Cistanche Deserticola-polysaccharide verzwakt osteoclastogenese en botresorptie via remming van RANKL-signalering en productie van reactieve zuurstofsoorten

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et al

Osteoporose is een stofwisselingsziekte die wordt gekenmerkt door osteopenie en microstructurele verslechtering van de botten. Osteoclasten zijn de primaire effectorcellen die botmatrix afbreken en hun abnormale functie leidt tot de ontwikkeling van osteoporose. Ophoping van reactieve zuurstofsoorten (ROS) tijdens cellulair metabolisme bevordert de proliferatie en differentiatie van osteoclasten en speelt daarom een ​​belangrijke rol bij osteoporose.Cistanchedeserticolapolysacharide(CDP) heeft een antitumor-, ontstekingsremmende en antioxiderende werking. De impact van CDP op osteoclasten is echter onduidelijk. In deze studie werden tartraat-resistente zuurfosfatase-kleuring, immunofluorescentie, reverse transcriptie-polymerase kettingreactie en western blot-analyse gebruikt om aan te tonen dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)remde osteoclastogenese en hydroxyapatietresorptie. Bovendien, CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)remde ook de expressie van osteoclastmarkergenen, waaronder Ctsk, Mmp9 en Acp5, en had geen effect op receptoractivator van nucleaire factor κB (RANK) -expressie. Mechanistische analyses onthulden dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)verhoogt de expressie van antioxidante enzymen om RANKL-gemedieerde ROS-productie in osteoclasten te verzwakken en remt de nucleaire factor van geactiveerde T-cellen en mitogeen-geactiveerde proteïnekinase-activering. Deze resultaten suggereren dat CDP een kandidaat-geneesmiddel kan zijn voor de behandeling van osteoporose veroorzaakt door overmatige osteoclastactiviteit.

SLEUTELWOORDENbotresorptie,Cistanchedeserticolapolysacharide, MAPK, osteoclast, reactieve zuurstofspecies

cistanche bodybuilding

1|INVOERING

De balans tussen botvorming, gemedieerd door osteoblasten, en botresorptie, gemedieerd door osteoclasten, speelt een cruciale rol bij het handhaven van botmetabole homeostase (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Wanneer botresorptie de botvorming overschrijdt, treedt osteoporose op, die wordt gekenmerkt door verminderde botmassa en botmicrostructurele schade (Ikeda, 2008). Osteoporose is een veel voorkomende ziekte bij oudere personen en postmenopauzale vrouwen en de pathogenese ervan is niet volledig opgehelderd (Cooper & Melton, 1992). Oestrogeentekort is een primaire oorzaak van osteoporose (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Bovendien kunnen reactieve zuurstofspecies (ROS) worden geïnduceerd door receptoractivator van nucleaire factor B-ligand (RANKL) en worden ze geassocieerd met osteoclastvorming (Yip et al., 2005), en kunnen ze dus bijdragen aan de ontwikkeling van osteoporose (Manolagas, 2010). Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat Nrf2-antioxidantdeficiëntie de ROS-niveaus verhoogt en RANKL-geïnduceerde osteoclastdifferentiatie bevordert (Hyeon, Lee, Yang en Jeong, 2013). Daarom moet het verminderen van de ROS-productie tijdens osteoclastdifferentiatie worden geëvalueerd als een therapeutische strategie voor de behandeling van osteoporose.

