Hoofdstuk 2: Krϋppel-achtige factor 15 onderdrukt renale glomerulaire mesangiale celproliferatie via verbetering van P53 SUMO1-conjugatie

Voor meer informatie. contacttina.xiang@wecistanche.com

3. RESULTATEN

3.1|Screening van KLF15-bindende genen via ChIP-Seq in primaire renale glomerulaire MC's

Om de direct bindende partnergenen van KLF15 te identificeren, hebben we ChlP-Seq-analyse uitgevoerd en uiteindelijk 2478 genen gescreend. GO-analyse van deze genen via de tool op de website www.uniprot.org (Figuur 1A, B) onthulde moleculaire functietermen geassocieerd met 1941 genen, cellulaire componenttermen gerelateerd aan 1662 genen en biologische procestermen gerelateerd aan 1766 genen. Omdat ons doel was om erachter te komen hoe KLF15 MC's beïnvloedt, hebben we ons gericht op celprocesgerelateerde genen. Van de 1315 celproces-gerelateerde genen bleken 74 genen deel te nemen aan celcyclusprocessen; in het bijzonder namen deze genen deel aan de mitotische celcyclus, de faseovergang van de celcyclus en andere processen (Figuur 1C, D). Verder analyseerden we de genen die betrokken zijn bij groei en ontdekten dat ze gerelateerd waren aan ontwikkelingsgroei, celgroei en andere soorten groei (Figuur 1E).

3.2|Screening van differentieel gereguleerde genen in KLF15-tot overexpressie brengende renale glomerulaire MC's met behulp van SILAC en LC/MS

SILAC- en LC/MS-analyse van HRMC's die KLF15 tot overexpressie brengen in vergelijking met oudercellen leidde tot de identificatie van 1357 eiwitten. We gebruikten de DAVID en IPA om de GO-domeinen en verrijkte routes van de gekwantificeerde eiwitten geïdentificeerd door SILAC te verwerven. Interessant is dat de biologische functiegerelateerde termen van veel eiwitten tot de top 30 van significant verrijkte GO-termen behoorden, waaronder de regulatie van het cellulaire aminozuurmetabolisme, het proteasoomcomplex, eiwitbinding en transcriptie- en translatietermen, die allemaal nauw verwant zijn aan ubiquitinatie (Figuur 2A). Figuur 2B toont de top 30 aanzienlijk verrijkte trajecttermen. Verschillende termen voor biologische processen, waaronder de termen proteasoom en neurodegeneratieve ziekte, waren ook gerelateerd aan ubiquitinatie.

Klik om meer te weten overcistanchete koop met details

3.3|Bioinformatica-analyse van KLF15-bindende genen die mogelijk geassocieerd zijn met renale glomerulaire MC-proliferatie

Onderzoek naar de KLF15-bindende genen die mogelijk geassocieerd zijn met:nier glomerulairMC-proliferatie hebben we een bioinformatica-analyse uitgevoerd van de ChIP-Seq-gegevens en de SILAC-LC/MS-gegevens. Tweeënvijftig genen werden gescreend (Tabel 2 en Figuur 2C), en vijf van deze genen, waaronder SUMO1, macrofaagmigratieremmende factor (MIF), eukaryote initiatiefactor (EIF), insulineachtige groeifactor (IGF) en reticulocalbine (RCN ), waren nauw verwant aancelproliferatie. Omdat de GO- en routeanalyses van de differentieel tot expressie gebrachte eiwitten suggereerden dat de gescreende genen voornamelijk gerelateerd waren aan het ubiquitinatieproces, concludeerden we dat SUMO1, een lid van de ubiquitine-achtige (UBL) eiwitfamilie, deelneemt aan post-translationele modificatie vergelijkbaar met ubiquitinatie als het doelgen van KLF15.

Toenemende hoeveelheden bewijs hebben aangetoond dat HG een van de belangrijkste factoren is die de ontwikkeling van diabetische nefropathie induceert, en het bevordert de proliferatie van MC en verhoogde matrixsynthese in vitro.25 Een eerdere studie heeft aangetoond dat PDGF-BB essentieel is voor de proliferatie van MC voorafgaand aan de ontwikkeling van glomerulosclerose bij experimentele glomerulonefritis.26 Nadat we hadden bevestigd dat MC's in vitro werden gestimuleerd door HG of PDGF-BB, ontdekten we veranderingen in de expressie van KLF15 en SUMO1 op zowel het RNA als het eiwit

niveaus en ontdekte dat deze moleculen vergelijkbare trends hadden (Figuur 2D-l). Ten slotte hebben we vastgesteld dat SUMO1 het doelgen van KLF15 is.

