Chaperonne-gemedieerde autofagie bij neurodegeneratieve ziekten en acute neurologische aandoeningen in het centrale zenuwstelsel, deel 2

4. Experimentele onderzoeksinstrumenten om CMA-activiteit te testen

In deze sectie beschrijven we de experimentele onderzoeksinstrumenten die beschikbaar zijn voor het testen van CMA-activiteit in vitro en in vivo. De methoden die gewoonlijk worden gebruikt om informatie te verkrijgen, correleren zowel met CMA-activiteit als met CMA-functionele testen.

CMA (Certified Management Accountant) is een professionele managementaccountantcertificering, die tot doel heeft mensen te certificeren die over voldoende operationele vaardigheden en professionele kennis op het gebied van management accounting beschikken. Geheugen, een vermogen van het menselijk brein, verwijst naar het vermogen om informatie, kennis of ervaring te onthouden.

Er bestaat een bepaalde relatie tussen CMA en geheugen. Allereerst vereist het CMA-examen dat kandidaten een groot aantal kennispunten en concepten onthouden, en tegelijkertijd dat kandidaten de vaardigheden beheersen om deze kennispunten toe te passen. Daarom zal een uitstekend geheugen een zeer belangrijke rol spelen bij het behalen van goede resultaten bij het CMA-examen.

Ten tweede kan het geheugen worden verbeterd door te leren en te oefenen, wat ook helpt bij het studeren voor het CMA-examen. Door bijvoorbeeld kennispunten herhaaldelijk te beoordelen, informatie op verschillende manieren te leren en te onthouden, en geheugentechnieken te gebruiken, kunt u het geheugen verbeteren en kandidaten helpen de kennispunten en vaardigheden die vereist zijn voor het CMA-examen beter onder de knie te krijgen.

Ten slotte is het studeren van CMA niet alleen een examen, maar ook een verbetering van de professionele kwaliteit. Als u bij loopbaanontwikkeling uw professionele vaardigheden beter wilt benutten, heeft u uiteraard een bepaald geheugenvermogen nodig om uzelf te helpen uw werktaken beter te voltooien.

Kortom, er is een nauwe relatie tussen CMA en geheugen. Als u probeert uw geheugen te verbeteren, kunt u niet alleen goede cijfers halen, maar kunt u ook uw werktaken beter voltooien en uw persoonlijke waarde en carrièreprestaties realiseren naarmate uw carrière zich ontwikkelt. Het is duidelijk dat we ons geheugen moeten verbeteren, en Cistanche deserticola kan het geheugen aanzienlijk verbeteren omdat het antioxiderende, ontstekingsremmende en anti-verouderingseffecten heeft, die kunnen helpen oxidatie en ontstekingen in de hersenen te verminderen, waardoor de gezondheid van mensen wordt beschermd. het zenuwstelsel. Bovendien kan Cistanche deserticola ook de groei en het herstel van zenuwcellen bevorderen, waardoor de connectiviteit en functie van het neurale netwerk wordt verbeterd. Deze effecten kunnen het geheugen, het leervermogen en de denksnelheid helpen verbeteren, en kunnen ook het optreden van cognitieve stoornissen en neurodegeneratieve ziekten voorkomen.

Klik op Know om de geheugencapaciteit te vergroten

4.1. Nuttige analyses voor het monitoren van CMA-activiteit

Het evalueren van veranderingen in de hoeveelheden van de belangrijkste moleculaire componenten van CMA kan worden gebruikt als een indirecte manier om de CMA-activiteit te beoordelen [46]. Bovendien kunnen het aantal en de verdeling van CMA-actieve lysosomen worden geanalyseerd om veranderingen in CMA-activiteit af te leiden [46].

Deze analyses leveren echter alleen de gegevens op die verband houden met de CMA-status. Deze analyses moeten dus worden aangevuld met functionele testen [47]. Immunoblotting en beeldvorming voor het evalueren van veranderingen in de belangrijkste CMA-componenten zijn de meest gebruikte methoden voor het beoordelen van CMA-activiteit.