Osteoclasten zijn afgeleid van de hematopoëtische lijn van monocyten of macrofagen en zijn de enige meerkernige cellen die botresorptie uitvoeren (Teitelbaum, 2000). Daarom is onderzoek naar de vorming van osteoclasten van groot belang bij het ontwikkelen van effectieve behandelingen voor ziekten van het botmetabolisme (Lorenzo, 2017). Macrofaag koloniestimulerende factor (M‐CSF) en RANKL, geproduceerd door osteoblasten en geactiveerde T-cellen, zijn belangrijke cytokinen die osteoclastogenese reguleren (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL induceert de expressie van nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (NFATc1), wat een kritische transcriptiefactor is die actief is tijdens osteoclastvorming (Ishida et al., 2002). Geactiveerd NFATc1 bevordert de expressie van osteoclastmarkergenen zoals tartraatresistente zure fosfatase (TRAcP) en cathepsine K (CTSK) die osteoclastogenese en osteoclastfunctie reguleren (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolysacharide(CDP) wordt geïsoleerd uit de vlezige stengels vanCistancheen bezit immuunregulatie, antitumor-, anti-aging en andere farmacologische effecten (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)had een remmend effect op door lipopolysaccharide geïnduceerde stikstofmonoxide (NO) -productie in microgliale cellen van muizen (BV‐2-cellen; Nan et al., 2013). Daarnaast bevat een fenylethanoïderijk extract (ECD) vanCistancheverbeterde het zwemvermogen van muizen door spierbeschadiging te verminderen, de accumulatie van melkzuur te vertragen en de energieopslag te verbeteren (Cai et al., 2010). De effecten van CDP op de functie en activiteit van osteoclasten blijven echter onbekend.

In deze studie hebben we aangetoond dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)remt door RANKL geïnduceerde differentiatie van osteoclasten en botresorptie. Het onderliggende mechanisme was dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)verbetert de expressie van antioxidante enzymen om de ROS-productie te verzwakken, en onderdrukt vervolgens RANKL-geactiveerde NFAT- en mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK)-signaalcascades. Deze resultaten suggereren dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)kan worden gebruikt voor de behandeling van osteoporose veroorzaakt door overmatige osteoclastische botresorptie.

maca ginseng cistanche

2|MATERIALEN EN METHODES

2.1|Materialen

CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)(zuiverheid> 98 procent) werd gekocht bij Solarbio (Beijing, China) en bereid in een voorraadconcentratie van 1 mM in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Antilichamen zijn specifiek voor c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, gefosforyleerd (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK en ‐actine werden verkregen van Santa Cruz Biotechnologie (San Jose, CA). Antilichamen tegen V‐ATPase d2 werden geproduceerd zoals eerder beschreven (H. Feng et al., 2009). Het 3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐5‐ (3‐carboxymethoxyfenyl)‐2‐(4‐sulfofenyl)‐2H‐tetrazolium (MTS) en luciferase-assaysysteem werden verkregen van Promega (Sydney, Australië) . Recombinant M‐CSF werd gekocht bij R&D Systems (Minneapolis, MN). Recombinant GST‐rRANKL-eiwit werd tot expressie gebracht en gezuiverd zoals eerder beschreven (Xu et al., 2000).

2.2|Cel cultuur

RAW264.7-cellen (muizenmacrofaagcellen) werden verkregen van American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) en gekweekt in ‐gemodificeerd minimaal essentieel medium (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australië) aangevuld met 10 procent foetaal runderserum, 2 mM van L-glutamine, 100 E/ml penicilline en 100 ug/ml streptomycine (compleet medium). Van beenmerg afgeleide monocyten (BMM's) werden geïsoleerd uit 6 weken oude C57BL/6J-muizen, die werden geëuthanaseerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de University of Western Australia (RA/3/100/1244). Lange botten werden vrijgemaakt van zachte weefsels en het beenmerg werd gespoeld uit het dijbeen en scheenbeen, dat vervolgens werd gekweekt in een compleet medium in aanwezigheid van M‐CSF (50 ng/ml).

2.3|Osteolastogenese-assay

BMM's werden uitgeplaat in kweekplaten met 96 putjes met een dichtheid van 6 x 103 cellen per putje en behandeld met een compleet medium dat M‐CSF (50 ng/ml) en GST‐rRANKL (100 ng/ml) bevat, in aanwezigheid of afwezigheid van variërende concentraties van CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>drie kernen) werden geïdentificeerd als osteoclasten.