3.4|KLF15 reguleert de SUMO-1-genexpressie opwaarts door te binden aan een 16 bp CACCCA-SUMO-1-promotorregio en een C plus A-rijk motief

We gebruikten de MEME-suite (http://meme-suite.org/tools/meme) om de KLF15-bindende motieven van de 52 gescreende genen uit de KLF15 ChlP-Seq-gegevens te karakteriseren en het KLF-bindende motief te identificeren (Figuur 3A). Bovendien analyseerden we meer dan duizend basen stroomopwaarts van de SUMO1-promotor en ontdekten dat KLF15 een sequentie van 16 bp kon herkennen en eraan kon binden (nucleotiden -205~-199), waaronder - CACCCA- (Figuur 3B). Chip-PCR bevestigde dat KLF15 is gebonden aan de SUMO1-promotor en de resultaten toonden een significant hogere expressie van SUMO1 in de anti-KLF15-antilichaamgroep dan in de achtergrondcontrolegroep (Figuur 3C).

Verder hebben we een dual-luciferase reporter-assay uitgevoerd om de targeting-relatie tussen SUMO1 en KLF15 te bevestigen. De wildtype SUMO1-promotorgroep vertoonde hogere luciferase-activiteit dan de pGL3-vector en mutante groepen in HRMC's, en de activiteit was significant verhoogd door overexpressie van KLF15. De verbeteringen in luciferase-activiteit werden omgekeerd door transfectie met een plasmide dat het mutante promotorgebied tot expressie brengt (Figuur 3D). Alles bij elkaar genomen suggereren deze gegevens dat SUMO1 een direct transcriptioneel doelwit is van KLF15.

3.5|Screening van P53 als het SUMOylation-substraat van SUMO1

SUMO-modificaties worden algemeen uitgedrukt post-translationele modificaties in eukaryoten. Omkeerbare conjugatie van deze modificaties aan substraateiwitten is ook bekend als SUMOylatie, die een belangrijke rol speelt bij het reguleren van de functies van de doeleiwitten en verder deelneemt aan verschillende biologische processen, zoals nucleocytoplasmatisch transport, transcriptionele regulatie, apoptose, eiwitstabilisatie, stressreacties en celcyclusprogressie.27 Om de stroomafwaartse signaalmoleculen te onderzoeken die direct door SUMO1 zijn geconjugeerd, hebben we een netwerkanalyse van SUMO1 uitgevoerd met behulp van de IPA-database, en de gegevens toonden aan dat SUMO1 direct kon conjugeren met onder andere P53, APP, JUN en AKT eiwitten (Figuur 4A-C). We selecteerden aanvankelijk P53 als een stroomafwaarts molecuul van SUMO1 omdat het een bekend eiwit is dat nauw verwant is aan celproliferatie.28.29 Verder hebben we SUMOsp-software gebruikt om de mogelijke SUMOylatie-sequenties van P53-inverschillende soorten te voorspellen en ontdekten dat P53 de SUMOylation-sequentie had（ Figuur 4D）. Om te bepalen of P53 inderdaad is gemodificeerd door SUMOylatie, hebben we HRMC's tijdelijk getransfecteerd met een SUMO1-overexpressieplasmide of SUMO1-siRNA. Zowel de IP- als de Western-blot-resultaten onthulden trends in expressieveranderingen van SUMO1-P53 en P53 die consistent waren met de veranderingen in SUMO1 (Figuur 4E-J). Deze gegevens geven aan dat P53 een SUMOylation-substraat van SUMO1 is.

