Toegankelijkheid van chromatine en microRNA-expressie in nefron-voorlopercellen tijdens nierontwikkeling

Voor meer informatie:ali.ma@wecistanche.com

Andrew Clugston^1,2,3, Andrew Bodnar^2,3, Débora Malta Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6Alyssa Lawler^8,9,10Kristy Boggs⁷Andreas Pfenning^8,10Jacqueline Ho^2,3*en Dennis Kostka^1,4*

¹Afdeling Ontwikkelingsbiologie, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, VS²Rangos Research Center, UPMC Kinderziekenhuis van Pittsburgh, Pittsburgh, PA, VS³Afdeling Kindergeneeskunde, Afdeling Nefrologie, University of Pittsburgh School of Medicine, PA, VS⁴Afdeling Computational & Systems Biology en Pittsburgh Center for Evolutionary Biology and Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, VS⁵Afdeling Genetische en Genomische Geneeskunde, Afdeling Kindergeneeskunde, UPMC Kinderziekenhuis van Pittsburgh, Pittsburgh, PA, VS⁶Afdeling Pathologie, Klinisch Biochemisch Genetica Laboratorium, UPMC Kinderziekenhuis van Pittsburgh, Pittsburgh, PA, VS⁷Afdeling Kindergeneeskunde, Afdeling Gastro-enterologie, Hepatologie en Voeding, Universiteit van Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, VS.⁸Computationele biologie,⁹Biologische Wetenschappen, en¹⁰Neuroscience Institute, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA, VS

Abstract

Zoogdiernefronen zijn afkomstig uit een populatie vannefron voorlopercellenen veranderingen in de transcriptomen van deze cellen dragen bij aan de stopzetting van nefrogenese, een belangrijke determinant van het aantal nefronen. Om microRNA (miRNA) -expressie te karakteriseren en vermeende cis-regulerende regio's te identificeren, verzamelden we nefron-voorlopercellen van muizennierenop embryonale dag 14.5 en postnatale dag nul en getest op kleine RNA-expressie en transposase-toegankelijk chromatine. We hebben expressie gedetecteerd van 1.104 miRNA (114 met expressieveranderingen) en 46.374 chromatine-toegankelijke regio's (2.103 met veranderingen ontoegankelijkheid). Genoombreed benadrukken onze gegevens processen zoals cellulaire differentiatie, celmigratie, extracellulaire matrixinteracties en ontwikkelingssignaleringsroutes. Bovendien identificeren ze nieuwe kandidaat-cis-regulerende elementen voor Eya1 en Pax8, beide genen met een rol in de differentiatie van nefron-voorlopercellen. Ten slotte associëren we expressieveranderende miRNA's, waaronder let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p en miR{{ 20}}p, met kandidaat-cis-regulerende elementen en doelwitgenen. Deze analyses benadrukken nieuwe vermeende cis-regulerende loci voor miRNA in nefron-voorlopers.

Invoering

De functionele eenheid van denieris het nefron, dat dient om afval te filteren en de normale homeostase van water, zuur-base en elektrolyten in het lichaam te behouden. Het aantal nefronen varieert sterk bij mensen (meestal tussen tweehonderdduizend en meer dan een miljoen nefronen (Hughson et al., 2003)) en wordt vastgesteld vóór de geboorte bij mensen (ongeveer postnatale dag 2-3 bij muizen (Hartman et al., 2003) ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). Nefronen kunnen niet regenereren na de geboorte, en een verminderde nefrongift is geassocieerd met een verhoogd risico op chronische nierziekte en hypertensie (Bertram et al., 2011). Het nefrongetal wordt op zijn beurt voor een groot deel bepaald door een populatie van cellen genaamdnefron voorlopercellen(Cebrian et al., 2014b). In de laatste stadia vannierontwikkeling, vergroten nefron-voorlopers hun neiging om te differentiëren, wat hun populatie geleidelijk uitput en de uiteindelijke stopzetting van nefrogenese markeert (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). Het begrijpen van de mechanismen die de stopzetting van nefrogenese reguleren, heeft belangrijke implicaties voor de bepaling van de schenking van nefron en het risico op daaropvolgende nierziekte.

Gedurendenierontwikkeling, worden zelfvernieuwende Cited1 plus /Six2 plus nefron-voorlopers geïnduceerd om geprimed Cited1-/Six2 plus voorlopers te worden, en vervolgens differentiëren tot Wnt4-tot expressie brengende nierblaasjes in reactie op Wnt9b/-catenine (McMahon et al., 2016; Rumballe et al., 2011). Intrinsieke transcriptionele veranderingen in vroege versus late nefron-voorlopers omvatten genen en routes die de veroudering van stamcellen beïnvloeden, in het bijzonder mTor en zijn repressor hamartin (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). Er wordt inderdaad gedacht dat hamartine nefron-voorlopers ongevoelig maakt voor signalen voor zelfvernieuwing en op deze manier bijdraagt ​​​​aan de stopzetting van nefrogenese (S. Chen et al., 2015). In overeenstemming met het idee dat vroege nefron-voorlopers een grotere neiging hebben tot zelfvernieuwing, is de waarneming dat de toegankelijkheid van chromatine is verrijkt voor bindingsplaatsen van transcriptiefactoren van kern-nefron-voorlopercellen, waaronder Six2 en Wt1 in vergelijking met late nefron-voorlopers (Hilliard et al. , 2019). Van deze transcriptiefactoren is aangetoond dat ze enhancer-sequenties binden die zich in "regulerende hotspots" in het genoom bevinden (O'Brien et al., 2018). De inductie van nefron-voorlopers vindt plaats als gevolg van stijgende catenine-niveaus, wat resulteert in activering van Lef1 / Tcf7-complexen bij genen die klaar zijn voor activering van het nefrogenese-programma (Park et al., 2012), en er is gesuggereerd dat ze complexeren met Tcf7l1 en Tcf7l2 om regulerende chromatine-lussen tot stand te brengen en te behouden die genactivering vergemakkelijken (Guo et al., 2021).

Klik naarCistanche tubulosa-poeder voor de behandeling van nieraandoeningen

Recente studies hebben microRNA's (miRNA) betrokken bij het reguleren van de stopzetting van nefrogenese. miRNA zijn korte, niet-coderende RNA-moleculen die zich richten op messenger-RNA-transcripten (mRNA) voor verminderde translatie of verhoogde afbraak via het RNA-geïnduceerde silencing-complex (RISC) (Bartel, 2009). Het eiwit Lin28b is een bekende repressor van de let-7familie van miRNA's (Heo et al., 2008). Lin28b-expressie neemt af in nefron-voorlopers naarmate nefrogenese vordert, en dit valt samen met een toename in expressie van de let-7 miRNA-familie (Yermalovich et al., 2019). Bovendien resulteert voorwaardelijke inductie van Lin28b-expressie in de Wt1--lijn in onderdrukking van let{12}} miRNA, wat voldoende is om nefrogenese te verlengen (Yermalovich et al., 2019). Het is niet bekend of andere miRNA's de timing van nefrogenese reguleren. Bovendien, terwijl versterkers zijn geïdentificeerd die lange niet-coderende RNA-expressie tijdens nefrogenese reguleren (Nishikawa et al., 2019), is er geen aangetoond dat ze miRNA-expressie in nefron-voorlopers reguleren.

In deze studie probeerden we tegelijkertijd nieuw miRNA te identificeren dat bijdraagt ​​​​aan de stopzetting van nefrogenese, samen met mogelijke cis-regulerende kenmerken. Daarom hebben we, om veranderingen in miRNA-expressie en chromatine-toegankelijkheid tussen embryonale dag 14.5 (E14.5) en postnatale dag nul (P0) waar te nemen, gematchte mRNA-seq- en ATAC-seq-datasets geproduceerd van primaire en niet-gepasseerdenefron voorlopercellenop deze twee tijdstippen. We identificeerden 114 miRNA's die differentieel tot expressie worden gebracht innefron voorlopercellentussen deze twee tijdstippen, evenals 2.103 regio's met veranderende chromatinetoegankelijkheid die we differentieel toegankelijke regio's (DAR's) noemen. Verrijkingsanalyses van de voorspelde gendoelen van significant veranderende miRNA en van de genomische locaties van DAR's impliceren routes die van invloed zijn op epitheelceldifferentiatie, celmigratie, extracellulaire matrixinteracties en belangrijke ontwikkelingssignaleringsroutes zoals Wnt, Notch en TGF-signalering . We observeren significante veranderingen in toegankelijkheid in chromatine en presenteren meerdere bewijslijnen die twee genomische regio's impliceren als vermeende versterkers voor de genen Eya1 en Pax8 in nefron-voorlopercellen. Ten slotte identificeerden we consistente toegankelijkheid van chromatine en miRNA-expressieveranderingen voor 33 paren miRNA's en DAR's, waaronder let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p en miR-9-3p, en presenteren vermeende doelwitgenen die tot expressie worden gebracht in nefron-voorlopers voor differentieel tot expressie gebrachte miRNA's.