2.4|Cytotoxiciteitstesten

BMM's werden gezaaid in platen met 96 putjes met 6 x 103 cellen per putje en lieten ze een nacht staan ​​om te hechten. De volgende dag werden de cellen geïncubeerd met verschillende concentraties CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide). Na nog eens 48 uur werd de MTS-oplossing (20 µl/putje) toegevoegd en 2 uur met cellen geïncubeerd. De absorptie bij 490 nm werd bepaald met een microplaatlezer (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Immunofluorescentiekleuring

BMM's werden 's nachts gezaaid met een dichtheid van 6 x 103 cellen per putje in aanwezigheid van M‐CSF (50 ng / ml). Cellen werden vervolgens gestimuleerd met M‐CSF en GST‐rRANKL (100 ng/ml) totdat rijpe osteoclasten werden gevormd. De osteoclasten werden vervolgens behandeld met verschillende concentraties CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)gedurende 48 uur alvorens te fixeren met 4 procent paraformaldehyde, permeabel te maken met 0,1 procent Triton X‐100-PBS en te blokkeren met 3 procent runderserumalbumine in PBS. Bereide cellen werden gedurende 45 minuten in het donker geïncubeerd met rhodamine-geconjugeerd phalloidin om te kleuren op F-actine. Cellen werden vervolgens gewassen met PBS, kernen tegengekleurd met 4′,6‐diamidino‐2‐fenylindol (DAPI) en gemonteerd met dekglaasjes voor confocale microscopie.

cistanche ervaring

2.6|Hydroxyapatietresorptietest

Om osteoclastactiviteit te meten werden BMM's (1 x 105 cellen per putje) gekweekt op met collageen beklede platen met zes putjes (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) gestimuleerd met GST‐rRANKL (100 ng/ml) en M‐CSF (50 ng/ ml) totdat rijpe osteoclasten werden gegenereerd (Zhou et al., 2016). Cellen werden vervolgens voorzichtig losgemaakt van de plaat met behulp van celdissociatie-oplossing (Sigma-Aldrich) en gelijke aantallen rijpe osteoclasten werden gezaaid op individuele putjes in met hydroxyapatiet beklede platen met 96 putjes (Corning Osteoassay, Corning, NY). Volwassen osteoclasten werden geïncubeerd in een medium met GST‐rRANKL en M‐CSF met of zonder CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)in de aangegeven concentraties. Na 48 uur werd de helft van de putjes immunohistochemisch gekleurd op TRAcP-activiteit, zoals hierboven beschreven, om het aantal meerkernige cellen per putje te bepalen. De resterende putjes werden gedurende 10 minuten gebleekt om cellen te verwijderen en meting van de geresorbeerde gebieden mogelijk te maken. Geresorbeerde gebieden werden gefotografeerd onder standaard lichtmicroscopie en de Image J-software (National Institutes of Health, Bethesda, MD) werd gebruikt om het percentage oppervlak van het hydroxyapatietoppervlak dat door de osteoclasten werd geresorbeerd te kwantificeren.

2.7|Luciferase-reporter-assays

Om NFATc1-transcriptieactivering te onderzoeken, werden RAW264.7-cellen stabiel getransfecteerd met een NFATc1-responsief luciferase-reporterconstruct (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Getransfecteerde cellen werden gekweekt in platen met 48 putjes met een dichtheid van 1,5 x 105 cellen per putje en voorbehandeld met verschillende concentraties CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)voor 1 u. Na voorbehandeling werden cellen gedurende 24 uur gestimuleerd met GST‐rRANKL (100 ng/ml) en werd de luciferase-activiteit gemeten met behulp van het luciferasereportertestsysteem volgens het protocol van de fabrikant (Promega).

2.8|Kwantitatieve reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) analyse

Totaal RNA werd uit cellen geïsoleerd met behulp van Trizol-reagens volgens het protocol van de fabrikant (Thermo Fisher Scientific). Complementair DNA werd gesynthetiseerd met behulp van Moloney murine leukemievirus reverse transcriptase met 1 ug RNA-template en oligo-dT-primers. Polymerasekettingreactie-amplificatie van specifieke sequenties werd uitgevoerd met behulp van het volgende programma: 94 graden gedurende 5 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 graden gedurende 40 seconden, 60 graden gedurende 40 seconden en 72 graden gedurende 40 seconden, en een laatste verlengingsstap van 5 minuten op 72 graden. De gedetailleerde informatie van specifieke primers wordt getoond in Tabel 1. Relatieve boodschapper-RNA-niveaus werden berekend door normalisatie naar de expressie van het huishoudgen Hmbs.

