Cistanche Deserticola-polysacchariden verlichten cognitieve achteruitgang en verbeteren het geheugen bij ouder wordende modelmuizen

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ABSTRACT

Recent bewijs suggereert dat veranderingen in de darmmicrobiota-hersenas cognitieve stoornissen kunnen veroorzaken bij het ouder worden. In de huidige studie hebben we waargenomen dat langdurige toediening van D-galactose aan muizen cognitieve achteruitgang, darmmicrobiële dysbiose, perifere ontsteking en oxidatieve stress veroorzaakte. In dit model van leeftijdsgerelateerde cognitieve achteruitgang verbeterden Cistanche deserticola polysacchariden (CDPS) de cognitieve functie bij met D galactose behandelde muizen door de darmmicrobiële homeostase te herstellen, waardoor oxidatieve stress en perifere ontstekingen werden verminderd. De gunstige effecten van CDPS bij deze ouder wordende modelmuizen werden teniet gedaan door ablatie van darmmicrobiota met antibiotica of immunosuppressie met cyclofosfamide. Serummetabolomische profilering toonde aan dat de niveaus van creatinine, valine, L-methionine, o-toluidine, N-ethylaniline, urinezuur en proline veranderd waren in de ouder wordende modelmuizen, maar hersteld werden door CDPS. Deze bevindingen toonden aan dat CDPS de cognitieve functie verbetert in een D-galactose-geïnduceerd verouderingsmodel bij muizen door de homeostase van de darmmicrobiota-hersenas te herstellen, wat een aminozuuronbalans, perifere ontsteking en oxidatieve stress verlichtte. CDPS toont dus therapeutisch potentieel voor patiënten met geheugen- en leerstoornissen, vooral die gerelateerd aan darmmicrobiële dysbiose.

Cistanchekruid

INVOERING

Langdurige toediening van D-galactose (D-gal) en berylliumzouten induceert veroudering in experimentele diermodellen en in vitro primaire celculturen en wordt gebruikt om mechanismen te identificeren die ten grondslag liggen aan het natuurlijke verouderingsproces [1-4]. Eerdere studies tonen aan dat cognitieve achteruitgang bij door D-galactose geïnduceerde verouderingsmodelmuizen verband houdt met verminderde zenuwgroeifactor (NGF) eiwitniveaus en verhoogde reactieve zuurstofspecies (ROS) in de hersenen, die beide degeneratie van de hippocampale neuronen veroorzaken en verminderen neurogenese [3, 4]. Recente studies hebben ook aangetoond dat de samenstelling en het aantal menselijke darmflora aanzienlijk veranderen tijdens het verouderingsproces [5].

Cistanche deserticola is een kruid dat voornamelijk groeit in het noordwestelijke woestijngebied van China en wordt gebruikt in de traditionele Chinese geneeskunde. Het is algemeen bekend als de 'ginseng van de woestijn'. Cistanche deserticola-extracten bevatten verschillende farmacologisch actieve verbindingen, waaronder fenylethanoïde glycosiden, iridoïden, lignose, oligosachariden, polysachariden en aminozuren; deze verbindingen zijn geassocieerd met ontstekingsremmende, anti-oxidatieve, anti-senescente, neuroprotectieve en immunomodulerende eigenschappen [6, 7]. Zo zijn polysachariden geëxtraheerd uit Cistanche deserticola gebruikt in de traditionele Chinese geneeskunde om colorectale kanker te behandelen [8]. Een breed scala aan zwak toxische polysachariden met nuttige biologische activiteiten is geïsoleerd uit verschillende organismen, zoals Chuanqiong-polysacharide, Ganoderma lucidum-polysacharide en Lycium barbarum-polysacharide [9-11]. CDA 0.05 is een galactoglucan geïsoleerd uit Cistanche deserticola dat de groei van verschillende nuttige darmbacteriën bevordert, waaronder verschillende soorten Bacteroides en Lactobacillus [12].