Resultaten

Isolatie van populaties van nefron-voorlopercellen van E14.5 en P0nieren

Nefron-voorlopercellenwerden geïsoleerd door positieve selectie voor Itg 8 op E14.5 of op P 0, en elk monster werd verdeeld om mRNA-seq, ATAC-seq en kwaliteitscontrole uit te voeren (aanvullende figuur 1 AB). Kwantitatieve PCR (qRT-PCR) bevestigde dat de nefron-progenitor-markergenen Six2 en Cited1 (Huang et al., 2016) in hoge mate tot expressie worden gebracht in geïsoleerde nefron-progenitor-monsters ten opzichte van de helenier, meer dan markers voor andere celtypen (inclusief ureterknop (Caleb) (Cebrian et al., 2{{10}}14a), endotheelcellen (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), nierstroma (Pdgfr ) (S. Chen et al., 2015) en nierblaasje (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (Aanvullende figuur 1 C) Wat betreft geslacht varieerde het strooisel dat voor E14.5-monsters werd gebruikt van 27 procent tot 50 procent vrouwelijk, en nesten voor P0-monsters varieerden van 31 procent tot 75 procent vrouwelijk. Gemiddeld waren E14.5-monsters 38 procent vrouwelijk en P0-monsters waren 49 procent vrouwelijk (aanvullende figuur 1 D). Deze worden zorgvuldig ouder -gematchte populaties van nefron-voorlopercellen stelden ons in staat om te analyserenchromatine toegankelijkheiden kleine RNA-expressie in dezelfde ontwikkelingsstadia op twee tijdstippen (E14.5 en P0).

Vroege en late nefron-voorlopers hebben verschillende miRNA-transcriptieprofielen

Small-RNA-sequencing detecteerde 1,104 bekende miRNA-transcripten en identificeerde 114 miRNA's die een significante verandering in expressie vertonen tussen E14.5- en P{{10}}-monsters (valse ontdekkingssnelheid ( FDR)=0.05; aanvullende tabel 1). De helft van de differentieel tot expressie gebrachte miRNA's vertonen verhoogde expressie op P0 vergeleken met E14.5, en analyse van de hoofdcomponenten benadrukt een grotere homogeniteit in miRNA-expressie tussen E14.5-monsters vergeleken met P0 (Figuur 1A). Hiërarchische clustering onthult een duidelijke groepering van miRNA's in die van respectievelijk toenemende en afnemende expressie tussen E14.5 en P0 (Figuur 1B). Leden van de let -7-familie van miRNA's behoren tot de meest tot expressie gebrachte miRNA die zijn gedetecteerd, en we merken op dat alle familieleden met significante veranderingen verhoogde expressie vertonen bij P0 (gegevens niet getoond). Dit komt overeen met resultaten die aantonen dat een vermindering van de expressie van Lin28b leidt tot een brede toename van de expressie van de familie van de laat-7 in de loop van nefrogenese (Yermalovich et al., 2019). Andere miRNA's met een significant hogere expressie op P0 zijn miR-429-3p, een lid van de miR-200-familie waarvan bekend is dat het de differentiatie van podocyten beïnvloedt (Z. Li et al., 2016), en beide miR{{30 }}a-5p en miR-125b-5p. Van de laatste twee is bekend dat ze Lin28-transcripten in verschillende cellulaire omgevingen onderdrukken (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). miRNA met significant lagere expressie op P0 omvat de angiogenese- (S. Wang et al., 2008) en proliferatiebevorderende (Schober et al., 2014) miR-126.

De DIANA miRPath-tool maakt KEGG-pathway-analyse van miRNA mogelijk op basis van hun respectievelijke gendoelen, zoals voorspeld door micro T-CDS (Vlachos et al., 2015). We vinden dat miRNA met de grootste veranderingen in expressie tussen E14.5 en P0 (omhoog of omlaag) die zijn die routes reguleren met sleutelrollen in nefrogenese (Figuur 1C, Aanvullend figuur 2). Tgf- wordt bijvoorbeeld uitgescheiden door omringende stromale cellen om differentiatie van nefron-voorlopercellen te bevorderen (Rowan et al., 2{{50}}18), en we merken verminderde expressie op onder nefron-voorloper-miRNA dat zich richt op de stroomafwaartse effectoren van de "TGF-signaleringsroute" (KEGG-route mmu04350, p-waarde 1,45e- 6). De "MAPK-signaleringsroute" (mmu04010) beïnvloedt de organisatie en priming van nefron-voorlopers voor differentiatie en reguleert hun interacties met de extracellulaire matrix (ECM) via Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018). We merken een aanzienlijk aantal op en neer gereguleerde miRNA's op die zich richten op verschillende genen in deze MAPK-signaleringsroute (p-waarden van respectievelijk 3,5e- 6 en 3,0e- 4 voor omhoog- en omlaaglijsten) . Ten slotte is de KEGG-route "Extracellulaire matrix (ECM) receptorinteractie" (mmu04512) de meest significant verrijkte route die is geïdentificeerd, en de samenstellende genen zijn veel significanter het doelwit van miRNA die in de loop van de tijd in expressie toenemen (p-waarde van 7,4e{ {32}} bij toenemende miRNA versus 1.1e-2 bij afnemende). ECM-geassocieerde genen zijn het doelwit van enkele van de meest tot expressie gebrachte en aanzienlijk toenemende miRNA die we detecteren, waaronder miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5p, en laat-7f-5p. In het bijzonder is miR-196a-5p het hoogste tot expressie gebrachte miRNA in onze monsters, en het ziet een 8-voudige toename tussen E14.5 en P0. Gentranscripten die de voorspelde doelen waren van miRNA (met behulp van TargetScan (Agarwal et al., 2015)) met verhoogde expressie op P0 omvatten Bach2, een voorgestelde moleculaire link tussen de MAPK/AP1- en Six2/-catenine-routes voor zelfvernieuwing en differentiatie in respectievelijk nefron-voorlopers (Hilliard et al., 2019).

Om vermeende doelen van differentieel tot expressie gebrachte miRNA's in nefron-voorlopers te identificeren, gebruikten we computationele annotatie van miRNA's in miRDB (Y. Chen & Wang, 2020), en de geannoteerde experimentele miRNA-mRNA-interacties van mortelbasis (HY Huang et al., 2020), in combinatie met onze eerder gegenereerde E14.5 eencellige RNA-sequencing-dataset (Bais et al., 2020). We hebben dus een lijst met mogelijke miRNA-mRNA-interacties gegenereerd op basis van differentiële expressie van de miR tussen E14.5 en P0 in nefron-voorlopers met een overeenkomstige verandering in doelgenexpressie tussen zelfvernieuwende en geprimede nefron-voorlopers, evenals geprimed en differentiërende nefron-voorlopers (Figuur 2). Onze analyse suggereert dat Meis2 en Hmga2 potentiële doelwitten zijn van de let-7-familie van miRNA's in nefron-voorlopers (Figuur 2), met verminderde expressie van Meis2 en Hmga2 geassocieerd met verhoogde expressie van de let-7 familieleden in differentiërende of verouderende nefronvoorlopers. De transcriptiefactor Meis2 komt sterk tot expressie in nefron-voorlopers en het renale stroma tijdensnierontwikkeling (Lam et al., 2014), en is gekoppeld aan de regulatie van celproliferatie in andere contexten (Abruzzese et al., 2019). Hmga2 is een niet-histon-chromatine-bindend eiwit, het wordt sterk tot expressie gebracht in stamcellen en het is in verband gebracht met een verscheidenheid aan mesenchymale tumoren (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). Evenzo is er toenemende Jag1-expressie geassocieerd met afnemende expressie van miR-34b-5p, miR-983p en miR-200a-3p bij het differentiëren of verouderende nefronvoorlopers (Figuur 2). Jag1 is een sleutelligand in Notch-signalering waarvan de expressie toeneemt naarmate nefron-voorlopers differentiëren (Chung et al., 2016). Alle voorspelde of geannoteerde miRNA-doelen voor genen met expressieveranderingen tussen zelfvernieuwende, geprimede en differentiërende nefron-voorlopers zijn beschikbaar in Supplemental.

Figuur 1. Aanzienlijke veranderingen in miRNA-expressie tussen E14.5 en P0 nefron-voorlopers. A) Analyse van de belangrijkste componenten toont aan dat het ontwikkelingstijdstip een belangrijke bijdrage levert aan de variatie in miRNA-expressie. B) Heatmap met relatieve expressie van alle significant veranderende miRNA. Kolommen met E14.5-monsters aan de linkerkant zijn geannoteerd in lichtgroen en kolommen met P0-monsters aan de rechterkant zijn geannoteerd in donkergroen. C) Verrijking van genen van specifieke KEGG-routes onder voorspelde gendoelen van op en neer gereguleerde miRNA (respectievelijk rode en blauwe balken). De minimaal opgenomen p-waarde is 1e-5.