3.6 |KLF15 remt MC-proliferatie door SUMO1-expressie en P53 SUMOylatie te bevorderen

Om de regulatie van P53 SUMOylatie en MC-proliferatie door KLF15 en SUMO1 vast te stellen, hebben we ingegrepen met KLF15- of SUMO1-expressie in HRMC's en HRMC's behandeld met PDGF-BB. Van de met PDGF-BB behandelde HRMC's vertoonden cellen die waren getransfecteerd met het KLF15-overexpressieplasmide een hogere expressie van SUMO1-P53, P53, KLF15 en SUMO1 dan cellen die waren getransfecteerd met het KLF15-controleplasmide. Dezelfde veranderingen in SUMO1-P53, P53 en SUMO1 werden gevonden in de SUMO1-overexpressieplasmide-getransfecteerde cellen, terwijl de KLF15-expressie onveranderd was in deze cellen (Figuur 5A-F). PDGF-BB is een van de meest effectieve groeifactoren van MC's die tot nu toe zijn beschreven, en er werd een proliferatieve respons van HRMC's op PDGF-BB waargenomen. Zoals weergegeven in figuur 5G, H, werd het percentage EdU-positieve cellen significant verhoogd door de toediening van recombinant PDGF-BB. De EdU-kleuringsresultaten gaven aan dat zowel KLF15- als SUMO1-overexpressie de door PDGF-BB geïnduceerde celproliferatie remde (Figuur 5G, H).

Om meer inzicht te krijgen in de rollen van KLF15 en SUMO1 bij prolifererende HRMC's, hebben we cellen getransfecteerd met alleen SUMO1-siRNA of gecotransfecteerd met SUMO1-siRNA en een KLF15-overexpressieplasmide. Down-regulatie van SUMO1 had geen invloed op de expressie van KLF15, maar de expressieniveaus van SUMO 1- P53 en P53 waren duidelijk verlaagd na SUMO1 siRNA-transfectie (Figuur6A-C). Bovendien, wanneer de expressie van SUMO1 werd geremd, werden SUMO 1- P53- en P53-expressieniveaus ook onderdrukt, zelfs in cellen die KLF15 tot overexpressie brengen (Figuur 6D-F). Vervolgens werd MC-proliferatie geëvalueerd met behulp van een EdU-kleuringsassay. SUMO1 RNAi versterkte het proliferatieve effect van PDGF-BBon HRMC's, en de groep die was gecotransfecteerd met het KLF15-overexpressieplasmide en SUMO1-siRNA had meer EdU-positieve cellen dan de groep die was gecotransfecteerd met het overexpressieplasmide en het hybride sequentiecontrole-siRNA (Figuur 6G, H) . We concluderen daarom dat KLF15 MC-proliferatie onderdrukt door P53 SUMOylation te verbeteren.

3.7|Globale SUMO1- en P53-expressie in glomerulaire MC's is negatief gecorreleerd met MC-proliferatie bij Thy-1-nefritis bij ratten

Anti-Thy1-nefritis is een klassiek model van zelflimiterende mesangiale proliferatieve glomerulonefritis met een proliferatieve fase en een herstelfase. We hebben een Thy1-antilichaam in Wistar-ratten geïnjecteerd om dit model te maken. Zowel serumureumstikstof als creatinine hebben geen significante verandering tussen controleratten en de modelratten (Figuur S1). Duidelijke mesangiale proliferatie en ECM-accumulatie werden waargenomen tijdens de proliferatieve fase (dag 5 en 7) in de modelratten, en het aantal MC's nam af tijdens de herstelfase op dag 10 (Figuur 7A). We hebben ook de expressieveranderingen gedetecteerd in de celproliferatiemarker PCNA door IHC (Figuur 7A, B). PCNA-niveaus waren verhoogd op dag 5, piekten op dag 7 en daalden op dag 10 (Figuur 7F). Western-blot-analyse toonde aan dat de eiwitexpressie van P53, SUMO1 en KLF15 in geïsoleerde glomeruli lager was in de modelgroepen dan in de controlegroep (Figuur 7C, D), consistent met de immunohistochemische resultaten (Figuur 7E, F). Deze resultaten geven aan dat de abnormale proliferatie van MC's in anti-Thy1-modelratten verband houdt met de lage expressie van KLF15 en SUMO1. Het interfereren met de expressie van deze moleculen zal naar verwachting het pathologische fenotype bij ratten verlichten.