De onderliggende mechanismen van het normale verouderingsproces zijn ook betrokken bij verschillende menselijke ziekten zoals neurodegeneratieve aandoeningen, coronaire atherosclerose, type 2 diabetes (T2DM) en hypertensie [13, 14]. Recente studies hebben aangetoond dat veranderingen in de darmflora een belangrijke rol spelen bij veroudering van de mens [15]. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat langdurige toediening van D-galactose bij experimentele muizen en ratten het normale verouderingsproces nabootst en een bruikbaar model is om verouderingsgerelateerde fenotypes zoals cognitieve achteruitgang te bestuderen [16]. Bovendien laten D-galactose-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen veranderingen zien in de samenstelling van de darmmicrobiota [17]. Daarom veronderstelden we dat veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota cognitieve achteruitgang kunnen veroorzaken bij de D-galactose-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen, en onderzochten we of Cistanche deserticola-polysacchariden (CDPS) cognitieve achteruitgang kunnen verlichten door darmmicrobiota-dysbiose te herstellen.

cistanche stengel

RESULTATEN

D-galactose-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen vertonen cognitieve achteruitgang en darmmicrobiële dysbiose

We analyseerden de gedragsprestaties van wildtype (WT) muizen en die behandeld met 150 mg D-gal per kg lichaamsgewicht gedurende 2 maanden (model of Mod) met behulp van nieuwe objectherkenning en Morris water maze (MWM) tests. De preferentiële indexwaarden in de nieuwe objectherkenningstest waren significant verminderd in de Mod-groepmuizen in vergelijking met de WT-groepmuizen (Figuur 1A, 1B). MWM-testresultaten toonden aan dat de ontsnappingstijd na de zesde dag aanzienlijk was toegenomen in de Mod-groep in vergelijking met de WT-groep (Figuur 1C, 1D). Bovendien waren doelplatformovergangen en zwemtijden binnen het doelkwadrant aanzienlijk verminderd in de Mod-groep in vergelijking met de WT-groep (Figuur 1E, 1F). Deze resultaten toonden een significante achteruitgang in de leer- en geheugencapaciteiten van de door Legal geïnduceerde verouderingsmodelmuizen.

Vervolgens analyseerden we de verschillen in de overvloed en samenstelling van de darmmicrobiële phyla, geslachten en soorten in de fecale monsters van de Mod- en WT-groepen van muizen met behulp van 16S ribosomaal RNA (rRNA) sequencinggegevens van fecale monsters. De overheersende darmflora in de WT- en Mod-groepmuizen waren Firmicutes en Bacteroides. De overvloed aan Bacteroides was echter aanzienlijk verminderd en de overvloed aan Firmicutes was significant verhoogd in de Mod-groep in vergelijking met de WT-groep (Figuur 2A). Vervolgens voerden we lineaire discriminantanalyse (LDA) uit om de LDA-effectgrootte (LEfSe)-scores te bepalen, gevolgd door Kruskal-Wallis- en Wilcoxon-tests om de relatieve abundantie van verschillende taxa in de WT- en Mod-groepmuizen te evalueren. De LDA-resultaten worden weergegeven in figuur 2B. Verder hebben we cladogrammen geconstrueerd die differentiële verrijking tonen van verschillende geslachten en soorten die behoren tot de Bacteriodes en Firmicutes-phyla in de WT- en modelgroepen (Figuur 2C). Over het algemeen toonden onze resultaten een verminderd cognitief vermogen en darmmicrobiële dysbiose aan bij de D-galactose-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen.

cistanche gezondheidsvoordelen: anti-oxidatie

CDPS-behandeling verbetert het cognitieve vermogen in de door D-gal geïnduceerde verouderingsmodelmuizen

We analyseerden of CDPS-behandeling de cognitieve achteruitgang bij door D-gal geïnduceerde verouderingsmodelmuizen verlicht. Gedurende de 2 maanden van de toediening werd het lichaamsgewicht om de dag gemeten. De lichaamsgewichten van het model en de CDPS-groepen van muizen waren vergelijkbaar (Figuur 3A). Gedragsexperimenten uitvoeren na de laatste dosis. Nieuwe objectherkenning en Morris waterdoolhof-testresultaten toonden aan dat het kortetermijngeheugen significant hoger was in de CDPS-groepen van muizen in vergelijking met de modelgroep van muizen; langetermijngeheugen in de CDPS-groep muizen was hoger maar statistisch niet significant in vergelijking met de modelgroep muizen (Figuur 3B, 3C). Dit suggereerde dat CDPS-behandeling het verlies van objectherkenningsgeheugen op korte termijn in met D-gal behandelde muizen teniet deed.