Figuur 2. miRNA-mRNA-interacties met een mogelijke rol bij veroudering en differentiatie van nefron-voorlopercellen. Weergegeven zijn miRNA (cirkels) en mRNA (vierkanten). miRNA's met een verhoogde expressie tussen E14.5 en P0 worden weergegeven in rood, miRNA's die afnemen worden weergegeven in blauw. Geannoteerde doelgenen (van mirDB en mir TarBase) met een toenemende expressie tussen zelfvernieuwend, geprimed of differentiërendnefron voorlopercellen(Bais et al., 2020) worden weergegeven in rood, mRNA met afnemende expressie in blauw. Randen van mirDB en mirTarDB die inconsistent zijn met waargenomen expressieveranderingen zijn weggelaten maar zijn opgenomen in aanvullende tabel 2.

Vroege en late nefron-voorlopers hebben verschillende chromatine-omgevingen

ATAC-seq-gegevens van E14.5 en P0 nefron-voorlopers stelden ons in staat om 46.374 regio's van toegankelijk chromatine te identificeren (met een onherleidbare ontdekkingssnelheid (Boleu et al., 2015) drempel van {{ 22}}.1, zie (aanvullende figuur 3 C, aanvullende tabel 3), gecombineerd over monsters en tijdstippen. We merken op dat onze gegevens voldoen aan de ATAC-seq-richtlijnen van het ENCODE-project (ENCODE, nd) (aanvullende figuur 3 A, B) en dat we hogere conserveringspercentages waarnemen bij IDR-pieken dan bij gerandomiseerde controles (aanvullende figuur 3 D). Van de IDR's die we rapporteren, bevatten 3.576 versterkers die zijn gedocumenteerd in de VISTA (Visel et al., 2007) en/of FANTOM5 (de Rie et al., 2017) enhancer-databases en 13.495 bevatten DNA-sequenties met voorspelde regulerende rollen in ten minste één muisweefsel of celtype volgens EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Hoofdcomponentanalyse (aangepast voor sekseverschillen tussen monsters) onthulde een duidelijke groepering van monsters op ontwikkelingstijdstip (Figuur 3A). Om genomische loci te identificeren met veranderingen in de toegankelijkheid van chromatine, vergeleken we het ATAC-seq-signaal tussen E14.5- en P0-monsters. We hebben 2,103 DAR's waargenomen, waarmee de FDR op 10 procent werd gecontroleerd. Van deze 1323 (55 procent) vertoonden verhoogde toegankelijkheid op P0 vergeleken met E14.5, en hiërarchische clustering onthulde een duidelijk onderscheid tussen DAR's die respectievelijk openen en sluiten tussen E14.5 en P0 (Figuur 3B).

Transcriptiefactorvoetafdrukken werden geïdentificeerd met behulp van HINT en gematcht met DNA-bindende eiwitten met behulp van motieven uit de HOCOMOCO 11-database (Kulakovskiy et al., 2018). Van de 431 geteste motieven, vertonen DAR's die voetafdrukken bevatten voor verschillende transcriptiefactoreiwitten geassocieerd met nefrogenese een toename in toegankelijkheid tussen E14.5 en P0. Van de voetafdrukken in DAR's die gemiddeld in toegankelijkheid toenemen, behoort de top zes tot transcriptiefactorvoetafdrukken die overeenkomen met Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd (0.13), Six4 (0.13), juni (0.12) en Fos (0.11). Voetafdrukken geannoteerd bij het sluiten van DAR's omvatten transcriptiefactoren E2F2 en E2F4, waarvan bekend is dat ze de voortgang van de celcyclus beïnvloeden (Gaudet et al., 2011) en celproliferatie bevorderen (D. Wang et al., 2000) in andere cellulaire contexten (aanvullende figuur 4).

Om de biologische context van het openen en sluiten van DAR's te evalueren, hebben we de Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) (McLean et al., 2010) gebruikt om genensets te markeren met verrijking van geassocieerde veranderende chromatineregio's. Met die benadering identificeren we biologische processen van genontologie (GO) die nauw verbonden zijn met de ontwikkeling van nefron-voorlopercellen: in het bijzonder is het belangrijkste verrijkte proces bij het openen van DAR's "Regulation of epithelial cell differentiation" (GO:0030856, Binomiale Q-waarde {{3 }}.5e-5), en "Positieve regulatie van epitheliale celdifferentiatie" (GO:0030858, Binomiale Q-waarde=5e-3) behoort tot de top 10 van meest significant verrijkt Aanvullend figuur 5). Beide zijn consistent met een toename van de neiging van nefron-voorlopers om mesenchymale-naar-epitheliale overgangen (MET) te ondergaan terwijl ze differentiëren (S. Chen et al., 2015). Andere significant verrijkte routes omvatten "Positive Regulation of Notch Signaling Pathway" (GO:0045747, Binomiale Q-waarde=2e-5), wat consistent is met de rol die Notch-signalering speelt bij het bevorderen van differentiatie van nefron-voorlopercellen ( Chung et al., 2016). De 10,083 gedetecteerde afsluitende DAR's onthulden geen significante GO-termen op basis van GREAT's standaardcriteria voor significantie (zie aanvullende figuur 5).

Figuur 3. Verschillen in toegankelijkheid van chromatine kenmerken E14.5 vs. P0nefron voorlopercellen.A) Analyse van de hoofdcomponenten van ATAC-seq-monsters wijst op ontwikkelingstijdstippen als een belangrijke bron van variatie. B) Heatmap met significant veranderende IDR-regio's in ATAC-seq-monsters. E14.5 monsters/kolommen zijn geannoteerd in lichtgroen en P0 monsters/kolommen zijn geannoteerd in donkergroen. C) GO Biologische Procestermen verrijkt voor genomische regio's die openen tussen E14.5 en P0 volgens GREAT, gerangschikt op binomiale P-waarde, FDR Kleiner dan of gelijk aan 0.001.

Vervolgens hebben we verkendchromatine toegankelijkheidin regio's van het genoom die promotors en versterkers bevatten voor genen met gepubliceerde rollen in differentiatie van nefron-voorlopercellen. Hiervan is de Six2-transcriptiefactor van cruciaal belang voor het behoud van multipotentie vannefron voorlopercellen(Self et al., 2006), en in alle monsters zagen we toegankelijk chromatine rond de promotor en een bekende Six2-enhancer ~ 50 kb stroomopwaarts van de Six2-transcriptiestartplaats (TSS) (O'Brien et al., 2018) (Figuur 4A, B, blauw gearceerde gebieden). We noteren ook regio's van toegankelijk chromatine op de promotor en een gepubliceerde versterker voor het eiwit Gdnf (Figuur 4D, E), dat wordt uitgescheiden door nefron-voorlopers om vertakking van de ureterknop te bevorderen (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996 ). Deze versterker bevindt zich ~113 kb stroomopwaarts van de genpromoter en het is bekend dat deze reageert op Wnt-signalering in de context van het ontwikkelen van nefron-voorlopers (Park et al., 2012). Hoewel de promotor voor Gdnf in de loop van de tijd niet significant verandert, verhoogt de geannoteerde versterker de ontoegankelijkheid aanzienlijk. We merken ook regio's van toegankelijk chromatine op die een gepubliceerde versterker omringen die actief is in nefron-voorlopers voor Eya1 die zich ~ 325 kb stroomopwaarts van de TSS van het gen bevindt (Park et al., 2012) (aanvullende figuur 6). Eya1 is een transcriptiefactor die interageert met Six2 om de multipotentie van nefron-voorlopercellen te behouden (J. Xu et al., 2014).

We observeren verschillende DAR's die bekende regulerende kenmerken niet overlappen, maar regio's omvatten waarvan wordt voorspeld dat ze enhancer-activiteit hebben voor specifieke genen in een verscheidenheid aan muisceltypen, zoals geannoteerd in EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). Naast de gepubliceerde versterker van Eya1 (Park et al., 2012) (aanvullende figuur 6), omvat een afsluitende DAR in een van de introns van Eya1 (Figuur 5A-B) een regio waarvan wordt voorspeld dat deze versterkeractiviteit heeft op het Eya1-gen in muizen neurale voorlopercellen en granulocyt-monocyt-voorlopercellen (Gao & Qian, 2020). In lijn met een vermindering van de enhancer-activiteit, hebben we eerder waargenomen dat expressie van Eya1 is afgenomen in differentiërende nefron-voorlopers met behulp van E14.5 scRNA-seq-gegevens (aanvullende figuur 7) (Bais et al., 2020). Dit komt overeen met gepubliceerde ChIP-seq-gegevens in primaire E16.5-nefron-voorlopers die een gebrek aan het actieve versterkermerk, H3K27ac, en een gebrek aan binding van Ctnnb1, Lef1, Six2 en Tcf7 vertonen (Figuur 5) (Guo et al. ., 2021). Deze potentiële versterker bevat ook transcriptiefactorvoetafdrukken voor Hoxd10 binnen zijn piek, een transcriptiefactor die essentieel is voor differentiatie en integratie van nefronvoorlopers tijdens mesenchymale-naar-epitheliale overgangen (MET) (Yallowitz et al., 2011).