2.9|Western-blot-analyse

BMM's werden gekweekt in compleet medium met M‐CSF in platen met zes putjes en gestimuleerd met GST‐rRANKL (100 ng / ml) gedurende de aangegeven tijden. Cellen werden gelyseerd in radioimmunoprecipitatie-lysisbuffer en eiwitten werden gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese en overgebracht naar poly(vinylideenfluoride)membranen (GE Healthcare, Silverwater, Australië). De membranen werden gedurende 1 uur geblokkeerd in 5% magere melk en vervolgens onderzocht met verschillende specifieke primaire antilichamen onder zacht schudden gedurende de nacht bij 4 graden. Membranen werden gewassen en vervolgens geïncubeerd met aan mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichamen. Antilichaamreactiviteit werd vervolgens gedetecteerd met verbeterd chemiluminescentiereagens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) en gevisualiseerd met een Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Intracellulaire ROS-detectie

Intracellulaire ROS-niveaus werden gedetecteerd met behulp van een 2',7'dichloorfluoresceïnediacetaat cellulaire ROS-detectietestkit (Abcam, Melbourne, Australië). BMM's (5 x 103 cellen per putje) werden gekweekt in platen met 96 putjes en 72 uur behandeld met RANKL (100 ng / ml), M‐CSF (50 ng / ml) en CDP. Intracellulaire ROS-niveaus werden gemeten met behulp van 2′,7′‐dichloorfluoresceïnediacetaat, dat oxideert tot fluorescerende DCF in aanwezigheid van ROS. Cellen werden gewassen in Hank's buffer en 30 min in het donker geïncubeerd met 10 µM DCFHADA. Beelden werden verkregen met behulp van confocale microscopie.

2.11|statistische analyse

Alle gegevens zijn representatief voor ten minste drie experimenten die in drievoud zijn uitgevoerd, tenzij anders aangegeven. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Eenrichtingsvariantieanalyse gevolgd door post-hoctests van Student-Newman-Keuls werden gebruikt om de significantie van verschillen tussen resultaten te bepalen, waarbij p < 0.05="" als="" significant="" werd="">

3|RESULTATEN

3.1|CDP remt door RANKL geïnduceerde osteoclastogenese en osteoclastfusie

Om te bepalen of CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)RANKL-geïnduceerde osteoclastvorming kan onderdrukken, hebben we eerst een osteoclastogenese-assay uitgevoerd met behulp van muis-BMM's (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM's werden gedurende 5 dagen behandeld met RANKL en M‐CSF met toenemende concentraties CDP. CDP verminderde het aantal TRAcP‐-positieve meerkernige cellen wanneer de concentratie van CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)bereikte 5 M of hoger (Figuur 1a,b). CDP evalueren(Cistanchedeserticolapolysacharide)toxiciteit en bevestigen dat deze resultaten geen weerspiegeling waren van celdood of aantal, hebben we een MTS-assay uitgevoerd. BMM's werden 48 uur behandeld met RANKL en M‐CSF met variërende doseringen van CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide). CDP had geen effect op BMM-proliferatie bij een concentratie van 15 M of minder (Figuur 1c).

Om de effecten van CDP te testen(Cistanchedeserticolapolysacharide)bij osteoclastfusie werden osteoclasten geïnduceerd met RANKL- en M‐CSF-behandeling, met of zonder variërende doses CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide). Osteoclasten werden gekleurd met rhodamine-phalloidin en DAPI om het aantal kernen per osteoclast te bepalen (Figuur 2a). Zowel het aantal osteoclasten als het gemiddelde aantal kernen per osteoclast daalden na CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)behandeling (5-10 µM; Figuur 2b, c). Daarom, CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)had remmende effecten op door RANKL‐ geïnduceerde osteoclastogenese en osteoclastfusie op een dosisafhankelijke manier.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)verzwakt door RANKL (geïnduceerde osteoclastische hydroxyapatietresorptie-activiteit)

