Circulerende MiRNA's bij type 2 diabetespatiënten met en zonder albuminurie in Maleisië

AbstractInvoering: Diabetische nierziekte(DKD) blijft de belangrijkste oorzaak van chronische nierziekte. Er is ontregeling van circulerende miRNA's gemeld, wat hun pathologische rol bij DKD suggereert. Deze studie had tot doel differentieel tot expressie gebrachte miRNA's te onderzoeken in de sera van type 2 diabetes mellitus (T2DM) patiënten met en zonder albuminurie in een geselecteerde Maleisische populatie.Methode:Eenenveertig T2DM-patiënten die in een gemeenschapskliniek werden gevolgd, werden verdeeld in normale (NA), micro- (MIC) en macroalbuminurie (MAC) groepen. Differentiële niveaus van miRNA's in 12 monsters werden bepaald met behulp van de padgerichte (menselijke fibrose) miScript miRNA qPCR-array en werden gevalideerd in 33 monsters met behulp van de miScript aangepaste qPCR-array (CMIHS02742) (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland).Resultaten:Trends van opregulatie van 3 miRNA's in het serum, namelijk miR-874-3p, miR-101-3p en miR-145-5p van T2DM-patiënten met MAC vergeleken met die met NA. Statistisch significante opregulatie van miR- 874-3p (p= 0.04) en miR-101-3p (p= 0.01) werd gezien in het validatiecohort. Significante negatieve correlaties tussen de geschatte glomerulaire filtratiesnelheid (eGFR) en miR-874-3p (p= 0.05), miR-101-3p (p= 0.03), en miR-145-5p (p= 0.05) en een positieve correlatie tussen miR-874-3p en leeftijd (p= 0.03) werden aangetoond door de correlatiecoëfficiëntanalyse van Pearson.Conclusie:In dit onderzoek werd opregulatie van eerder bekend miRNA, namelijk miR-145-5p, en mogelijk nieuwe, namelijk miR-874-3p en miR-101-3p in het serum van T2DM-patiënten gevonden. . Er was een significante correlatie tussen de eGFR en deze miRNA's. De bevindingen van deze studie hebben bemoedigend bewijs opgeleverd om de vermeende rol van deze differentieel tot expressie gebrachte miRNA's verder te onderzoekenDKD.

Klik om herba te gebruiken voor nierziekten

Invoering

Diabetische nierziekte (DKD) is verantwoordelijk voor 39% van de gevallen van nierziekte in het eindstadium in de VS [1]. Op dezelfde manier blijft DKD de belangrijkste oorzaak van chronische nierziekte (CKD) in Maleisië, wat bijdraagt ​​aan 69% van de nieuwe dialysepatiënten in 2018 [2]. Aangenomen wordt dat de pathologie van DKD voornamelijk wordt veroorzaakt door hyperglykemie, resulterend in de activering van intracellulaire signaalroutes en uiteindelijk nierfibrose [3]. Ondanks de vooruitgang in de behandeling slagen de huidige biomarkers en therapieën er niet in om de progressie ervan naar terminale nierziekte te voorkomen [3]. Daarom is een beter begrip van de bemiddelaars en mechanismen van DKD dringend nodig.

Microribonucleïnezuur (miRNA) is een familie van klein, niet-coderend RNA dat naar voren is gekomen als belangrijke post-transcriptionele regulatoren van genexpressie [4]. Er zijn afwijkende expressie van miRNAs en hun betrokkenheid bij het cellulaire mechanisme van DKD waargenomen [3]. Deze studie had tot doel het expressiepatroon van geselecteerde miRNA's in de sera van type 2 diabetes mellitus (T2DM) patiënten met en zonder albuminurie te identificeren. Wereldwijd zijn soortgelijke onderzoeken uitgevoerd bij verschillende populaties, zoals eerder besproken [5–7]. Ons doel was om het patroon van differentiële expressie te onderzoeken van een selectie van miRNA's die geassocieerd zijn met fibrotische routes bij T2DM-patiënten, waarvan sommige eerder zijn onderzocht bij DKD. Eerdere studies hebben etnisch-gerelateerde verschillen in miRNA-expressie gesuggereerd [8, 9]. Daarom kan deze studie, naast de mogelijkheid om eerdere bevindingen te bevestigen, mogelijk nieuwe miRNA's aan het licht brengen, die misschien uniek tot uiting komen in de Maleisische bevolking.