Een DAR die de ontoegankelijkheid op chromosoom 24 verhoogt, overlapt een chromatinegebied met voorspelde versterkeractiviteit voor de transcriptiefactor Pax8 in cellen gekweekt uit muizennier, darmepitheel en baarmoeder (Gao & Qian, 2020). Pax8 is gedeeltelijk redundant met Pax2, maar ten minste één van deze twee transcriptiefactoren is vereist in nefron-voorlopers voornierontwikkeling (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). We hebben eerder waargenomen dat Pax8-expressie toeneemt in differentiërende en gedifferentieerde nefron-voorlopers (aanvullende figuur 7), en we merken een significante toename in toegankelijkheid op in een DAR die deze regulerende functie omvat. Deze regio wordt ook geassocieerd met een actieve versterkermarkering, H3K27ac, en binding van Ctnnb1, Lef1, Six2 en Tcf7 in gepubliceerde ChIP-seq-gegevens van primaire E16.5-nefron-voorlopers (Figuur 5) (Guo et al., 2021). We observeren een aantal voetafdrukken van transcriptiefactoren die binnen de sterk geconserveerde toegankelijkheidspiek van deze DAR vallen, waaronder twee voor Sall1, een nucleaire factor waarvan bekend is dat het de nefrogenese beïnvloedt (Kanda et al., 2014), en zeven nauw gegroepeerde voetafdrukken voor MYC-geassocieerde zinkvinger eiwit (Maz), een transcriptiefactor waarvan is aangetoond dat het dosisafhankelijke effecten heeft opnierontwikkeling bij mensen en muizen (Haller et al., 2018). Aanvullende tabel 3 bevat een volledige lijst van de toegankelijke regio's die we vinden, evenals hun respectieve differentiële toegankelijkheidsstatistieken, annotaties voor genen, exons en promotors die ze overlappen, en lijsten met geïdentificeerde belangrijke aan nefrogenese gekoppelde voetafdrukken van transcriptiefactoren.

Figuur 4. ATAC-seq-profielen op bekende en vermeende regulerende loci. Voor elk paneel van boven naar beneden duiden facetten op vouwverrijking vanchromatine toegankelijkheidin E14.5- en P0-monsters, waarbij IDR's en DAR's worden aangegeven als highlights in blauw (onveranderlijke IDR) en groen (opening DAR). en rood (sluiten van DAR). Het volgende facet toont genannotaties, nucleosomale posities (grijs) en nucleosoomvrije gebieden (rood) gemeten in gepoolde E14.5- en P0-monsters, en PhastCon60-behoudscores (zwart geeft 1{{ 12}}0 procent behoud, wit 0 procent geconserveerd A) Promotor en genlichaam van de Six2-transcriptiefactor. B) Enhancer voor Six2, uitgegeven door Park et. al. C) Differentieel toegankelijke versterker voor Gdnf met verhoogde toegankelijkheid op P0. D)Promotor voor Gdnf.

Figuur 5. DAR's die potentiële nieuwe versterkers voor nefrogenese-gekoppelde genen overlappen. A en C) Panelen tonen een kaart van de 1 MB-regio rond een gen van belang, met eiwitcoderende genen in het groen en de voorgestelde versterker/promotor-interactie als een zwarte lus . B en D) Van boven naar beneden tonen panelen vouwverrijking van:chromatine toegankelijkheidgemeten in E14.5- en P0-monsters, met IDR's gemarkeerd in groen (opening) en rood (sluitend), gevolgd door ChIP-seq-metingen in deze regio's gemeten door Guo et. al. in de primaire nefron-voorlopercellen(Guo et al., 2021). Het derde paneel toont genannotaties (blauw) en voorspelde regulerende elementen van Enhancer Atlas 2.0 (rood), en het vierde paneel geeft transcriptiefactorvoetafdrukken aan die zijn geïdentificeerd in ATAC-seq-gegevens. Het vijfde paneel toont nucleosomen (grijs) en NFR's (rood), en het onderste paneel geeft behoud aan. A) 1 MB-regio met het genlichaam voor Eya1 en een potentiële Eya1-versterker ongeveer 325 kb stroomopwaarts. B) Een gebied van 4,5 kb dat de potentiële Eya1-versterker bevat. C) 1 MB-regio met de Pax8-genlocus en een voorspelde versterker. D) Een gebied van 4,5 kb dat de voorspelde versterker en zijn overlappende DAR bevat.

Topologisch geassocieerde domeinen helpen bij het identificeren van potentiële enhancer-miRNA-relaties

Topologisch geassocieerde domeinen (TAD's) zijn regio's op megabaseschaal met een hogere orde chromatine-organisatie die het gevolg zijn van de verpakking van chromatine in de kern in een driedimensionale ruimte (Dixon et al., 2012), en interacties tussen versterkers en promotors zijn doorgaans beperkt tot elementen binnen dezelfde TAD (Symmons et al., 2014). We benaderden TAD's van nefron-voorlopers met behulp van annotaties gegenereerd uit embryonale stamcellen van muizen (ESC's) (Y. Wang et al., 2018). Om te screenen op mogelijke cis-regulerende regio's van miRNA, correleerden we veranderingen inchromatine toegankelijkheidmet differentieel tot expressie gebracht miRNA binnen dezelfde TAD. In totaal bevinden 42.778 unieke toegankelijke regio's (ongeveer 92 procent) zich binnen geannoteerde TAD's, en van deze 30,626 (ongeveer 72 procent) overlappen ze geen bekende promotor. Dit omvat 2.103 DAR's, met respectievelijk 1.180 en 923 openen en sluiten. Vijftien openende DAR's delen een TAD met een of meer miRNA's met een verhoogde expressie tussen E14.5 en P0, en negen sluitende DAR's delen een TAD met een of meer miRNA's met verminderde expressie. Figuur 6 vat deze benadering samen en illustreert afstanden tussen DAR's en hun gematchte miRNA, die variëren van 27 kb tot meer dan 1 mb (gemiddeld: 447 kb). Tabel 1 geeft details over sets van mogelijke DAR-miRNA-relaties, met één DAR vermeld per overeenkomend miRNA.

Onder de geannoteerde miRNA-versterkerparen merken we er drie op die van bijzonder belang zijn. Ten eerste is een openings-DAR geïdentificeerd van 120 kb stroomafwaarts van let-7c-5p en 73 kb stroomafwaarts van miR-125b-5p, die wordt geassocieerd met een Six2 bindingsplaats in een eerder gepubliceerde E16.5 nefron progenitor ChIP-seq dataset (Figuur 7A) (Guo et al., 2021). Let-7c-5p is een van de meest tot expressie gebrachte let-7 miRNA's die we detecteren, en het is bekend dat de let-7-familie ook Lin28btranscripten onderdrukt (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). We merken op dat Hmga2 en Meis2 ook worden geïdentificeerd als potentiële nieuwe doelen van de let-7-familie in nefron-voorlopers (Figuur 2). Van miR-125b-5p is ook aangetoond dat het Lin28-transcripten onderdrukt in hematopoëtische en voorloperceltypen van muizen (Chaudhuri et al., 2012). Ten tweede is miR-9-3p het omgekeerde complement van miR-9-5p, een miRNA waarvan recent is aangetoond dat het beschermt tegennierfibrose door zich te richten op metabole routes (Fierro-Fernández et al., 2020). We detecteren een meer dan 10-voudige afname in miR-9-3ptranscripten tussen E14.5- en P0-nefronvoorlopers, en we hebben een potentieel regulerend element op ongeveer 249 kb afstand geïdentificeerd (Figuur 7B). We observeren transcriptiefactorvoetafdrukken voor Snai1 en Snai2 in de bijbehorende DAR, waarvan is aangetoond dat ze epitheliale naar mesenchymale overgangen (EMT) bevorderen (Sundararajan et al., 2019). Ten slotte hebben we miR-181a-2-3p gematcht met een mogelijke intergene cis-regulerende locus 131 kb stroomopwaarts op chromosoom 2, waar we een transcriptiefactorvoetafdruk opmerken voor de transcriptiefactor Wt1, een belangrijke regulator van de nefron-voorloper overleving (Kreidberg et al., 1993) en Six2-binding in een gepubliceerde E16.5-nefron-voorloper van ChIP-seq-gegevensset (Figuur 7C)) (Guo et al., 2021).

Tabel 1. miRNA-expressieveranderingen, gekoppeld aan een of meer DAR in dezelfde TAD.

Afbeelding 6. Vinden van kandidaat-versterker-doelwit-miRNA-paren. A) Stroomschema dat aangeeft hoe regio's van toegankelijkheid prioriteit kregen voor mogelijke regulering van miRNA-expressie. B) Genomische locaties van elk gescreend miRNA ten opzichte van hun kandidaat-versterker (oranje verticale streep). De schaal van hun log2-voudige verandering wordt weergegeven op de y-as en miRNA met toenemende of afnemende expressie wordt respectievelijk groen en rood gemarkeerd.