Een hydroxyapatietresorptietest werd uitgevoerd om het effect van CDP . te detecteren(Cistanchedeserticolapolysacharide)op osteoclastfunctie (Figuur 3a). Na een incubatie van 24 uur veranderde het aantal osteoclasten per putje niet, terwijl het resorptiegebied van hydroxyapatiet significant werd verminderd door behandeling met 5 en 10 M CDP in vergelijking met controlegroepen (Figuur 3b, c). Deze resultaten tonen aan dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)heeft sterke remmende effecten op zowel osteoclastvorming als osteoclastresorptie-activiteit zonder enige cytotoxische effecten.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)remt genexpressie van osteoclastmarkers

Om de remmende effecten van CDP . verder te onderzoeken(Cistanchedeserticolapolysacharide)op osteoclastogenese en osteoclastische botresorptie werden BMM's gedurende 5 dagen behandeld met RANKL en M‐CSF met variërende concentraties CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide). RT‐PCR werd vervolgens uitgevoerd om de expressie van osteoclastmarkergenen te detecteren. De expressie van Nfatc1, een cruciale transcriptiefactor tijdens osteoclastogenese, werd geremd door CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)op een dosisafhankelijke manier (Figuur 4a). Bovendien, CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)(5 en 10 µM) verlaagden de expressie van aan botresorptie gerelateerde genen, waaronder Mmp9, Ctsk en Acp5 (Figuur 4b-d).

3.4|CDP onderdrukt NFATc1-activiteit en stroomafwaartse eiwitexpressie

Om het effect van CDP te onderzoeken(Cistanchedeserticolapolysacharide)op RANKL-geïnduceerde NFATc1-activiteit werd een luciferasereportertest uitgevoerd. Behandeling met CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide), bij concentraties van 5 M en hoger, remde RANKL‐-geïnduceerde NFATc1-activiteit significant (Figuur 5a). Bovendien toonde Western Blot-analyse aan dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)significant onderdrukte eiwitexpressie van NFATc1 en c‐Fos in BMM's behandeld met RANKL en M‐CSF gedurende 3 en 5 dagen (Figuur 5b). Bovendien werd de expressie van osteoclastfunctie-gerelateerde eiwitten, zoals V‐ATPase‐d2 en CTSK, neerwaarts gereguleerd in aanwezigheid van CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)vergeleken met controlegroepen. CDP had echter geen effect op RANK-expressie (Figuur 5b).

3.5|CDP bevordert de expressie van antioxidante enzymen om de ROS-productie op te vangen tijdens door RANKL geïnduceerde osteoclastogenese

Om het onderliggende mechanisme van CDP-afhankelijke remming van osteoclastogenese te onderzoeken, werden BMM's behandeld met RANKL (100 ng/ml) en M‐CSF (50 ng/ml) samen met PBS of CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)gedurende 72 uur. We onderzochten het effect van CDP op de intracellulaire ROS-productie gestimuleerd door RANKL. Intracellulaire ROS-niveaus werden verhoogd door RANKL-behandeling, die werd verzwakt door CDP (5 en 10 M; Figuur 6a). Zowel het aantal ROS-positieve cellen als de intensiteit van ROS-kleuring werden op een dosisafhankelijke manier verlaagd door CDP-behandeling (Figuur 6b, c). Western-blot-analyse toonde aan dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)bevorderde de expressie van thioredoxine (TRX1) en glutathionreductase (GSR), terwijl de expressie van induceerbaar stikstofoxidesynthase (NOS2) in BMM's die gedurende 3 dagen met RANKL en M‐CSF werden behandeld, werd onderdrukt (Figuur 6d).