Het ruimtelijk leren en geheugen van deze muizen werden geëvalueerd door de Morris-waterdoolhoftest, en de resultaten toonden aan dat de ontsnappingslatentietijden van de CDPS-groep muizen vergelijkbaar waren met de WT-groep muizen en aanzienlijk korter dan de Mod-groepsmuizen (Figuur 3D) . Bovendien waren de ontsnappingslatentietijden significant lager op de zesde dag na de CDPS-toediening in vergelijking met de modelgroep (Figuur 3E). De zwemtijd binnen het doelkwadrant was significant hoger in de CH- en CM-groepen in vergelijking met de modelgroep. De CL-groep is hoger dan de modelgroep, maar heeft geen statistische significantie (Figuur 3F). Bovendien was het aantal perronovergangen significant hoger in de CM- en CL-groepen in vergelijking met de modelgroep. De CH-groep is echter hoger dan de modelgroep en heeft geen statistische significantie (Figuur 3G). Deze resultaten toonden aan dat CDPS-behandeling het ruimtelijk leren en geheugen verbeterde in de D-gal-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen.

Figuur 1. Langdurige toediening van D-galactose induceert leer- en geheugenstoornissen bij muizen.

Figuur 2. Langdurige toediening van D-galactose induceert darmmicrobiële dysbiose bij muizen.

CDPS-behandeling herstelt de homeostase van de samenstelling van de darmmicrobiota in de D-galactose-verouderende modelmuizen

Monosachariden en polysachariden zijn de essentiële voedingsstoffen die nodig zijn voor de groei van bacteriën [18-21]. Er is ook gemeld dat CDPS de samenstelling van de darmflora reguleert [22]. Daarom hebben we geanalyseerd of CDPS-behandelingen de darmmicrobiële dysbiose in de modelgroepmuizen verlichtten door 16S rRNA-sequencinggegevens van fecesmonsters van de WT-, model- en CDPS-groepen van muizen te evalueren.

Eerst hebben we alfa-diversiteitsindices berekend om de algehele rijkdom aan fecale microbiota en het structurele verschil tussen deze groepen te evalueren. We analyseerden alfa-diversiteitsindexen (-diversiteit), zoals waargenomen soorten, Shannon-, Chao 1, ACE- en Simpson-indexwaarden om veranderingen in de samenstelling van verschillende bacteriesoorten in de fecesmonsters van verschillende muizengroepen te bepalen. De indexen -diversiteit (waargenomen soorten, Shannon, Chao 1, ACE en Simpson-indexen) waren hoger in de WT- en CDPS-groepen van muizen in vergelijking met de modelgroep, maar statistische significantie werd alleen waargenomen voor de Chao 1-indexwaarden tussen de CM groep en Mod-groep. Het gaf aan dat toediening met CDPS de microbioomrijkdom verhoogt (Figuur 4A-4E). Vervolgens analyseerden we -diversiteitsindexen om verschillen in de darmmicrobiële soorten tussen de WT-, model- en CDPS-groepen van muizen te identificeren met behulp van niet-metrische multidimensionale schaal (NMDS), hoofdcoördinatenanalyse (PCoA) en hoofdcomponentenanalyse (PCA) . PCA toonde variaties in de darmmicrobiële samenstelling van de modelgroepmuizen tijdens het verouderingsproces, inclusief dimensievermindering en onderhoud van patronen en trends (Figuur 4F). De verschillen in de fecale microbiota tussen de WT-, model- en CDPS-groepen werden geïdentificeerd op basis van PCoA van de ongewogen UniFrac-afstanden voor de 16S rRNA-genen (Figuur 4G). Clusteringanalyse toonde significante verschillen in MVG tussen de modelgroep en de WT- en CDPS-groepen (Figuur 4H).

We evalueerden de top 10 phyla van de darmmicrobiota en ontdekten dat de overvloed van de Bacteroides-phyla significant hoger was in de CH-, CM- en CL-groepen in vergelijking met de modelgroep (Figuur 4I). Dit suggereerde dat CDPS de homeostase van de darmmicrobiota in met D-gal behandelde muizen herstelde. De cladogrammen toonden differentiële verrijking van verschillende geslachten en soorten die behoren tot Bacteriodes en Firmicutes-phyla in de WT-, model- en CDPS-groepen (Figuur 4J). Zoals te zien is in de heatmaps, verminderden CDPS-behandelingen de relatieve abundanties van Thermoplasmata, Bacilli, niet-geïdentificeerde Actinobacteria, Fusobacteriia en niet-geïdentificeerde Elusimicrobia en verhoogden ze de relatieve abundanties van Methanobacteriën, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, niet-geïdentificeerde_Deferribacteres, Anatrobacteriën, Mollicutes, Mollicutes , Erysipelotrichia en niet-geïdentificeerde _ Cyanobacteriën vergeleken met de modelgroep (Figuur 4K). Deze resultaten toonden aan dat CDPS-behandeling de homeostase van de darmmicrobiota significant herstelde in de D-gal-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen.