Afbeelding 7. Vier potentiële enhancer-target miRNA-paren. TAD's zijn grijs gemarkeerd, uitgelijnd met startpunten en op dezelfde schaal getekend om de relatieve grootte te illustreren. Bekende genen van Ensembl worden in paars weergegeven en donkere gebieden geven exons aan. Relatieve toegankelijkheid op E14.5 en P0 wordt weergegeven als staafdiagrammen boven en onder de horizontale zwarte lijn, respectievelijk, evenals in inzetdiagrammen die de stapeling in de gespecificeerde DAR illustreren, samen met ChIP-seq-gegevens gepubliceerd door Guo et . al. (Guo et al., 2021). Transcriptiefactorvoetafdrukken geïdentificeerd door HINT worden weergegeven in oranje banners. Staafdiagrammen in afzonderlijke panelen aan de rechterkant geven miRNA-expressie (groen) en genormaliseerde Tn5-insertie-gebeurtenissen aan in voorgestelde versterkerregio's (oranje). A) Het let-7 familielid let-7c-5p komt zeer sterk tot uiting innefron voorlopercellenen komt overeen met "piek_54636" 119 kb verderop in een intergene regio. B) miR-9-3p is gekoppeld aan een DAR 249kb verderop. C) miR-181a 2-3p bevindt zich 131 kb verwijderd van "peak_5887", een mogelijke intergene versterker.

Discussie

In deze studie probeerden we tegelijkertijd nieuw miRNA te identificeren dat bijdraagt ​​​​aan de stopzetting van nefrogenese, samen met mogelijke cis-regulerende kenmerken. We identificeerden 114 miRNA's die differentieel tot expressie worden gebracht in nefron-voorlopercellen, evenals 2,103 DAR's, in E14.5 vergeleken met P0nieren. We observeren meerdere kenmerken die nieuwe vermeende versterkers voorspellen voor de genen Eya1 en Pax8 innefron voorlopercellen. Ten slotte identificeerden we consistentechromatine toegankelijkheiden miRNA-expressieveranderingen voor 33 paren miRNA's en DAR's, waaronder let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p, en miR -9-3 p en huidige vermeende doelwitgenen die tot expressie worden gebracht in nefron-voorlopers voor differentieel tot expressie gebrachte miRNA's. Samen tonen onze gegevens aan dat veranderingen die intrinsiek zijn aan nefron-voorlopers en afhankelijk van het stadium van nefrogenese, worden weerspiegeld in de chromatine-omgeving van de voorlopercel en in zijn miRNA-transcriptoom.

Onder de veranderingen die we waarnemen in het miRNA-transcriptoom van de nefron-progenitor, merken we een brede toename in expressie op in de let{{0}}-familie naarmate de voorlopers ouder worden. Dit komt overeen met eerdere rapporten: Lin28b-eiwit en de let-7-familie van miRNA's zijn wederzijds antagonistisch en vormen een bistabiele schakelaar die de expressie van let-7 in zoogdieren regelt (Zhu et al., 2011), en in nefron-voorlopers, heeft de omschakeling naar verhoogde let -7-expressie direct invloed op de timing van de stopzetting van nefrogenese (Yermalovich et al., 2019). We zien ook verhoogde expressie van miR-125b-5p, waarvan ook bekend is dat het de expressie van Lin28b in andere cellulaire contexten onderdrukt (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). De let-7-familie en miR-125b-5p behoren tot de 114 miRNA's die differentieel tot expressie worden gebracht tussen E14.5 en P0 in nefron-voorlopercellen, wat de rol van miRNA's in de ontwikkeling van nefron-voorlopercellen suggereert is niet beperkt tot let-7/Lin28b. MiRNA's die in expressie afnemen, omvatten bijvoorbeeld twee leden van de miR-200-familie, waarvan is gemeld dat ze een rol spelen bij podocytdifferentiatie (Z. Li et al., 2016):miR-200b -3p en miR-429-3p. Verderop zien we een afname in de expressie van miR-126a 5p, waarvan bekend is dat het vasculogenese bevordert (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). Dit kan de gemeenschappelijke mesenchymale lijn van vasculogene en nefronvoorlopers weerspiegelen, en de inzet van een subset van deze cellen om nefronvoorlopers te worden.

Pathway-analyses van voorspelde gendoelen van veranderende miRNA's met behulp van DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015) tonen verrijking MAPK en TGF-signalering, beide belangrijke regulatoren van nefron-voorlopers (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella et al., 2018 ). Verschillende andere KEGG-routes zijn ook oververtegenwoordigd onder de voorspelde gendoelen van opwaarts gereguleerde miRNA's, inclusief routes die verband houden met de extracellulaire matrix, actine-cytoskelet en focale adhesie: alle cruciale facetten van cellulaire migratie, differentiatie, vertakking, hechting, polarisatie en proliferatie (Rozario & Desimone, 2010). ECM-geassocieerde genen zijn het doelwit van enkele van de meest tot expressie gebrachte en significant toenemende miRNA's die we detecteren, inclusief het hoogst tot expressie gebrachte transcript dat we detecteren: miR-196a-5p. Van miR-196a-5p is bekend dat het zich richt op Col1a1, Col1a2 en Col3a1 - genen die omhoog worden gereguleerd in Pax2-deficiënte nefron-voorlopers die transdifferentiatie ondergaan naar het renale stroma (Naiman et al., 2017). Verhoogde miR-196a-5pexpressie kan dus een rol spelen bij het versterken van de afstammingsgrenzen naarmate voorouders ouder worden. Verder identificeren we nieuwe potentiële miRNA-mRNA-doelwitinteracties die kunnen bijdragen aan de stopzetting van nefrogenese, inclusief de opregulatie van de let-7-familie die zich kan richten op Hmga2 en Meis2 (geassocieerd met celproliferatie) (Abruzzese et al. ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009) naarmate nefron-voorlopers ouder worden. Hmga2 heeft geen bekende rol innierontwikkeling. Er wordt echter gedacht dat Meis2 functionele overlap heeft met de gerelateerde transcriptiefactor Meis1, waarvan bekend is dat deze nodig is voor nierontwikkeling (Hisa et al., 2004). We nemen ook de neerwaartse regulatie van miR's (miR-34b-5p, miR-983p en miR-200a-3p) waar Jag1, waarvan bekend is dat het up-gereguleerd is en belangrijk is bij nefrondifferentiatie (Chung et al., 2016).

Samen met het veranderende miRNA-transcriptoom hebben we tegelijkertijd veranderingen gemeten in de chromatine-omgeving van de nefron-voorlopercel tussen E14.5 en P0. We beschrijven twee vermeende nieuwe versterkers voor Eya1 en Pax8, gebaseerd op (i) hun nabijheid tot deze genpromotors, (ii) hun respectieve veranderingen inchromatine toegankelijkheidtijdens de ontwikkeling in lijn zijn met pseudotime genexpressieveranderingen tijdens differentiatie, (iii) voetafdrukken vannierontwikkelingstranscriptiefactoren, (iv) sequentieconservering, (v) bewijs van enhancerfunctie in andere weefsels/celtypes van Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020), en (vi) ChIP-seq-gegevens in E16 .5 nefron-voorlopers voor een teken van actieve versterkers (H3K27ac) en transcriptiefactorbinding van Ctnnb1, Lef1, Six2 en Tcf7. We nemen een afname waar in de toegankelijkheid van chromatine voor de Eya1-versterker, wat consistent is met de rol van Eya1 bij het bevorderen van de multipotentie van nefron-voorlopercellen en met rapporten dat verlies van Eya1 resulteert in de vroege epithelialisatie van de voorlopercellen (J. Xu et al., 2014; PX Xu et al., 1999). Pax8 en zijn homoloog Pax2 dragen bij aan de afstammingsspecificatie van nefron-voorlopers (Bouchard et al., 2002), en nefron-voorlopers zonder ten minste één van deze genen zullen geen MET ondergaan (Narlis et al., 2007). De verhoogde toegankelijkheid van chromatine die we detecteren voor de vermeende Pax8-versterker is consistent met verhoogde Pax8-expressie in nierepitheel naarmate nefronen differentiëren.

