. In de spectra in Figuur 6 worden representatieve cellen van elke behandelingsgroep weergegeven met simulaties die nauw aansluiten bij de spectrale vormen van de experimenteel gegenereerde curven. De geëxtraheerde waarden van deze cellen zijn ruwweg 0,3 MOhm voor Rc voor beide behandelingstypen en 3,89 fF en 3,76 fF voor de Cc voor respectievelijk de UNT- en TRT-cellen. Hoewel de verschillen minimaal waren in de circuitwaarden zelf, komen de diëlektrische parameters overeen met aanzienlijk verschillende aanpassingswaarden.

Met behulp van het single-shell-model en de vergelijkingen (1) en (2) kunnen de fitweerstand (Rc) en capaciteit (Cc) van het cytoplasma ook worden uitgebreid naar berekeningen van de cytoplasmatische permittiviteit (εc) en geleidbaarheid (σc). Op basis van de geëxtraheerde parameters was de σc voor de UNT- en TRT-populaties 0.1929 ± 0.0002 S/m en { {19}}.1933 ± 0.0008 S/m, respectievelijk. Hoewel ze klein van omvang waren, hadden de TRT-cellen een aanzienlijk hogere geleidbaarheid (p=8.3 × 10−5). De geëxtraheerde εc van UNT-cellen was 11,3 ± 0,34 ε0 en had een significant lager (p=0.0063) gemiddelde van 10,9 ± 0,13 ε0 voor TRT. Kijkend naar de verdeling van geëxtraheerde σc en εc in Figuur 7, zijn er ook significante verschillen in de verdeling van aangepaste parameters tussen onbehandelde en met ionomycine behandelde cellen. Proportioneel heeft een hoger percentage behandelde cellen een iets grotere geleidbaarheid en een kleinere permittiviteit dan de onbehandelde celverdeling.

【Voor meer informatie:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】