Figuur 3. CDPS-behandeling verbetert het leervermogen en het geheugen in de D-gal verouderingsmodelmuizen.

CDPS-behandeling verlicht neurodegeneratie in de D-gal-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen door oxidatieve stress te verminderen

Vervolgens analyseerden we de effecten van CDPS op ontstekingen door de serumniveaus van pro-inflammatoire cytokines (IL-2 en TNF-), en anti-inflammatoire cytokines (IL-4 en IL-10 te analyseren. ) in verschillende groepen muizen. De serumspiegels van IL-2 en TNF- waren significant lager en de serumspiegels van IL-4 en IL-10 waren significant hoger in de CH-, CM- en CL-groepen vergeleken met het model groep. Het is aangetoond dat CDPS ontstekingsremmende effecten heeft (Figuur 5A-5D).

Oxidatieve stress wordt veroorzaakt door de verhoogde productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en is een van de belangrijkste factoren die veroudering bevorderen [23]. Daarom analyseerden we de effecten van CDPS op oxidatieve stress in het D-gal-geïnduceerde verouderingsmuismodel door serumniveaus van het antioxidant-enzym, SOD, en het lipideperoxidatieproduct, malondialdehyde (MDA) te evalueren. De serumspiegels van MDA waren significant hoger en de serumspiegels van SOD waren significant verlaagd in de Mod-groep in vergelijking met de WT-groep, maar CDPS-behandeling keerde deze effecten om (Figuur 5E, 5F). Deze resultaten toonden aan dat oxidatieve stress verhoogd was in de D-gal-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen, maar werd verminderd door CDPS-behandeling.

Verder hebben we de oxidatieve stressniveaus in de hersenweefsels beoordeeld door de niveaus van het geavanceerde geoxideerde eiwitproduct (AOPP), directe lipideperoxidatie (LPO) en MDA te analyseren, evenals de activiteiten van antioxidante enzymen zoals glutathionperoxidase (GSH-Px ) en superoxide dismutase (SOD) in het hersenweefsel homogenaten. De hersenen van muizen uit de Mod-groep vertoonden significant verminderde activiteiten van SOD en GSH-PX en significant verhoogde niveaus van AOPP, LPO en MDA in vergelijking met de WT-groep, maar deze effecten waren omgekeerd in de CH-, CM- en CL-groep (Figuur 6A– 6E).

Verder hebben we histologische kleuring van hersensecties uitgevoerd met H&E- en Nissl-kleuringen om de beschermende effecten van CDPS op de hersenen van D-gal-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen te beoordelen. De muizen uit de Mod-groep vertoonden een significante vermindering van het aantal neuronen en het volume, een grotere kloof tussen neuronen, een onregelmatige opstelling van neuronen en nucleaire pyknosis in het CA1-gebied van de hippocampus in vergelijking met de WT-groep, maar deze pathologische veranderingen werden significant verminderd door CDPS-behandelingen ( Figuur 6F). Deze resultaten toonden aan dat CDPS-behandelingen de oxidatieve stress en hersenpathologie significant verminderden in de D-gal-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen.

Figuur 4. CDPS-behandeling herstelt de darmmicrobiële samenstelling in de D-galactose-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen.

CDPS-behandeling vermindert perifere ontsteking en oxidatieve stress door de darmmicrobiële homeostase in D-gal-geïnduceerde modelmuizen te handhaven

Vervolgens analyseerden we of de veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota geassocieerd waren met verhoogde perifere ontsteking en oxidatieve stress tijdens het ouder worden. Hiervoor gebruikten we een triple-antibiotische cocktail (ABX-groep) of cyclofosfamide (Cy-groep; zie ook materialen en methoden) om de darmmicrobiota te verwijderen of immunosuppressie te induceren in de met CDPS behandelde verouderingsmodelmuizen. De antibioticabehandeling deed de gunstige effecten van CDPS-behandeling bij de ouder wordende modelmuizen teniet. We observeerden verminderd leren en geheugen (Figuur 7A), en veranderingen in de samenstelling van de darmflora (Figuur 7B, 7C) in de ABX-groep muizen vergeleken met de met CDPS behandelde groep. De bovenstaande resultaten geven aan dat zelfs de toediening van CDPS het leer- en geheugenvermogen van muizen niet kan vergroten na verandering van de darmflora. Bovendien observeerden we verhoogde niveaus van pro-inflammatoire cytokines in de hersenen en het serum van muizen uit de ABX-groep in vergelijking met de CDPS-groep (Figuur 7D-7N). De resultaten van de ABX-groep en CY-groep toonden aan dat nadat de darmflora en de immuunfunctie waren vernietigd, zelfs toediening van CDPS het leer- en geheugenvermogen van muizen niet kon verbeteren. Deze resultaten suggereerden dat CDPS-behandeling perifere ontsteking, oxidatieve stress en cognitieve achteruitgang in de door Legal geïnduceerde verouderingsmodelmuizen verminderde door darmdysbiose te voorkomen.