4. DISCUSSIE

Deglomerulizijn de filtratie-eenheden van denier. Verstoring van de glomerulaire functie kan worden veroorzaakt door primaire glomerulaire pathologie of kan secundair zijn aan systemische ziekten. Mesangiale veranderingen werden waargenomen na glomerulaire verwonding, waaronder hyperproliferatie van MC's gevolgd door overmatige productie van ECM (mesangiale expansie) en productie van chemoattractant voor ontstekingscellen. Daarom is modulatie van MC-responsen, met name abnormale proliferatie, een nieuwe therapeutische benadering. KLF15 is een eiwit dat een regulerende rol speelt als transcriptiefactor door te binden aan specifieke DNA-sequenties. Veel studies hebben gemeld dat KLF15 betrokken is bij de regulatie van celproliferatie. Er is bijvoorbeeld gevonden dat KLF15 deelneemt aan de remming van MC-proliferatiegerelateerde signaalroutes, maar het directe doelwitgen ervan is niet in de literatuur vermeld. Daarom omvatte deze studie voornamelijk gezamenlijke screening van transcriptie- en translatieniveaus om het directe doelwitgen van KLF15 te identificeren.

KLF15 reguleert verschillende genen in verschillende soorten en in verschillende weefsels en organen. Bij het reguleren van de proliferatie van MC's beïnvloedt KLF15 de expressie van meerdere genen en neemt het deel aan meerdere routes.131,32 Om de directe doelwitgenen van KLF15 te onderzoeken, gebruikten we ChIP-Seg.Klein RH en zijn collega's gebruikten ChlP-seq technologie om de regulatie van KLF7 op de differentiatie van corneale epitheelcellen te bestuderen.33 Ying M et al. gebruikten deze techniek om het remmende effect van KLF9 op de pluripotentie van glioblastoom te bestuderen.34Vergeleken met ChlP-chip maakt ChIP-Seq echte analyse van het gehele genoom mogelijk met een hogere resolutie, hogere detectiegevoeligheid en een lagere vraag naar steekproefomvang.35 We gebruikten ChP om de DNA-fragmenten te verkrijgen die direct door KLF15 waren gebonden, en na vergelijking en analyse met GenBank screenden we 2478 mogelijke doelwitgenen. Door middel van GO- en routeanalyses hebben we veel doelwitgenen geïdentificeerd die betrokken zijn bij de celcyclus en proliferatieprocessen.

ChlP-Seq-experimenten vereisen PCR voor amplificatie van het detectiesignaal, en enige mate van bias tijdens het amplificatieproces is onvermijdelijk. Bovendien verkrijgt ChIP-Seq alleen de genen die KLF15 kan binden en geeft het niet de veranderingen aan die optreden in de expressie van deze genen wanneer de expressie van KLF15 verandert. We gebruikten SILAC-LC/MS proteomics-analyse om deze tekortkomingen te compenseren. Deze techniek geeft informatie over alle eiwitten waarvan de expressie verandert bij regulatie door KLF15, inclusief de eiwitten die direct worden gereguleerd door KLF15 en de eiwitten die indirect worden gereguleerd of post-translationeel gemodificeerd. HRMC's werden gekweekt met behulp van SILAC en KLF15 werd tot overexpressie gebracht in de cellen door middel van plasmidetransfectie. De eiwitten werden verzameld voor LC/MS-detectie en er werden 1357 differentieel tot expressie gebrachte eiwitten verkregen. GO- en routeanalyses onthulden dat sommige van de differentieel tot expressie gebrachte eiwitten betrokken waren bij ubiquitinatie. De gen- en eiwitgegevens werden doorgesneden. De genen die geen verband houden met het onderzoeksdoel en genen die niet direct door KLF15 worden gereguleerd, zijn verwijderd; uiteindelijk werden 52 genen gescreend. Hiervan werden de vijf genen geselecteerd met de meest voor de hand liggende expressieverschillen die het nauwst verwant waren aan proliferatie. Gezien de gecombineerde resultaten van pathway-analyse, SUMO1- en KLF15-expressie-analyse in prolifererende HRMC's, ChlP-PCR en dual-luciferase reporter-assays, werd het eiwit SUMO1 geselecteerd als het doelgen van KLF15.