Verrijkingsanalyse (McLean et al., 2010) van DAR's onthulde "Regulation of Epithelial Differentiation" als de meest significant verrijkte term onder de openende chromatineregio's, wat aangeeft dat de DAR's die we detecteren regulerende kenmerken kunnen bevatten die signalen voor differentiatie en ontwikkeling vannefron voorlopercellenin epitheelceltypes. Notch-signalering is een van de meest significant verrijkte GO-termen die zijn geïdentificeerd bij het openen van DAR's, en in nefron-voorlopers is bekend dat deze route Six2-expressie onderdrukt en differentiatie van nefron-voorlopercellen bevordert (Chung et al., 2016). Een van de betrokken genen van deze route is Jag1, een sleutelligand in Notch-signalering waarvan is gemeld dat de expressie omgekeerd gecorreleerd is met de expressie van Six2 en Hes1 (Chung et al., 2016). We merken op dat Jag1 een geannoteerd doelwit is voor drie miRNA's met toenemende expressie (miR34b-5p, miR98-3p en miR200a-3p, figuur 2). Ten slotte observeren we verrijking voor genen geassocieerd met hermodellering van bloedvaten en morfogenese bij het openen van DAR's, hoewel dit een gevolg lijkt te zijn van genen die worden gedeeld tussen deze ontwikkelingsroutes en epitheelceldifferentiatie, waaronder Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 en Hey2.

Veranderingen inchromatine toegankelijkheidtussennefron voorlopercellenzijn gemeten in eerdere onderzoeken (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).

Over het algemeen zijn onze resultaten consistent met deze eerdere onderzoeken, waarbij Notchsignaling en Pax8-gerelateerde genen werden benadrukt. Er zijn echter met name enkele experimentele verschillen in deze eerdere onderzoeken in vergelijking met dit rapport. Isolatie van GFP tot expressie brengende nefronvoorlopers met behulp van een fluorescentie-geactiveerde cel van de Six2-TGC transgene reportermuis wordt mogelijk vertroebeld door de bevinding dat dit allel een gerapporteerde afname van het aantal nefronen heeft van ongeveer 45 procent (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). Bovendien is aangetoond dat gekweekte nefron-voorlopers (gekweekt met een lage of hoge dosis CHIR) verschillende transcriptomen hebben van primaire nefron-voorlopers, wat suggereert dat hun toegankelijkheid voor chromatine ook anders zou zijn (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). Aangezien het doel van onze studie was om te begrijpen hoe veranderingen in het chromatinelandschap de miRNA-expressie beïnvloeden in vroege versus late nefron-voorlopers, was analyse van primaire nefron-voorlopers noodzakelijk.

Cistanche is beter voor de nieren

Door deze waargenomen veranderingen in de chromatine-omgeving te combineren met gematchte veranderingen in miRNA-expressie, betrekken we verschillende nieuwe vermeende miRNA-enhancer-paren bij de stopzetting van nefrogenese voor verder onderzoek. De miRNA's miR-125a-5p en let-7c-5p, bijvoorbeeld, zien een significante toename in expressie tussen E14.5 en P0 , en dit wordt samengevat door de toenemende ontoegankelijkheid van een DAR (chr16:77,719,058 77,720.407) in dezelfde TAD. Deze DAR is ook geassocieerd met een Six2-bindingsplaats (Guo et al., 2021), en kan duiden op een versterker die de expressie van miR-125a-5p en/of let{{18} beïnvloedt. }c-5p, wat op zijn beurt differentiatie zou kunnen bevorderen door onderdrukking van Lin28b. Evenzo nemen we een mogelijke versterker waar voor miR 181a, waarvan bekend is dat het de renine-expressie bij mensen moduleert (Marques et al., 2015) en dat wordt beschouwd als een therapeutisch doelwit om nefrotoxiciteit te verminderen vanwege het vermogen om BIRC6 en apoptose te onderdrukken (Liu et al., 2015). al., 2018). Ten slotte observeren we een afsluitende DAR geassocieerd met miR-9-3p die transcriptiefactorvoetafdrukken heeft voor de Wnt-signaleringsresponsieve eiwitten Snai1 en Snai2.miR-9-3p's omgekeerde complement, miR-9-5p, is bekend om te beschermen tegennierfibrose (Fierro-Fernández et al., 2020), Snai1 en Snai2 hebben aangetoond dat ze carcinoommetastase in huidkankercellen van muizen bevorderen (Olmeda et al., 2008) en epitheliale-naar-mesenchymale overgangen (EMT) bij kankerpatiënten bevorderen (Sundararajan et al., 2019), terwijl bekend is dat miR-9 angiogenese en migratie van tumorendotheelcellen bevordert (Zhuang et al., 2012). Er kan een mechanisme bestaan ​​waarbij verhoogde Wnt-signalering resulteert in verminderde expressie van Snai1 en Snai2, wat op zijn beurt de miR-9-3p-expressie vermindert om de differentiatie van nefron-voorlopercellen te ondersteunen.

Onze studie identificeerde uitvoerig veranderingen in het chromatinelandschap en miRNA-transcriptoom van nefron-voorlopers tijdens de embryonale ontwikkeling, en we hebben kandidaat-cis-regulerende regio's en miRNA geïdentificeerd die mogelijk een rol spelen bij het stoppen van nefrogenese. Verrijkingsanalyses voor zowel mRNA-seq- als ATAC-seq-gegevens bieden verleidelijke aanwijzingen over de mechanismen die mogelijk betrokken zijn, zoals routes die de differentiatie van nefron-voorlopercellen reguleren, waaronder als Notch en TGF-. We rapporteren ook twee nieuwe vermeende regulerende elementen voor Eya1 en Pax8, genen waarvan bekend is dat ze belangrijk zijn innierontwikkeling en mogelijke regulerende sequenties voor belangrijke miRNA die betrokken zijn bij de stopzetting van nefrogenese.

Methoden:

Muizenstammen

Wildtype CD-1 tijdgebonden zwangere vrouwtjes werden verkregen van Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, VS, RRID: MGI:5659424) ennierenwerden verzameld uit nesten op embryonale dag E14.5 of P0. Alle dieren werden gehuisvest in het vivarium van het Rangos Research Center in het UPMC Children's Hospital van Pittsburgh (Pittsburgh, PA, VS) en alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Pittsburgh. Het geslacht voor elk embryo of elk jong werd geïdentificeerd door PCR uit te voeren op genomisch DNA geïsoleerd uit staartknipsels met behulp van de volgende primers voor het Y-chromosoomgen Sry: SryF 5'-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3' en SryR 5'-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA-3', zoals eerder gepubliceerd (McFarlane et al., 2013).

Kleine RNA-sequencing en analyse

Totaal RNA geïsoleerd uit denefron voorlopercellendie overbleven na het verwijderen van de ATAC-seq-celfractie, werd ingediend bij de Health Sciences Sequencing Core van het UPMC Children's Hospital in Pittsburgh voor bibliotheekvoorbereiding met behulp van de QIAseq miRNA-bibliotheekvoorbereidingskit (Qiagen 3315{{10}}2). Single-end sequencing van mRNA-seq-bibliotheken werd uitgevoerd op een Illumina NextSeq500, en bibliotheken werden gesequenced tot een diepte van ongeveer 50 miljoen single-ended reads per bibliotheek. Sequenced reads werden vervolgens uitgelijnd met het mm10-genoom van de muis met behulp van het Rsubread-pakket (Liao et al., 2019) (versie 2.0.1), en geannoteerd naar bekende miRNA vermeld in miRBase (versie 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014) met de featureCounts-functie van het Rsubread-pakket. Differentiële expressie van bekend miRNA werd gemeten met behulp van het DESeq2 R-pakket (versie 1.26.0) (Love et al., 2014). De fractie van uitgelijnde uitlezingen die zijn geannoteerd met bekend miRNA, evenals de fractie vrouwelijke embryo's per monster, werden als cofactoren opgenomen in het testmodel dat werd ingediend bij DESeq2. Differentieel tot expressie gebracht miRNA werd vervolgens geïdentificeerd terwijl de valse ontdekkingssnelheid op 5 procent werd gecontroleerd, en hun richting van verandering (toenemend versus afnemend) werd bepaald op basis van hun vouwveranderingswaarde ("toenemend" duidt op hogere expressie bij P0 vergeleken met E14.5) . Verrijking van regulerende routes onder voorspelde gendoelen van miRNA met aanzienlijk toenemende en afnemende expressie werd berekend met behulp van DIANA-tools miRPath versie 3.0 (Vlachos et al., 2015). Voorspelde doeltranscripten voor miRNA werden opgehaald uit de TargetScan (Agarwal et al., 2015) en miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) repositories.