Vervolgens gebruikten we het immunosuppressieve medicijn cyclofosfamide [24] om de rol van ontsteking in de gunstige effecten van CDPS te bepalen. Met cyclofosfamide behandelde CDPS-muizen (Cy-groep) vertoonden een verminderd leer- en geheugenvermogen, veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota en afwijkende niveaus van pro- en ontstekingsremmende cytokines in de hersenen en het serum in vergelijking met de wildtype- en CDPS-groepmuizen. Er is echter geen significantie in vergelijking met het model en de ABX-groep. (Figuur 7A–7N). Deze gegevens tonen aan dat veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota de perifere ontsteking in de D-gal-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen verhogen.

Figuur 5. CDPS-behandeling moduleert circulerende niveaus van pro- en anti-inflammatoire cytokines en oxidatieve stress-gerelateerde factoren in de D-galactose-geïnduceerde verouderingsmodel muizen.

CDPS voorkomt door D-gal geïnduceerde veroudering door het aminozuurmetabolisme te reguleren

Het immuunsysteem van de gastheer wordt beïnvloed door metabolieten die worden gegenereerd door de darmmicrobiota [25]. De fecale metabolieten vertegenwoordigen een functionele uitlezing van het microbiële metabolisme in de darm en de microbiële samenstelling van de darm [26]. Bovendien komen metabolieten van de darmmicrobiota de bloedsomloop binnen en beïnvloeden ze het metabolisme en de gezondheid van de gastheer [26, 27]. In totaal werden 1058 metabolieten geïdentificeerd in serummonsters van FWT-, Mod- en CDPS-muizen. Vervolgens analyseerden we deze metabolieten met behulp van BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) en Human Metabolome Database (HMDB) en ontdekten dat 65 metabolieten differentieel tot expressie werden gebracht in de Mod-groep in vergelijking met de WT-groep. Verder vonden we dat de niveaus van 8 metabolieten (creatinine, valine, L-(-)-Methionine, o-Toluidine, N Ethylaniline, urinezuur, proline en fenylalanine) significant verschilden tussen de WT-, Mod- en CDPS-groepen. Pathway-verrijkingsanalyse van deze 8 metabolieten met MetaboAnalyst [28, 29] toonde aan dat deze metabolieten gerelateerd waren aan het arginine-, histidine-, arginine-, proline- en purinemetabolisme (Figuur 8A, 8B). 7 verschillende metabolieten van MOD-groep en CDPS-groep in WT-groep.

Vervolgens analyseerden we of veranderingen in het aminozuurmetabolisme gerelateerd waren aan veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota. We hebben waargenomen dat 7 verschillende metabolieten van WT-, Mod- en CDPS-groepen (creatinine, valine, L-(-)-Methionine, o-Toluidine, N-Ethylaniline, urinezuur en proline) significant waren afgenomen in de ABX, Cy, en Mod-groepen vergeleken met de WT- en CDPS-groepen. Bovendien is er geen significantie tussen ABX- en Cy-groepen (Figuur 8C). Ten slotte, om te onderzoeken, is er een verband tussen differentieel metabolisme en andere verouderingsgerelateerde ziekten. We analyseerden de correlatie tussen deze zeven differentieel tot expressie gebrachte metabolieten en menselijke ziekten met behulp van de MetaboAnalyst-database en ontdekten dat deze metabolieten geassocieerd waren met de ziekte van Alzheimer (p=0.00173; Figuur 8D, 8E). Over het algemeen suggereerden deze gegevens dat CDPS beschermt tegen door D-gal geïnduceerde veroudering door het aminozuurmetabolisme te reguleren.