Om verder te onderzoeken of CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)osteoclastdifferentiatie onderdrukt door de ROS-productie te verminderen, behandelden we vervolgens BMM's met peroxide (10 M) om de hoge ROS-status in cellen te imiteren. BMM's werden gedurende 3 dagen geïnduceerd door RANKL en M‐CSF en de resultaten van western blot-analyse en RT‐PCR toonden aan dat peroxide de expressie van NFATc1 en c‐Fos bevorderde in vergelijking met de controlegroepen. In overeenstemming met de resultaten in figuur 5, werd de expressie van NFATc1 en c‐Fos onderdrukt door CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)terwijl peroxide het remmende effect van CDP redde (Figuur 6e, f). Deze gegevens gaven aan dat CDP de expressie van NFATc1 en c‐Fos onderdrukte door de ROS-productie op te ruimen.

3.6|CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)onderdrukt MAPK-routes tijdens door RANKL geïnduceerde osteoclastogenese

Vervolgens onderzochten we het effect van CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)behandeling op RANKL-gemedieerde TRAF6-expressie en MAPK-pathway-activering. Na incubatie in serumvrij medium gedurende 2 uur werden BMM's gedurende 60 minuten gestimuleerd met RANKL, met of zonder CDP. Stimulatie met CDP (10 µM) had geen effect op TRAF6-expressie en verminderde fosforylering van JNK2 en ERK1/2 na 10 en 20 min (Figuur 7). Bovendien werd p38-fosforylering significant geremd door CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)behandeling van 60 min vergeleken met controlegroepen (Figuur 7). Uit deze gegevens blijkt dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)onderdrukt door RANKL-geïnduceerde MAPK-signaleringsroutes, consistent met het remmende effect op de vorming en activiteit van osteoclasten.

4|DISCUSSIE

Cistanche, bekend als "woestijn-ginseng", heeft de laatste tijd veel aandacht getrokken vanwege zijn vermogen om de immuniteit te moduleren en beschermend te werken tijdens veroudering en oxidatieve stress (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Van fenylpropanoïde-gesubstitueerde glycosiden, de belangrijkste actieve componenten van Cistanche, is aangetoond dat ze de NO-activiteit in macrofagen remmen (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Daarnaast is eenCistancheextract verminderde oxidatieve stress in gereperfuseerd myocardium na ischemie en speelde een belangrijke rol bij de remming van apoptotische routes die leiden tot cardioprotectie (Yu, Li, & Cao, 2016). Als een belangrijk onderdeel van Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)heeft verschillende farmacologische functies. Uit onze huidige studie bleek dat CDP de door RANKL geactiveerde differentiatie en activering van osteoclasten onderdrukte door de ROS-productie en NFAT- en MAPK-activering te verzwakken.

Als een zure fosfatase komt TRAcP voor in een verscheidenheid aan cellen en is overvloedig aanwezig in osteoclasten en alveolaire macrofagen (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). TRAcP is een kenmerkend enzym van osteoclasten en de expressie ervan is nauw verwant aan de functie van osteoclasten, beschouwd als een indicator van osteoclastactiviteit en botresorptie (Minkin, 1982). In onze studie, CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)remde het aantal TRAcP-positieve cellen, wat aangeeft dat RANKL-geïnduceerde osteoclastogenese werd geblokkeerd door CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide). Afbraak van botmatrix door osteoclasten hangt af van cathepsine K (CTSK) en MMP's (Gruber, 2015). Hier reguleerde CDP de expressie van functionele osteoclast-genen zoals Mmp9, Ctsk en Acp5 aanzienlijk.