Materialen en methodes

Bestudeer populatie

Bij deze cross-sectionele studie waren 41 bestaande T2DM-patiënten betrokken die van januari tot april 2019 werden opgevolgd in een gemeenschapskliniek. Deze studie omvatte een 2-stapsprocedure: (1) miRNA's in de sera van 12 patiënten (screeningcohort ) werden geprofileerd en (2) de meest relevante miRNA's werden gevalideerd met de sera van 33 patiënten (het validatiecohort genoemd). Dit omvatte 4 patiënten uit het screeningcohort. Er werd schriftelijke toestemming verkregen van individuele patiënten. Ethische goedkeuring voor dit onderzoek werd verkregen van de Medical Research and Ethics Committee (METC), Ministerie van Volksgezondheid Maleisië. Inclusiecriteria waren T2DM-patiënten en beschikbare klinische en laboratoriuminformatie. Patiënten met type 1 DM; niet-DKD's; comorbiditeiten zoals kanker, acute koortsziekte of recente infecties; zwangerschap; en postpartum werden uitgesloten.

Informatie over het volgende werd uit de medische dossiers van de patiënt gehaald: (1) demografische gegevens, waaronder leeftijd en geslacht; (2) klinische gegevens zoals bloeddruk, gewicht, duur van T2DM, behandeling en andere diabetescomplicaties; (3) laboratoriumgegevens waaronder nuchtere plasmaglucose, geglyceerd hemoglobine A1c (HbA1c), albumine-tot-creatinine-ratio en serumcreatinine. Patiënten werden in 3 groepen verdeeld op basis van hun albuminurieniveaus, normoalbuminurie (NA), microalbuminurie (MIC) en macroalbuminurie (MAC).

Definitie

In dit onderzoek,

NA, MIC en MAC werden gedefinieerd als een albumine-tot-creatinine-verhouding van<30, between 30 and 300 and >300 mg/g creatinine respectievelijk in ten minste 2 van de 3 spot-urinecollecties [10]. De geschatte glomerulaire filtratiesnelheid (eGFR) werd berekend op basis van de creatininevergelijking van Chronic Kidney Disease-Epidemiology.

Serumvoorbereiding

Vacutainer Verzamelde monsters van nuchter (minder dan of gelijk aan 8 uur) volbloed in 10- ml BD ®SSTTM-buizen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, VS) werden gedurende 30- minuten bij kamertemperatuur bewaard stollen vóór 10- min centrifugeren bij 1,900 g. De bovenste fase werd geoogst, gefilterd met een Minisart®PES-filter van 0,22- μm (Sartorius, Göttingen, Duitsland) en in microcentrifugebuizen verdeeld voor opslag bij -80 graden tot analyse.

Totaal miRNA

Isolatie Totaal miRNA werd geïsoleerd met behulp van de miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen GmbH) volgens het protocol van de fabrikant. Kort gezegd werd het Qiazol-lysereagens toegevoegd aan een hoeveelheid van 200 μl serum voor denaturatie, gevolgd door miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control C. elegans miR-39 miRNA mimic (Qiagen GmbH) om het RNA-herstel te monitoren en om te keren transcriptie-efficiëntie. Chloroform werd toegevoegd voor fasescheiding, gevolgd door toevoeging van 100% ethanol aan de bovenste waterfase. Spoelstappen werden uitgevoerd met Buffer RWT, Buffer RPE en 80% ethanol. RNA werd geëlueerd door 14 μl RNase-vrij water toe te voegen aan het RNeasy MinElute spinkolommembraan. De hoeveelheid en kwaliteit van RNA werden bepaald met een NanoDrop 1000 spectrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, VS), vóór opslag bij -80 graden tot gebruik. Omgekeerde transcriptie (RT) van miRNA naar cDNA en vooramplificatie werden uitgevoerd met respectievelijk de miScript RTII-kit (Qiagen GmbH) en miScript PreAMP PCR Kit (Qiagen GmbH), volgens het protocol van de fabrikant, met behulp van 6 μl sjabloon-RNA en 5 μl verdunde cDNA, respectievelijk

Kwantitatieve realtime polymerasekettingreactieanalyse

Circulerende miRNA's in het serum van het screeningcohort werden geïdentificeerd door de padgerichte (menselijke fibrose) miScript miRNA qPCR-array (Qiagen GmbH), en geselecteerde miRNA's werden later gevalideerd in het validatiecohort met een aangepaste miScript miRNA qPCR-array (CMIHS02742) ( Qiagen GmbH) volgens de instructies van de fabrikant. Elke reactie omvatte een cDNA-sjabloon, 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay en RNase-vrij water, en verdund sjabloon-cDNA om een ​​totaal volume van 25 μl te verkrijgen. Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd op Eppendorf Mastercycler ep realplex 4, die als volgt was geprogrammeerd: 15 minuten bij 95 graden, 15 seconden bij 94 graden, 30 seconden bij 55 graden en 30 seconden bij 70 graden met 40 cycli.