Figuur 6. CDPS-behandeling vermindert oxidatieve stress in de hersenen van D-galactose-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen

DISCUSSIE

Een progressieve achteruitgang van de cognitieve functie is een kenmerkend kenmerk van veroudering. Eerdere studies toonden aan dat CDPS-behandeling het leren en geheugen significant verbeterde bij de ouder wordende modelmuizen [30-33]. In deze studie hebben we aangetoond dat CDPS-behandeling de cognitieve functie verbeterde door perifere ontsteking en oxidatieve stress te remmen door het herstel van de darmmicrobiële homeostase in de D-gal-geïnduceerde verouderingsmodelmuizen (Figuur 9). Sprague-Dawley-ratten die werden gevoed met Cistanche-polysacchariden vertoonden een verhoogde groei van nuttige darmbacteriën en een verbeterde microbiële diversiteit in de darm [34]. CDA-0.05, een Cistanche-neutraal polysacharide, verbeterde de groei van probiotische Lactobacillen [22]. Deze gegevens suggereerden dat Cistanche-polysacchariden de homeostase van darmbacteriën verbeterden.

In deze studie hebben we aangetoond dat CDPS ontstekingsremmende effecten heeft en het cognitieve vermogen van de ouder wordende modelmuizen verbetert door de overvloed aan darmbacteriële geslachten zoals Bacteroidetes, Firmicutes en Proteobacteria te moduleren. Daarom kunnen CDP's therapeutisch gunstig zijn voor verouderingsgerelateerde ziekten door de samenstelling van de darmmicrobiota te hervormen [35,36]. Bovendien hebben eerdere studies aangetoond dat de niveaus van inflammatoire cytokines in het serum en de dikke darm geassocieerd zijn met de relatieve overvloed aan bacteriële geslachten zoals Bacteroidetes, Firmicutes en Proteobacteria [37, 38]. Bovendien reguleert de darmmicrobiële samenstelling de hersenfunctie door de circulerende niveaus van verschillende cytokinen te moduleren [39-43]. Onze resultaten toonden aan dat CDPS-behandeling de relatieve abundantie van Thermoplasmata, Bacilli, niet-geïdentificeerde Actinobacteriën, Fusobacteriia en niet-geïdentificeerde Elusimicrobia verminderde, en de relatieve abundantie van Methanobacteriën, Spirochaetia, Deltaproteobacteriën, niet-geïdentificeerde _Deferribacteres, Mollicutes, Erysipelotrichia en niet-geïdentificeerde_Cyanobacteriën.

Microbiële metabolieten in de darm komen vrij in de bloedbaan en reguleren de gezondheid en het metabolisme van de gastheer [26, 27]. De darmmicrobiële metabolieten kunnen worden geschat door de samenstelling van de fecale metabolieten te evalueren, die verandert met veranderingen in de samenstelling van de darmmicroben [44]. Recente studies hebben aangetoond dat plasmaspiegels van citrulline, proline, arginine, asparagine, fenylalanine en threonine geassocieerd zijn met neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder de ziekte van Alzheimer [45, 46]. Onze studie toonde aan dat serumspiegels van creatinine, valine, L-methionine, o-toluidine, N-ethylaniline, urinezuur en proline geassocieerd waren met D-gal-geïnduceerde veroudering bij muizen.

Cistanche-extract: ziekte van Alzheimer

De aangeboren en adaptieve armen van het immuunsysteem spelen een belangrijke rol bij het handhaven van de microbiële homeostase van de gastheer in het luminale oppervlak van de darm [47]. De darmmicrobiota speelt ook een belangrijke rol bij het reguleren van het centrale zenuwstelsel (CZS) en de immuniteit door cytokinen en metabolieten in de bloedbaan af te geven [48, 49]. De pro-inflammatoire cytokines spelen een sleutelrol bij verschillende neurodegeneratieve ziekten [50-52]. Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en glaucoom zijn bijvoorbeeld geassocieerd met extracellulaire accumulatie van amyloïde (A) en intracellulaire afzetting van hypergefosforyleerd tau (ptau) en ijzer in de retinale ganglioncellen (RGC) [44]. Bovendien speelt ontsteking een belangrijke rol in de pathogenese geassocieerd met glaucoom [53]. Visusstoornis is een vroeg symptoom van de ziekte van Alzheimer (AD) en manifesteert zich vóór het begin van cognitieve achteruitgang [54]. Onze studie toonde aan dat CDPS beschermt tegen cognitieve achteruitgang en perifere ontstekingen door de homeostase van de darmmicrobiota te handhaven.

Er zijn verschillende beperkingen aan deze studie. Ten eerste is de relatie tussen het aminozuurmetabolisme en de samenstelling van de darmmicrobiota niet goed bekend. Ten tweede is de samenstelling en moleculaire structuur van CDPS niet bekend. Daarom zijn toekomstige studies nodig om de regulerende rol van CDPS bij het verlichten van AD verder te onderzoeken via de darmmicrobiota-hersensignaleringsas.