Omdat de lysosomale niveaus van LAMP2A beperkt zijn voor CMA [48], correleren veranderingen in de overvloed van het LAMP2A-eiwit in lysosomen gewoonlijk met de activiteit van CMA. Daarom moet bij beeldvormingsevaluaties de aanwezigheid van LAMP2A op het lysosomale membraan worden geanalyseerd [47].

Immunoblotting voor LAMP2A met behulp van met lysosoom verrijkte fracties of op zijn minst een membraancelfractie is informatiever dan het gebruik van totale lysaten van hele cellen [46]. Niveaus van lysosomaal-hsc70 zijn ook gerelateerd aan CMA-activiteit [49].

Hsc70 is echter een van de meest voorkomende cellulaire chaperonnes, en de fractie die zich in de lysosomen bevindt, is een kleine hoeveelheid. Daarom is immunoblotting voor hsc70 in totale cellulaire lysaten niet informatief voor CMA [46]. Colocalisatie van hsc70 met lysosomale markers (bijv. LAMP1) kan worden gebruikt om CMA-actieve lysosomen te detecteren [49].

Het aantal van deze lysosomen dat is gecolokaliseerd met hsc70 in verhouding tot de gehele lysosomale verzameling neemt toe wanneer CMA wordt geactiveerd [12]. Bovendien kan een elektronenmicroscopische analyse met behulp van immunogoudkleuring voor hsc70 ook informatie verschaffen over de verzameling CMA-actieve lysosomen [49].

In analyses waarbij geïsoleerde lysosomen uit cellen of weefsels worden gebruikt, kunnen verhoogde niveaus van bekende CMA-substraten (bijv. GAPDH) duiden op een verminderde activiteit van CMA [46].

Over het algemeen worden CMA-substraten snel afgebroken na translocatie [6]. Een vergelijking van de lysosomale niveaus van CMA-substraten in cellen of dieren tussen modellen die wel of niet zijn behandeld met remmers van lysosomale proteasen (dwz leupeptine) maakt het dus mogelijk de flux in CMA-waarden te meten [24].

4.2. Functionele testen

Verschillende functionele testen maken het volgen van CMA-activiteit in de loop van de tijd mogelijk in cellen, weefsels en geïsoleerde organellen.

4.2.1. Beoordeling van intracellulaire eiwitafbraak

Ongeveer 30% van de totale cytosolische eiwitten kunnen worden afgebroken door CMA [9]. De werkelijke fractie van het cytosolische eiwit dat door CMA wordt afgebroken, varieert echter afhankelijk van het celtype en de cellulaire omstandigheden [6].

Daarom is het meten van de verzameling cellulaire eiwitten die door CMA worden afgebroken een gebruikelijke methode om de algehele activiteit van de CMA-route te bepalen [46].

Puls- en achtervolgingsexperimenten met behulp van een radioactief gemerkt aminozuur en remmers van lysosomale proteasen of andere autofagische routes kunnen worden gebruikt om eiwitten die CMA-degradatie ondergaan te onderscheiden van eiwitten die door andere routes worden beheerd [50].

4.2.2. Fotoconverteerbare CMA-verslaggevers

Bovendien zou een methode voor het monitoren van de lysosomale associatie van kunstmatige fluorescerende CMA-reporters ook nuttig zijn voor het volgen van de afgifte en afbraak van substraat via CMA [51].

Met behulp van fotoconverteerbare fluorescerende reporters [51] is het mogelijk om de associatie van het foto-omgezette eiwit met lysosomen in een ander fluorescentiekanaal te volgen. Een toename van het aantal fluorescerende puncta per cel zou een goede indicator zijn voor CMA-activatie [46].

4.2.3. In vitro-analyses van CMA met behulp van geïsoleerde lysosomen

De overspraak tussen verschillende autofagische routes maakt het moeilijk om de CMA-activiteit in intacte cellen nauwkeurig te beoordelen [41]. Daarom moeten we alle functionele stappen die betrokken zijn bij het dynamische afbraakproces van CMA-routes afzonderlijk analyseren [46,49].

De meest betrouwbare benadering voor het analyseren van CMA-activiteit wordt verkregen door in vitro reconstitutie van CMA met geïsoleerde lysosomen [52]. Isolatie van de specifieke fractie van lysosomen die actief zijn in CMA maakt een analyse mogelijk van het gehalte aan endogene CMA-substraten in de CMA-compartimenten [47].