Relatieve kwantificering van miRNA

Realtime PCR-gegevensanalyse werd uitgevoerd met behulp van Qiagen Gene Globe Data Analysis Center-software (//geneglobe.qiagen.com/analyze/). Relatieve expressie (RE) werd afgeleid door de 2−∆Ct-methode, waarbij de expressie van elk miRNA werd genormaliseerd naar die van het huishoudgen SNORD95 of Global Ct Mean. De vouwverandering werd berekend op basis van de genormaliseerde miRNA-expressie in elke groep (MIC of MAC) gedeeld door de genormaliseerde miRNA-expressie in de controlegroep (NA). p-waarden werden berekend op basis van een t-test van onafhankelijke monsters van de replicaat RE (2−∆Ct)-waarden voor elk gen in de controlegroep en testgroepen. Verdere verificatie van de qPCR-gegevensanalyse werd handmatig uitgevoerd met behulp van Microsoft Excel en IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp, Ar Monk, NY, VS) release 25 voor Microsoft Windows-software.

Selectie van miRNA's in het screeningcohort voor validatie

Initially, the relative quantification of miRNAs in the screening cohort was based on the global Ct mean normalization method, and Ct >30 werd beschouwd als een negatieve uitdrukking, zoals aanbevolen door het Qiagen GeneGlobe Data Analysis Center (https://geneglobe.qiagen.com/analyze/). Online aanvullende tabel 1 (voor al het online aanvullend materiaal, zie www.karger.com/doi/10.1159/000518866) toont een RE van 84 miRNA's in het screeningcohort genormaliseerd naar het mondiale Ct-gemiddelde. MiRNA's met significante ±2.0-voudige veranderingen en van goede kwaliteit werden gekozen voor validatie, zoals gedefinieerd door de software. Bovendien werden andere miRNA's gekozen op basis van de rangschikking van hun p-waarden en hun betrokkenheid bij eerdere onderzoeken naar DKD en DKD-gerelateerde routes, waarbij miRNA's met het hoogste aantal vermeende messenger-RNA-doelen werden gekozen. Online aanvullende tabel 2 toont de aanvullende criteria die zijn gebruikt voor de selectie van miRNA's voor validatie. In validatieanalyse werd miRNA-expressie genormaliseerd naar SNORD95 omdat de globale Ct-gemiddelde methode niet geschikt was en Ct> 35 als een negatieve expressie werd beschouwd. Om te standaardiseren hebben we de RE van het geselecteerde miRNA in het screeningcohort opnieuw geanalyseerd op basis van SNORD95-normalisatie, en dit werd gebruikt voor daaropvolgende analyse in vergelijking met het validatiecohort.

Statistische analyse

Normality check of continuous variables was done using both statistical tests (Shapiro-Wilk, Kolmogrov-Smimov, skewness, and kurtosis) and visual inspection of plots (histogram, normal Q-Q, and detrended normal Q-Q). Continuous data were presented as either mean ± standard deviation or median (interquartile range). A comparison of 2 independent groups was done using an independent samples t-test (Tables 2–4). Comparison of >Er werden twee onafhankelijke groepen uitgevoerd met behulp van de Kruskal-Wallis-test met onafhankelijke monsters (tabel 1). Vergelijking van categorische variabelen werd gedaan met behulp van de χ2-test van onvoorziene gebeurtenissen of de exacte test van Fisher (Tabel 1). De correlatie tussen geselecteerde miRNA RE en continue variabelen (demografische en klinische gegevens) werd gedaan met behulp van de correlatiecoëfficiënt van Pearson. Er werd een meervoudige regressietest gebruikt om de lineaire relatie tussen geselecteerde miRNA RE en de significante voorspellers ervan te analyseren. Statistische berekeningen werden uitgevoerd met behulp van IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp) release 25 voor Microsoft Windows en het statistische softwareprogrammapakket Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA, VS). De statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0.05.

Ondersteunende service van Wecistanche, de grootste cistanche-exporteur in China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Winkel voor meer specificaties:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KRIJG NATUURLIJK BIOLOGISCH CISTANCHE-EXTRACT MET 25% ECHINACOSIDE EN 9% ACTEOSIDE VOOR NIIERINFECTIE