Concluderend, onze studie toonde aan dat CDPS het cognitieve vermogen verbeterde bij door D-gal geïnduceerde verouderingsmodelmuizen door de homeostase van de darmmicrobiota te herstellen, waardoor de onbalans van aminozuren, perifere ontsteking en oxidatieve stress werd hersteld. Deze bevindingen suggereren dat CDPS een potentieel therapeutisch middel is voor patiënten met leer- en geheugenstoornissen, vooral die geassocieerd met darmdysbiose.

MATERIALEN EN METHODES

Bereiding van CDPS

Ongeveer 1.0 kg schoongemaakte Cistanche deserticola werd aan de lucht gedroogd in de oven bij 40 graden C en verpulverd tot ruw poeder. Het poeder werd gedurende 3 uur in hete ethanol geëxtraheerd. Het residu werd door gaas gefiltreerd om het filtraat te verwijderen en vervolgens verdund met water (8X) en achtereenvolgens 2 uur, 1,5 uur en 1 uur bij 90 ° C onder terugvloeikoeling gekookt. Op elk tijdstip werd de oplossing gecentrifugeerd om het supernatant en gecombineerd met het bruinrode filtraat. Vervolgens werd het filtraat onder verminderde druk geconcentreerd, afgekoeld tot kamertemperatuur, langzaam toegevoegd aan 95% ethanol (3X) en men liet het 24 uur staan ​​bij 4°C. Vervolgens werd de oplossing gedurende 20 minuten bij 4°C bij 6000 t/min gecentrifugeerd. Het precipitaat werd verzameld na driemaal herhaalde waterextractie en alcoholprecipitatie. Het precipitaat werd gereconstitueerd in water, onteiwit, gedialyseerd en gevriesdroogd om ruwe Cistanche deserticola polysaccharide (CDP's) te verkrijgen. Het polysacharidegehalte was meer dan 90 procent, zoals beoordeeld met ultraviolet-spectrofotometrie.

cistanche extract

Diergroepering en behandelingen

Acht weken oude mannelijke Kunming-muizen (SCXK-licentienr.2019-0010) werden gekocht bij SPF Biotechnology Co. Ltd (Beijing, China), gehuisvest in een lichte en temperatuurgecontroleerde kamer en gevoed met voedsel en water. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Inner Mongolia Medical University. De experimenten zijn uitgevoerd volgens de National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

Na 1 week aanpassing aan de nieuwe omgeving werden 120 muizen verdeeld in de volgende 7 groepen: (1) wildtype controle (WT); modelgroep (150 mg/Kg/dag D-gal; Mod); (3) CH: D-gal plus 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal plus 25 mg/kg CDPS; (6) ABX-groep: antibiotica plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (7) Cy-groep: cyclofosfamide plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS.

De muizen uit de model-, ABX-, Cy- en CDPS-groepen kregen gedurende 2 maanden elke dag subcutane injecties van 150 mg/kg D-gal in zoutoplossing. De WT-groep werd gedurende 2 maanden subcutaan geïnjecteerd met een gelijk volume zoutoplossing. De muizen van de CDPS-groep kregen ook dagelijks intragastrische injecties met 100 mg/kg, 50 mg/kg of 25 mg/kg CDPS gedurende 2 maanden. De muizen van de ABX-groep kregen gedurende 2 maanden drinkwater met 0,1 mg/ml ampicilline en 0,5 mg/ml streptomycine, naast injecties met D-gal en CDPS. Alvorens D-gal toe te dienen, kregen de muizen injecties met 0,1 mg/ml ampicilline, 0,5 mg/ml streptomycine en 0,1 mg/ml colistine gedurende 7 dagen in de ABX-groep. De muizen uit de Cy-groep kregen gedurende 2 maanden om de dag (qod) intraperitoneale injecties van 20 mg/kg cyclofosfamide, naast dagelijkse injecties met D-gal en CDPS.

Nieuwe objectherkenningstest

Gedragsexperimenten uitvoeren na de laatste dosis. De objectherkenningstest omvatte fasen van vertrouwdheid, training en testen. Tijdens de gewenningsfase werden muizen gedurende twee dagen gedurende 10 minuten gewend in een lege testkamer. Vervolgens werden op de derde dag (trainingsdag) twee objecten van dezelfde grootte, vorm en kleur (A1 en A2) op tegenoverliggende uiteinden van de kamer geplaatst. Elke muis kreeg vervolgens 10 minuten om de twee vergelijkbare objecten te verkennen. Na 1-uur (op de derde dag) en 24-uur (op de vierde dag) trainings-tot-test intervallen, werd een van de vergelijkbare objecten (A1 of A2) vervangen door een B of C object dat op de testdag verschilt in grootte, kleur en vorm. Tijdens de testfase werd elke muis gedurende 5 minuten getest en werd de preferentiële index berekend om het geheugen van de herkenning van nieuwe objecten (B of C) te bepalen met behulp van de volgende formule: Preferentiële index=Tijd op object B of C/ (Tijd op object B of C plus Tijd op object A)×100 procent.