Geïsoleerde lysosomen maken ook de reconstitutie van CMA in vitro mogelijk om de stappen te volgen die betrokken zijn bij de CMA-proces-substraatbinding, lysosomale opname en lysosomale afbraak [50].

Behandeling met lysosomale proteaseremmers gevolgd door incubatie met het CMA-substraat zal de meting van de substraatgebonden en getransloceerde in lysosomen (binding en opname) mogelijk maken [39].

Door de hoeveelheid substraat gebonden aan lysosomen waarin proteolyse niet is voorkomen buiten beschouwing te laten, zou het dan mogelijk zijn de opname te berekenen [39,53].

De geïsoleerde lysosomale fracties maken ook de directe vergelijking mogelijk van veranderingen in de inhoud, post-translationele modificatie en organisatie van CMA-componenten op het lysosomale membraan. Verlagingen van de lysosomale LAMP2A- of lys-hsc70-niveaus in geïsoleerde lysosomen zijn indicatief voor verminderde CMA-activiteit [54,55], terwijl verhogingen van LAMP2A-niveaus wijzen op een toename van de CMA-activiteit [56].

Bovendien kan de verhouding van lysosomaal LAMP2A dat op een bepaald moment tot een multimeer complex is samengevoegd, worden bepaald met behulp van blauwnatieve elektroforese van geïsoleerde lysosomen en immunoblot voor LAMP-2A [57].

5. Neurodegeneratieve ziekten en CMA

Neuronen zijn post-mitotische cellen en vereisen efficiënte eiwitafbraakmachines om de cellulaire homeostase onder stressomstandigheden te behouden [58,59]. Een verstoring van het eiwitafbraakproces in het CZS veroorzaakt aggregatie van afwijkende of beschadigde eiwitten, wat een duidelijk kenmerk is van veel neurodegeneratieve ziekten.

Er is substantieel bewijs verzameld dat disfunctie van CMA geassocieerd is met verschillende pathologieën bij verschillende neurodegeneratieve ziekten die het CZS aantasten [1,14].

Bij deze ziekten zijn verschillende pathogene eiwitten geïdentificeerd als de substraten van CMA, zoals -synucleïne bij PD [60], Tauproteïne bij AD [61], jachttine (Htt) bij de ZvH [62,63] en TDP{{5} } bij ALS en FTLD [64,65].

5.1. Ziekte van Parkinson

PD is een van de meest voorkomende neurodegeneratieve aandoeningen. De belangrijkste pathologische kenmerken van Parkinson zijn het geleidelijke verlies van dopaminerge neuronen binnen de substantia nigra en de aggregatie van het eiwit-synucleïne in Lewy-lichaampjes.

Talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat een verminderde CMA verband houdt met de belangrijkste pathogenese van Parkinson [4,66]. Bij patiënten met de ziekte van Parkinson is het niveau van LAMP2A-eiwit in de hersenen verlaagd, wat aangeeft dat de CMA-activiteit verzwakt is [67,68].

Veel eerdere onderzoeken hebben gesuggereerd dat remming van de CMA-afbraakroute de accumulatie van -synucleïne veroorzaakt, wat geassocieerd is met het geleidelijke verlies van dopaminerge neuronen [8].

Belangrijk is dat de mutantvormen A53T en A30P van -synucleïne, geïdentificeerd bij familiale Parkinson, niet kunnen worden afgebroken door CMA. Bovendien binden deze mutante vormen zich stevig aan LAMP2A op het lysosomale membraan en remmen daardoor de normale afbraak van andere CMA-substraten in vitro [60,69]. G2019S-mutatie in leucinerijk repeat kinase 2-eiwit (LRRK2) kan een pathologische oorzaak zijn van familiale Parkinson. [70].

De G2019S-mutant remt de dynamische assemblage van het CMA-translocatiecomplex op het lysosomale membraan, waardoor CMA disfunctie veroorzaakt in het amuismodel van Parkinson en de hersenen van mutante LRRK2-PD-patiënten [25]. Bovendien binden de pathogene mutante vormen van LRRK2 zich aan cytosolisch Hsc70 en interageren ze abnormaal met CMA-componenten, waardoor de afbraak van andere CMA-substraten en neuronale eiwithomeostase in vitro wordt geblokkeerd [25,71].