Nefron progenitor isolatie

nierenwerden ontleed uit nesten van {{0}} E14.5-embryo's of P0-pups, en elk nest werd als één monster beschouwd. Eén nier per monster werd gebruikt voor totale RNA-isolatie om te worden gebruikt als een "hele niercontrole" in daaropvolgende analyses (zie hieronder). Op elk tijdstip werden in totaal drie monsters verzameld. Corticale cellen werden vervolgens uit elk monster geïsoleerd met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) zoals eerder gepubliceerd (Brown et al., 2011). In het kort, nieren ondergingen gedeeltelijke digestie met 2 mM collagenase A (Roche 11088793001) en 3,5 mM pancreatine (Sigma P1625) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 15 minuten bij 37 graden. De digestiereactie werd gestopt met koud 100 procent foetaal runderserum (FBS), en de celsuspensie werd verzameld en opnieuw gesuspendeerd in koude Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) proteaseremmer (Sigma-Aldrich 10837091001). De cellen werden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in een ijskoude isolatiebuffer bestaande uit 2 procent FBS in PBS, vervolgens geïncubeerd met magnetische kralen (Dynabeads FlowComp Flexi-kit, ThermoFisher 11061D) gebiotinyleerd tot antilichamen voor Integrin alfa 8 (Itg 8, R&D Systems AF4076) met behulp van de DSB-X Biotine Protein Labeling Kit (ThermoFisher D-20655). Nephron-voorlopers die aan deze kralen waren gebonden, werden geïsoleerd zoals eerder gepubliceerd (Hemker et al., 2020) en voor elk monster samengevoegd over de nieren. Een aliquot van 50,000 nefron-voorlopercellen werd onmiddellijk verwerkt door dechromatine toegankelijkheidbibliotheekvoorbereidingsprotocol (zie hieronder), en totaal RNA werd geëxtraheerd uit de resterende celsuspensie met behulp van de Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004).

Om verrijking van te bevestigennefron voorlopercellenten opzichte van andere celtypen werd totaal RNA geïsoleerd uit nefron-voorlopers en uit geheelnieren(hele niercontrole, zie hierboven), en kwantitatieve reverse-transcriptie PCR (qRT-PCR) voor de volgende markers werd uitgevoerd: nefron-voorlopercellen Six2 en Cited1 (L. Huang et al., 2016), en voor Lhx1, Pdgfr, Pecan en Caleb die nierblaasjes markeren (Brunskill et al., 2014), nierstroma (S. Chen et al., 2015), endotheel (Kobayashi et al., 2008) en ureterknop (Cebrian et al., 2014a ) cellen, respectievelijk; zie ook aanvullende figuur 1. Gapdh (Barber et al., 2005) werd gebruikt als een huishoudgen en relatieve kwantificering werd berekend via de 2-ΔΔCt-methode (Livak & Schmittgen, 2001). Primers voor deze transcripten zijn opgenomen in Tabel 2.

Tabel 2. RT-PCR-primers.

Toegankelijkheid van chromatinebibliotheekvoorbereiding

Ongeveer 50,000nefron voorlopercellenwerden gebruikt om elke sequencing-bibliotheek voor ATAC-seq te genereren met behulp van de Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) met modificaties volgens een eerder gepubliceerde methode (Buenrostro et al., 2013). In het kort werden cellen gesuspendeerd in een ijskoude niet-ionische lysisbuffer bestaande uit 10 mM Tris, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM PMSF-proteaseremmer en 0,05 procent Triton X -100 per volume gedurende 10 minuten om de cel te lyseren membranen terwijl de kernmembranen intact blijven. Intacte nefron-voorloperkernen werden opnieuw gesuspendeerd in transpositiebuffer die het transposase-enzym bevatte en gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Vrij genomisch DNA dat vrijkomt bij het transpositieproces werd gezuiverd met behulp van de MinElute PCR Purification-kit (Qiagen 28004) en vervolgens geïndexeerd met behulp van forward (i7) en reverse (i5) indexprimers van de Nextera Index Kit (Illumina FC-121-1011). Indexligatie en fragmentamplificatie werden bereikt met behulp van het thermische cyclusprogramma voor PCR-amplificatie van de methode.

Om het optimale aantal amplificatiecycli te bepalen dat nodig is voor de ATAC-seq-bibliotheek, werd een qPCR-nevenreactie uitgevoerd met SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) en een 96-well C100 Thermal Cycler (Bio-Rad) om de genormaliseerde reporterwaarde (Rn) voor elke cyclus. Het aantal cyclussen waarbij de reactie een derde van zijn maximale fluorescentie bereikte, werd geïdentificeerd als het optimale aantal resterende amplificatiecycli, en het resterende volume van de geïndexeerde ATAC-seq-transpositiereactie werd onderworpen aan dat aantal extra cycli in de uiteindelijke amplificatie programma. De uiteindelijke bibliotheken werden gezuiverd met behulp van Ampure XP magnetische kralen (Beckman Coulter A63881).

Toegankelijkheid van chromatinevolgorde aanbrengen in

Sequentiebepaling aan het einde van de ATAC-seq-bibliotheek werd uitgevoerd op een Illumina NextSeq500 door de Health Sciences Sequencing Core in het UPMC Children's Hospital van Pittsburgh, gemultiplext met bibliotheekconcentraties die naar verwachting 90 miljoen gepaarde-end-uitlezingen per monster zullen opleveren . De kwaliteit van het lezen werd bijgesneden met TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (versie 0.4.3) in "--gekoppelde" modus en met anders standaardinstellingen. Lezingen werden uitgelijnd met het mm10-genoom (Church et al., 2011) met behulp van Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (versie 2.3.1) met de instellingen "--local -q -X 2000 -- m". Lezingen die het resultaat waren van PCR-duplicaten van hetzelfde DNA-fragment werden gemarkeerd met behulp van de MarkDuplicates-functie van Picard Tools (Broad Institute, 2016) (versie 2.10.9) met standaardinstellingen. Reads die dubbelzinnig werden toegewezen aan meer dan één locatie in het genoom, werden willekeurig toegewezen aan een van deze locaties als er minder dan vier mogelijkheden waren, en werden anders geëlimineerd (ENCODE, nd) (met behulp van een Python-script dat beschikbaar is op https://github. com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) met de instellingen "--paired-end -k"). Samtools (H. Li et al., 2009) (versie 1.3.1) werd gebruikt voor het uitfilteren van dubbele, niet-toegewezen, verweesde en mitochondriale uitlezingen, evenals voor het sorteren en indexeren van BAM-bestanden. Kwaliteitscontrole van ATAC-seq-gegevens volgde de ATAC-seq-richtlijnen van het ENCODE-project (ENCODE, nd), en voorbeeldbibliotheken werden willekeurig gedownsampled om elk 31 miljoen gepaarde leesbewerkingen te bevatten om te normaliseren voor verschillen in bibliotheekgroottes.

Cistanche kan nierinfectie voorkomen

Toegankelijke chromatinegebieden identificeren

BAM-bestanden met gefilterde ATAC-seq-lezingen werden geconverteerd naar gepaarde-end BED-indeling met behulp van Bedtools' (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (versie 2.26.0) 'gebombardeerd ' functie met instellingen "- bed pe -mate1". Regio's van toegankelijk chromatine werden geïdentificeerd met behulp van de Model-based Analysis of ChIP-seq-tool (MACS2, versie 2.1.1.20160309) broad peak-calling-algoritme (Zhang et al., 2008), met instellingen "--format BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --breed --shift 37 --tekstgrootte 75 --houd alle --modellen bij". Om toegankelijke regio's met een hoge betrouwbaarheid te identificeren, werden paarsgewijze vergelijkingen (van elke combinatie van replica's van een bepaald tijdstip) uitgevoerd en werd de niet-reproduceerbare ontdekkingssnelheid (IDR) (Q. Li et al., 2011) berekend met behulp van een openbaar beschikbare Python-implementatie (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) met instellingen "--input-file-type broad peak --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-drempel 0.1 --output-file-type bed". In het bijzonder werd voor elk tijdstip een aaneengeschakeld BED-bestand van alle toegankelijke regio's ingediend via het argument "--pieklijst" voor elke vergelijking (bijvoorbeeld bij het vergelijken van twee E14.5-monsters, alle E14.5 brede pieken tussen alle drie replica's worden gebruikt). Toegankelijkheidsregio's die consistent waren volgens IDR in ten minste twee paarsgewijze replicaatvergelijkingen (met een overlap van minimaal 20 procent) werden gecombineerd tot een uniforme set van zeer betrouwbare toegankelijke regio's ("IDR-regio's").

Veranderingen in toegankelijke chromatinegebieden

De toegankelijkheid van elk IDR-gebied binnen een bepaald monster werd gekwantificeerd door het aantal transpositiegebeurtenissen te tellen die optreden tijdens het normaliseren voor sequentie-GC-inhoud over monsters. Dit werd bereikt met behulp van een aangepast script (beschikbaar in de bijbehorende softwarerepository, zie aanvullende gegevens). Veranderingen in deze toegankelijkheid werden vervolgens bepaald door deze waarden op verschillende tijdstippen te vergelijken met behulp van het Limma-voom (versie 3.42.2) softwarepakket (Ritchie et al., 2006). Om rekening te houden met embryogeslacht, werd de fractie vrouwelijke embryo's in elk monster opgenomen als een cofactor in lineaire modellen die werden gebruikt voor differentiële toegankelijkheidsanalyse, en het werd verwijderd als een batch-effect in visualisaties met behulp van de verwijder batch-effectfunctie van het Limma-pakket. Differentieel toegankelijke regio's van chromatine (DAR's) werden geacht significant te openen (verhoogde toegankelijkheid tussen E14.5 en P0) of te sluiten (verminderde toegankelijkheid tussen E14.5 en P0) bij het controleren van het percentage valse ontdekkingen op 10 procent . Functionele verrijkingsanalyses van het openen en sluiten van genomische regio's werden bepaald door respectieve coördinaten in te dienen bij de Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT, beschikbaar op http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010 ). Annotaties van bekende en voorspelde versterkers werden opgehaald uit de FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel et al., 2007) en EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020) repositories.