Differentiatie en functie van osteoclasten worden gereguleerd door meerdere signaalroutes (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Na binding aan RANK rekruteert RANKL adapter-eiwit TRAF6 om de expressie van NFATc1 te activeren, wat een belangrijke transcriptiefactor is voor osteoclastvorming, die osteoclast-specifieke genexpressie beïnvloedt, waaronder TRAcP en CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). In deze studie vonden we dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)had geen effect op RANK- en TRAF6-expressie in osteoclasten. Echter, CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)remde RANKL-geïnduceerde NFATc1-activering tijdens osteoclastogenese van BMM's. Bovendien werd aangetoond dat ROS, geproduceerd door mitochondriën tijdens het afleveren van elektronen, de proliferatie en differentiatie van osteoclasten en gereguleerde afbraak van botmatrix bevorderde (Ha et al., 2004). Een recente studie wees uit dat RANKL de nucleaire import van Bach1 induceerde en de door Nrf2 gemedieerde productie van antioxidantenenzymen verzwakte, waardoor de intracellulaire ROS-expressie en osteoclastogenese bij muizen werd verhoogd (Kanzaki et al., 2017). Bovendien verhoogde de verhoogde intracellulaire ROS-generatie door homocysteïne de vorming en activiteit van osteoclasten (Koh et al., 2006). Onze studie wees uit dat CDP de ROS-accumulatie in osteoclasten verminderde door de NOS2-expressie te remmen en de expressie van antioxidante enzymen, zoals TRX1 en glutathionreductase, te bevorderen. Toen we BMM's met peroxide behandelden om de intracellulaire ROS-accumulatie te verbeteren, onthulden de resultaten dat verhoogde ROS de NFATc1-expressie konden verbeteren dat ROS stroomopwaarts van NFATc1 was. We vonden ook dat peroxide het remmende effect van CDP op NFATc1-expressie redde. Onze gegevens suggereren dus dat CDP ROS-accumulatie onderdrukt om NFATc1-expressie te remmen en vervolgens de vorming en functie van osteoclasten te onderdrukken.

ERK, JNK en p38 behoren tot de MAPK-familie, die ook betrokken is bij de regulatie van osteoclastdifferentiatie (Seger & Krebs, 1995). RANKL activeert de MAPK-route door de fosforylering van ERK, JNK en p38 te verhogen (Mizukami et al., 2002). We hebben aangetoond dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)onderdrukte de RANKL-gemedieerde fosforylering van belangrijke eiwitten in de MAPK-route, en droeg daarmee bij aan het remmende effect van CDP op de expressie van osteoclastmarkergenen. Voor zover wij weten, is dit de eerste studie die de remmende effecten van CDP . aantoont(Cistanchedeserticolapolysacharide)op ROS-productie, NFAT- en MAPK-activering, die nieuwe werkingsmechanismen van CDP in vitro vertegenwoordigen.

Samenvattend hebben we aangetoond dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)verzwakt osteoclastogenese en hydroxyapatietresorptie, en de expressie van osteoclastmarkergenen, waaronder Ctsk, Mmp9 en Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)was in staat om RANKL-gemedieerde ROS-productie te onderdrukken, evenals NFAT- en MAPK-activering (Figuur 8). Gezamenlijk suggereren onze resultaten dat CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)kan een kandidaat-medicijn zijn voor de behandeling van osteoclast-gerelateerde aandoeningen die gepaard gaan met ROS-overproductie.

AFBEELDING 8 Schematisch diagram van CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)functie bij de differentiatie van osteoclasten. CDP(Cistanchedeserticolapolysacharide)onderdrukt RANKL-geïnduceerde ROS-productie, evenals NFATc1- en MAPK-activering, waardoor osteoclastogenese wordt geremd. CDP,Cistanchedeserticolapolysacharide; MAPK, door mitogeen geactiveerd proteïnekinase; NFATc1, nucleaire factor van geactiveerde T-cel; RANKL, receptoractivator van kernfactor KB-ligand; ROS, reactieve zuurstofsoorten [Kleurfiguur kan worden bekeken op wileyonlinelibrary.com]

DANKBETUIGING

Deze studie werd ondersteund door de Nature Science Foundation of China (81572164), het National Key Technology Research and Development Program of China (2017YFC1103300), de Natural Science Foundation of Guangxi Province (2016GXNSFAA380295) en het University Science and Technology Research Project van Guangxi Provincie (KY2015YB054). Het wordt ook gedeeltelijk ondersteund door Guangxi Scientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013-15), Western Australia Medical & Health Research Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, The University of Western Australia (UWA) Research Collaboration Awards en de Australian Health and Medical Research Council (NHMRC, nrs. 1107828 en 1027932).

BELANGENCONFLICTEN

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn

Van: 'Cistanchedeserticolapolysacharideverzwakt osteoclastogenese en botresorptie via remming van RANKL-signalering en productie van reactieve zuurstofspecies door Dezhi Song et al.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684