Ubiquitine C-terminale hydrolase L1 (UCH-L1) heeft een fysieke interactie met LAMP-2A, Hsc70 en Hsp90 en is betrokken bij het regulerende mechanisme van de CMA-route [72]. In een eerdere studie was de I93M-mutante vorm van UCH-L1 werd geïdentificeerd in een enkele PD-familie [73].

Er is ook gerapporteerd dat de I93M-mutatie in UCH-L1 de interactie met het cytosolische gebied van LAMP2A abnormaal versterkte, waardoor de CMA-route in vitro werd geremd [74]. Bovendien induceerde de expressie van de I93M-mutante vorm van UCH-L1 in zoogdiercellen de met CMA-remming geassocieerde toename van de hoeveelheid synucleïne [74].

Deze bevindingen suggereren dat afwijkende interactie van de I93M-mutante vorm van UCH-L1 met CMA-machines ten grondslag zou kunnen liggen aan de pathogenese van Parkinson geassocieerd met de aggregatie van -synucleïne. Parkinson-eiwit 7 (PARK7), ook bekend als DJ-1, is een multifunctioneel eiwit dat betrokken is bij een verscheidenheid aan cellulaire activiteiten, waaronder oxidatieweerstand [75].

PARK7/DJ-1speelt een belangrijke rol bij het handhaven van de mitochondriale homeostase [75]. Er is gerapporteerd dat een mutatie in het DJ-1-gen autosomaal recessieve en vroege vormen van Parkinson medieert [76].DJ-1-deficiëntie versnelde de afbraak van LAMP2A in lysosomen, wat leidde tot de aggregatie van -synucleïne [77 ].

Daarentegen was DJ-1 in staat de accumulatie van -synucleïne te remmen door CMA te reguleren [78]. Over het geheel genomen wordt aangenomen dat verschillende moleculaire mechanismen die dysfunctie van CMA veroorzaken ten grondslag liggen aan de pathogenese van Parkinson.

De pathologische mechanismen die verband houden met CMA blijven echter grotendeels onduidelijk. Verder onderzoek zal nodig zijn om de relatie tussen het CMA-proces en de feitelijke pathologieën van Parkinson te verduidelijken.

5.2. De ziekte van Alzheimer

AD is de meest voorkomende neurodegeneratieve ziekte bij ouderen. De belangrijkste pathogenese van AD is de vorming van amyloïdeplaques en tau-aggregatie, veroorzaakt door de verslechtering van de eiwithomeostase. Verschillende aan AD gerelateerde eiwitten zijn geïdentificeerd als CMA-substraten. Er werd aangetoond dat de CMA-afbraak van deze eiwitsubstraten verstoord is bij patiënten met AD [45,61,79].

De progressieve accumulatie van amyloïde-oligomeren is een centrale toxische gebeurtenis bij AD [80,81]. Een recente studie toonde aan dat het labelen van amyloïde-oligomeren met meerdere KFERQ-motieven hun toegang tot endosomen en lysosomen bevorderde, waardoor menselijke primair gekweekte corticale neuronen werden beschermd tegen neurotoxiciteit [82]. Amyloïde precursoreiwit (APP) is een belangrijk pathogeen molecuul bij de ziekte van Alzheimer omdat het kan worden verwerkt om amyloïde- [83].

APP bevat een KFERQ-achtig motief aan de Cterminus. Dit motief is belangrijk voor de normale verwerking en afbraak van APP om de accumulatie van APP-C-terminale fragmenten te voorkomen [84]. Uit een recent onderzoek is gebleken dat APP een CMA-substraat is dat bindt aan Hsc70 [85].

De remming van de CMA-afbraak van APP verhoogt de cytotoxiciteit ervan. Bovendien verminderde de activering van CMA door Hsc70-overexpressie of metformine de geaccumuleerde amyloïde-plaqueniveaus in de hersenen en keerde de moleculaire en gedragsmatige AD-fenotypes om in een muismodel van AD [85]. Tau is een cytosolisch eiwit dat normaal gesproken microtubuli in neuronale cellen stabiliseert.