Morris water doolhof test

De Morris waterdoolhoftest werd uitgevoerd in een rond zwembad met een diepte van 45 cm en een diameter van 90 cm. Het protocol beschreven door Ruediger S, et al. (2011) [55] en Wood RA, et al. (2018) [56] was hier werkzaam. De waterdiepte in het zwembad was 30 cm en de temperatuur van het water was 20 ± 1 graad C. Het platform was 6 cm in diameter en 1 cm onder water. De tijd voor training en testen was elk 60 s. Voor training hebben we vijf opeenvolgende dagen vier proeven van elk 60 s uitgevoerd met een verborgen platform elke dag. Als het platform in 60 s niet door de muizen werd ontdekt, werden ze naar het platform geleid en gedurende 5 s op het platform geplaatst. Tijdens de testfase werden de latentie om het verborgen platform te bereiken in trainings- en testproefsessies, het aantal overschrijdingen van de verwijderde platformlocatie en de tijd doorgebracht in het doelkwadrant (platform) geregistreerd en geanalyseerd.

ELISA-assays

De serumspiegels van pro-inflammatoire cytokines zoals IL-2(), IL-4, IL-10 en TNF- werden geanalyseerd voor elke groep muizen met behulp van ELISA-kits die waren gekocht bij Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) volgens de instructies van de fabrikant. De activiteit van het antioxidant-enzym, superoxide-dismutase (SOD) en niveaus van lipideperoxidatieproduct, malondialdehyde (MDA), in het serum van elke groep muizen werd geanalyseerd met testkits die waren gekocht bij het Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) . De niveaus van geavanceerde oxidatie-eiwitproducten (AOPP) in de hippocampusmonsters van muizen werden geschat met behulp van een ELISA-kit van Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Shanghai, China) volgens de instructies van de fabrikant.

Schatting van oxidatieve stress in muizenhersenen

We homogeniseerden 100 mg hippocampusweefsel met 0,9 ml ijsgekoelde zoutoplossing en het homogenaat werd 30 minuten bij 4°C bij 12000 rpm gecentrifugeerd. Het eiwitgehalte in het supernatant werd geanalyseerd met behulp van de BCA Protein Assay Kit ( Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China). De niveaus van lipideperoxidatie (LPO) en malondialdehyde (MDA), en de activiteiten van GSH-Px en SOD in de hippocampusmonsters werden geanalyseerd door colorimetrie met behulp van kits van het Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) volgens de instructies van de fabrikant.

Cistanche-supplement: verbetert het geheugen

Samenstelling van de darmflora

Fecale monsters werden verzameld van alle muizen en onmiddellijk bewaard bij -80 graad C. Het V3 plus V4-gebied van het 16S rRNA-gen werd gesequenced met behulp van Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Beijing, China) en geanalyseerd met behulp van de QIIME open platform om de darmmicrobiota-profielen te bepalen.

LC/MS-analyse van serummetabolieten

Serummonsters werden 10 minuten geïncubeerd met voorgekoelde methanol in een verhouding van 1:3 om de eiwitten te laten neerslaan. De monsters werden gecentrifugeerd bij 12000r/min gedurende 15 minuten bij 4°C. De supernatanten werden geanalyseerd door Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography en QExactive massaspectrum. De chromatografische omstandigheden worden weergegeven in Tabel 1. De analyten werden gescheiden in een XBridge BEH Amide-chromatografische kolom (2,1 x 100 mm; Waters Co., Milford, MA, VS) met 0,1 procent mierenzuur en acetonitril als mobiele fasen A en B , respectievelijk. De stroomsnelheid werd ingesteld op 0,4 ml/min, het injectievolume was 5 µl en de kolomtemperatuur werd ingesteld op 25°C (Tabel 1). De massaspectrumsignalen werden verkregen met behulp van de positieve en negatieve ionenscanmodi. De ionensproeispanning en andere specifieke MS-parameters worden weergegeven in tabel 2.

statistische analyse

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 en p< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">