Naast ubiquitine worden steeds meer UBL-eiwitten,3637, waaronder SUMO,38 tot expressie gebrachte neurale voorlopercellen, in de ontwikkeling naar beneden gereguleerde 8(NEDD8)3940 en interferon-gestimuleerd gen 15(ISG15),41 geïdentificeerd. Deze modificerende eiwitten reguleren op krachtige wijze een verscheidenheid aan biologische processen. De covalente toevoeging van SUMO aan substraten, SUMOylation genaamd, is een post-translationele modificatie die betrokken is bij een reeks cellulaire processen, waaronder nucleair-cytosolisch transport, transcriptionele regulatie, apoptose, eiwitstabiliteitscontrole, stressreacties en celcyclusprogressie.27SUMO is typisch gehecht aan acceptorlysineresiduen van eiwitsubstraten die een consensussequentie herbergen en draagt ​​bij aan de regulatie van eiwit-eiwitinteracties evenals aan subcellulaire compartimentering en eiwitstabiliteit.2 sUMO1, als lid van de SUMOS-familie, kan celproliferatie beïnvloeden door substraat te modificeren en stabiliserende celcyclusregulerende eiwitten.43 Daarom hebben we ons, in combinatie met het literatuurrapport en de uitgebreide screening- en analyseresultaten, gericht op hoe KLF15 het effect van SUMO1 op mesangiale celproliferatie reguleert.

Om de substraten van SUMO1 te identificeren, hebben we een netwerkanalyse van SUMO1 uitgevoerd met behulp van de IPA-database en SUMOsp-software. Gecombineerd met gepubliceerd onderzoek naar P53, suggereerden onze eerste screeninggegevens P53 als een stroomafwaarts molecuul van SUMO1 met de SUMOylation-sequentie YKxD/E. Eerdere studies hebben aangetoond dat P53 een substraat was van SUMOylation,45 en verbeterde P53 SUMO1-conjugatie bevorderde de stabiliteit en activiteit van P53 en induceerde senescentie.46 In onze studie produceerde interferentie met de expressie van SUMO1 in HRMC's dezelfde veranderingstrends in SUMO1-P53 en P53, wat aangeeft dat P53 een SUMOyleringssubstraat van SUMO1 was.

Opkomend bewijs heeft aangetoond dat SUMOylatie en de-SUMOylatie een rol spelen bij tal van nefropathische ziekten, zoals nierdysgenese, niercarcinoom, glomerulaire ziekte, apoptose van podocyten en hypertonie van de niermerg, acuut nierletsel en nefrolithiasis.7-51 Om de oorzaak te verduidelijken. relatie tussen KLF15, SUMO1, P53 SUMOylation en MC-proliferatie, voerden we een reeks transfectiebehandelingen uit op cellen die door PDGF-BB geïnduceerde proliferatie hadden ondergaan. Overexpressie van KLF15 reguleerde de expressie van SUMO1 opwaarts, terwijl overexpressie van SUMO1 de expressie van KLF15 niet beïnvloedde. Overexpressie van KLF15 of SUMO1 verhoogde de SUMOylering van P53 en antagoneerde de celproliferatie geïnduceerd door PDGF-BB. Toen de expressie van SUMO1 werd geremd, werd ook de SUMOylering van P53 geremd en verloor KLF15 zijn antagonistische effect op celproliferatie. In-vivo. de proliferatie van MC's nam geleidelijk toe met verergering van mesangiale proliferatieve nefritis, terwijl de expressie van KLF15, SUMO1 en P53 aanzienlijk afnam. Gezien de geïntegreerde waarnemingen in cellen en weefsels, concluderen we voorlopig dat KLF15 de SUMOylatie van P53 via SUMO1 reguleert, waardoor MC-proliferatie wordt geremd.

5. CONCLUSIES

Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat KLF15 een belangrijke rol speelt bij het reguleren van de proliferatie van MC's. In dit werk hebben we de mechanismen onderzocht van onderdrukking van MC-proliferatie gemedieerd door deze transcriptiefactor. We identificeerden SUMO1 als het primaire doelwit van KLF15 in MC's via bio-informatica-analyses met ChIP-Seq en SILAC-LC/MS. Verder hebben we met behulp van de IPA-database en SUMOsp-software vastgesteld dat P53 een direct substraat van SUMO1 was. In vitro en in vivo experimenten bevestigden dat KLF15 de expressie van SUMO1 en de SUMOylering van P53 zou kunnen bevorderen en vervolgens de proliferatie van MC's zou kunnen remmen (Figuur S2). Deze resultaten dragen bij aan het begrip van de regulerende rol van KLF15 in MC-proliferatie en bieden een theoretische basis voor het vinden van nieuwe behandelingen voor MC-proliferatie-gerelateerde nierziekten.