Tauproteïne heeft CMA-gerichte motieven en kan worden afgebroken door de CMA-route [79]. Aggregatie van mutante Tau-eiwitten resulterend in Tau-hyperfosforylering en de vorming van neurofibrillaire kluwens is een kenmerk van AD en gerelateerde tauopathieën [86,87].

Bovendien kunnen de gemuteerde Tau-eiwitten een abnormale interactie aangaan met LAMP2A en de translocatie naar het lysosoomlumen remmen, waardoor de CMA-activiteit wordt aangetast [79]. De regulator van calcineurine 1 (RCAN1) is een substraat van CMA [45] en is verhoogd bij patiënten met AD [88].

RCAN1 is een remmer van calcineurine-afhankelijke defosforylering van Tau-eiwitten. Belangrijk is dat CMA-activiteit kan worden geremd door het niveau van RCAN1 te verhogen, waardoor de afbraak van andere substraten van CMA wordt belemmerd [45].

5.3. Ziekte van Huntington

De ZvH is een neurodegeneratieve aandoening die zich laat manifesteert en wordt gekenmerkt door ongecontroleerde bewegingen, dementie en emotionele stoornissen. De ZvH is een dominant erfelijke ziekte die wordt veroorzaakt door de accumulatie en aggregatie van het mutante Htt-eiwit in striatale en corticale neuronen.

Htt bevat een abnormaal uitgebreid N-terminaal polyglutamine (polyQ) kanaal [62,63,89]. Een disfunctie van de afbraak van Htt wordt voorgesteld als de belangrijkste pathogenese van de ZvH.

Eerdere studies hebben aangetoond dat CMA betrokken is bij de afbraak van mutant Htt in cellulaire en muismodellen van de ZvH [62]. Htt herbergt een vermeend KFERQ-motief en werkt samen met de belangrijkste componenten van CMA, Hsc70 en LAMP2A. Bovendien vertoont mutant Htt met een uitbreiding van het polyQ-kanaal een verminderde opname door CMA in vitro [89].

Niet alleen CMA maar ook macro-autofagie is betrokken bij de afbraak van Htt [90]. Htt kan zich tijdens het afbraakproces binden aan zowel LAMP2A als het macroautofagie-gerelateerde eiwit Atg7 [89,91,92].

Naar verluidt wordt de CMA-activiteit opgereguleerd in cellulaire en diermodellen van de ZvH in de beginfase van de ziekte. De activiteit van CMA neemt echter af tijdens het late stadium van de ziekte [91]. Deze bevindingen suggereren dat de vroege toename van CMA-activiteit een compenserende regulatie kan zijn als reactie op de inefficiëntie van macro-autofagie. De afname van het niveau van lysosomaal LAMP2A geeft aan dat er sprake is van verlies van CMA-functie in de late fase van de ZvH [91].

5.4. Amyotrofische laterale sclerose en frontotemporale lobaire degeneratie

ALS en FTLD zijn neurodegeneratieve ziekten met veel vergelijkbare klinische en pathologische kenmerken [93]. Transactivatierespons DNA-bindend eiwit 43 kDa (TDP-43) is een ribonucleair eiwit dat vele aspecten van het RNA-metabolisme reguleert.

De accumulatie van TDP-43 C-terminale fragmenten in neuronale cellen wordt vaak gedetecteerd bij patiënten met ALS en FTLD [65]. De accumulatie van TDP-43 wordt dus algemeen beschouwd als een kenmerk van deze ziekten.

TDP-43-eiwit bevat een KFERQ-achtig motief dat bindt aan Hsc70 en kan worden afgebroken door het CMA-proces [94,95]. De expressie van Hsc70 was naar verluidt verminderd in lymfomonocyten van sporadische ALS-patiënten en droeg bij aan de accumulatie van TDP-43 [64].

Een mutatie in het KFERQ-achtige motief in TDP-43 kan de afbraak ervan via CMA verstoren, waardoor de accumulatie van TDP-43 en de remming van CMA in gekweekte cellen wordt geïnduceerd [94]. CMA kan helpen de omloop van de fysiologische en pathologische vormen van TDP onder controle te houden-43 [94].

For more information:1950477648nn@gmail.com