Transcriptiefactorvoetafdrukken

Footprints van transcriptiefactoren werden geïdentificeerd door alle BAM-bestanden van hetzelfde tijdstip te bundelen en vervolgens de Hmm-based Identification of TF Footprints (HINT)-software van de Regulatory Genomics Toolbox (versie 0.12.3) uit te voeren, met name het footprinting-model voor ATAC -seq-gegevens (beschikbaar op www.regulatory-genomics.org ) (Z. Li et al., 2018). Deze software is uitgevoerd met de instellingen "right-hint footprinting --organism=mm10 --at-seq --paired-end". Voetafdrukken werden vervolgens geannoteerd met bekende muisbindingsmotieven uit de HOCOMOCO 11-database (Kulakovskiy et al., 2018) met behulp van HINT's functie voor het matchen van motieven met de instellingen "right-motif analysis matching --organism=}mm10". Voetafdrukken met HINT-scores onder de 10 werden uitgesloten. Ten slotte werden differentiële activiteitspatronen tussen motief-gematchte voetafdrukken gemeten met behulp van de differentiële functie van het RGT-HINT-programma, met instellingen "right-hint differential --organism=mm10 --bc {{27} }NC 12 --uitvoerprofielen". Aanzienlijk veranderende activiteitsniveaus werden geïdentificeerd op basis van een p-waarde cutoff van 0,05 (Friedman-Nemeny-methode).

Cistanche kan de nierfunctie verbeteren

Nucleosomale configuratie

Uitgelijnde uitlezingen van hetzelfde tijdstip werden samengevoegd in een enkel BAM-bestand en het NucleoATAC-pakket (versie 0.3.4) werd gebruikt om patronen in leeslengtes te identificeren die wijzen op zowel gebonden nucleosomale dyaden als nucleosoomvrije regio's ( NFR's) (Schep et al., 2015). Deze software is uitgevoerd met standaardinstellingen. Nucleosomen werden geannoteerd als het gebied van 146 bp gecentreerd rond elk genoemd nucleosoom-dyade.

Eencellige RNA-expressie

Eencellige genexpressiegegevens werden verwerkt voor een eerder manuscript (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020) en werden opgehaald uit de Gene Expression Omnibus (GEOID GSE158166). Verwerkte gegevens die zijn opgenomen in aanvullende figuur 7 omvatten celtypen, genexpressieniveaus, laagdimensionale (tSNE) inbeddingen en pseudotijd-annotaties met betrekking tot het traject dat is vastgesteld tussen clusters van prolifererende en differentiërende nefron-voorlopers. Gegevens werden geopend en georganiseerd met behulp van het SingleCellExperiment R-pakket (Lun & Risso, 2019).

miRNA-mRNA-interacties bij veroudering en differentiatie van nefron-voorlopercellen

Genen met veranderende expressie tussen zelfvernieuwing, primed en differentiërendnefron voorlopercellenwerden verkregen uit aanvullende tabellen 3 en 4 gepubliceerd door Bais et al.. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Sequentiebepaling van chromatine-immunoprecipitatie in primaire nefron-voorlopers

Gegevens over chromatine-immunoprecipitatie-sequencing (ChIP-seq) voor binding van -catenine, Lef1, Six2 en Tcf7 in primaire nefron-voorlopers werden opgehaald uit BedGraph-bestanden in de GEO-repository (GSE131119) voor Guo et al., 2021. Verrijkingssignaalwaarden voor vouwen werden gemiddeld over herhaalde monsters.

Screening op regulerende elementen die de miRNA-expressie beïnvloeden

Om te screenen op potentiële versterkers van miRNA, hebben we miRNA en DAR's geannoteerd met de topologisch geassocieerde domeinen (TAD's) waarin ze zich bevinden op basis van mm10-annotaties van embryonale stamcellen van muizen, gedownload van de 3D Genome Browser (beschikbaar op http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). Regio's vanchromatine toegankelijkheiden miRNA werden beschouwd als kandidaat-versterkers - miRNA-paren als ze dezelfde TAD bezetten en consistente veranderingen in toegankelijkheid en expressie vertoonden (toenemende toegankelijkheid met toenemende miRNA-expressie en vice versa). DAR's werden alleen als mogelijke "regulerende kenmerken" beschouwd als ze geen bekende promotor of exon-uiteinde overlapten. Potentiële paren miRNA en vermeende regulerende elementen kregen prioriteit als ze 1) binnen dezelfde TAD vielen en 2) significante veranderingen ondervonden tussen E14.5 en P0 (verhogen van miRNA-expressie en toenemende toegankelijkheid van de IDR-regio, en vice versa) .

Dankbetuigingen

Shelby Hemker en Abha Bais droegen bij aan experimenteel ontwerp. Sequencing voor ATAC-seq en mRNA-seq werd uitgevoerd door de Health Sciences Sequencing Core in het UPMC Children's Hospital in Pittsburgh.

Concurrerende belangen

Geen concurrerende belangen aangegeven

Financiering

AC werd ondersteund door subsidies van het National Institute of Diabetes and Digestive enNierZiekten onder het National Institute of Health (T32DK061296-17). DK werd ondersteund door subsidies van het National Institute of General Medical Sciences onder het National Institute of Health (R01GM115836). JH werd ondersteund door subsidies van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases onder het National Institute of Health (R01DK103776 en 125015). DMC werd ondersteund door een Nephrotic Syndrome Study Network (NEPTUNE) Career Development Award en Children's Hospital of Pittsburgh Research Advisory Council Postdoctoral Fellowship. YP werd ondersteund door subsidies van het UPMC Children's Hospital van Pittsburgh en het North American Mitochondrial Disease Consortium.

Beschikbaarheid van data

Voorspelde muisversterkers zijn opgehaald uit FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; bestand hier beschikbaar), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; bestand hier beschikbaar) en EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980; muisbestanden hier beschikbaar) databanken. Het mm10-genoom van de muis en zijn annotaties zijn gedownload via het Illumina genomes-project (hier beschikbaar). Het over-chain-bestand voor het optillen van mm9-coördinaten naar mm10 is opgehaald uit de UCSC-genoombrowser (DOI: 10.1101/gr.229102; bestand hier beschikbaar). TAD-annotaties van embryonale stamcellen van muizen werden opgehaald uit de 3D Genome Browser (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; bestand hier beschikbaar). Voorspelde miRNA-transcriptdoelen werden opgehaald uit TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, bestand hier beschikbaar) en uit miRDB-versie 6 (DOI: 10.1093/var/gkz757, bestand hier beschikbaar). ATAC-seq-gegevens inclusief IDR/DAR-locaties, annotaties en differentiële verrijkingsresultaten zijn beschikbaar op GEO (GSE168339), evenals mRNA-seq-gegevens inclusief annotaties en differentiële expressieresultaten (GSE168342). Computercode die wordt gebruikt om gegevens te verwerken en te analyseren en om cijfers te genereren, is beschikbaar op https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

Bibliografie

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A., & Cippitelli, M (2019). De homeobox-transcriptiefactor MEIS2 is een regulator van de overleving van kankercellen en IMiD's-activiteit bij multipel myeloom: modulatie door bromodomain en extra-terminale (BET) eiwitremmers. Celdood en ziekte, 10 (4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW, & Bartel, DP (2015). Het voorspellen van effectieve microRNA-doellocaties in mRNA's van zoogdieren. E-leven. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Een atlas van actieve versterkers voor menselijke celtypen en weefsels. Natuur, 507(7493), 455-461. https://doi.org/10.1038/nature12787

BabrahamLab. (2014). Trim in overvloed. In bio-informatica. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J., & Kostka, D. (2020). Eencellige RNA-sequencing onthult differentiële celcyclusactiviteit in sleutelcelpopulaties tijdens nefrogenese. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA, & Clark, BJ (2005). GAPDH als huishoudgen: analyse van GAPDH-mRNA-expressie in een panel van 72 menselijke weefsels. Fysiologische genomica. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). MicroRNA-doelherkenning en regulerende functies. Cel, 136 (2), 215-233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD, & Hoy, WE (2011). Menselijk nefronnummer: implicaties voor gezondheid en ziekte. Pediatrische nefrologie, 26 (9), 1529-1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ, & Li, Q. (2015). Onreproduceerbare ontdekkingssnelheid (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A., & Busslinger, M. (2002). Nephric-afstammingsspecificatie door Pax2 en Pax8. Genen en ontwikkeling. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

Van: Journal Pre-proof

2021 Gepubliceerd door Elsevier Inc.