Cistanche: Echinacoside-geïnduceerde stikstofoxideproductie in endotheelcellen: rollen van de androgeenreceptor en de PI3K-Akt-route

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, dANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU en XIN LIU

Invoering

CistancheHoffmg. Et Link is een overblijvend parasietkruid van een geslacht van de Orobanchaceae-familie. HerbaCistanche, de stam vanCistanche deserticolaY.c. MA enCistanche tubulosa(Schenk) R. Weight, zijn gebruikt als een tonisch middel voor de behandeling van nierdeficiëntie, impotentie, morbide leukorroe en seniele constipatie (1), wat te wijten kan zijn aan het androgeenachtige of geslachtshormoonregulerende effect (2).Echinacoside(EchH; c35H46O20;

molecuulgewicht, 786,73; Fig. 1), is een van de fenylethanoïde glycosiden (PhG's) geïsoleerd uit de stengels van HerbaCistancheen vertoont meerdere biologische eigenschappen, waaronder antioxiderende, anti-aging, anti-inflammatoire, hepatoprotectieve en neuroprotectieve effecten (3). Moderne farmacologische onderzoeken hebben aangetoond dat verschillende bestanddelen van HerbaCistanchewaaronder EcH, acteoside, kankanose, kankanoside F en cistanoside F, vertonen vaatverwijdende activiteit (4).

Het endotheel is een kritische regulator van het vaatstelsel en stikstofmonoxide (NO) is een belangrijke ontspannende factor die door endotheelcellen wordt afgegeven. Door te diffunderen in gladde spiercellen, activeert NO guanylaatcyclase, verhoogt het de niveaus van cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP) en activeert vervolgens cGMP-afhankelijke proteïnekinasen (PKG's) om ontspanning van gladde spieren te bevorderen (5). Eerder werd aangetoond dat EcH bij 350-400 µM direct inwerkt op vasculaire gladde spieren en hypoxie-geïnduceerde proliferatie remt in gladde spiercellen van de longslagader van ratten (6), terwijl 30-300 µM EcH acute vasorelaxatie veroorzaakte in endotheel- intacte ringen op een concentratieafhankelijke manier, en verhoogde cGMP-productie in de gladde spier van het corpus cavernosum van aortaringen die worden samengetrokken door fenylefrine (7). Door de NO-cGMP-PKG-BKca-kanalen in gladde spiercellen te openen, onderdrukte 100 of 300 µM EcH de door noradrenaline geïnduceerde contractie in de longslagaders van ratten, in het bijzonder in endotheel-beroofde ringen (8). Endotheelcellen zijn de belangrijkste regulatoren van de cardiovasculaire functie en in verschillende gevallen is gevonden dat de endotheelafhankelijke relaxatie het gevolg was van een overdraagbare stof, zoals NO, die vrijkwam uit het endotheel (9). Het stroomopwaartse moleculaire mechanisme van door EcH geïnduceerde NO-productie in vasculaire endotheelcellen vereist echter verder onderzoek.

In het vasculaire endotheel wordt NO-generatie voornamelijk gemedieerd door endotheliaal NO-synthase (eNOS). Verschillende groepen hebben aangetoond dat de fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)-route het serine-threonine-eiwitkinase B (Akt) activeert, dat directe eNOS-fosforylering veroorzaakt bij serine 1177 (Ser1177) (10). De androgeenreceptor (AR) is een lid van de nucleaire receptorsubfamilie s3, die de genexpressie canoniek wijzigt. AR-lokalisatie naar de caveolae in het celmembraan is betrokken bij

de niet-genomische regulatie van de functie van endotheelcellen of genexpressie door de c-Src/PI3K/Akt-cascade te activeren, wat uiteindelijk resulteert in eNOS-fosforylering en NO-productie (11). In menselijke aorta-endotheelcellen is gemeld dat testosteron PI3K / Akt-signalering activeert en snel NO-productie induceert vanwege de directe interactie van AR en de p85-subeenheid van PI3K op het cardiovasculaire systeem (12). Er werd gemeld dat EcH hormoondeficiëntie-gerelateerde symptomen verergert en zijn androgeen-achtige effecten uitoefent als gevolg van competitieve binding aan de AR in plaats van aan testosteron (2). Daarom veronderstelde de huidige studie dat de PI3K / Akt-route mogelijk betrokken is bij NO-productie door AR-afhankelijke eNOS-fosforylering geïnduceerd door EcH. Het doel van de huidige studie was om de volgende effecten van EcH te evalueren: i) Inductie van NO-productie en eNOS-fosforylering; ii) betrokkenheid van AR bij eNOS-fosforylering; en iii) activering van de PI3K/Akt-route in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEcs), een bekend experimenteel model voor het bestuderen van de regulatie van endotheelcelfuncties en angiogenese (13).

Materialen en methoden

Chemicaliën en reagentia.EcH (zuiverheid, 92,5 procent) werd verkregen van de National Drug Reference Standards in National Institute for the Food and drug control. Antilichamen tegen p-Akt (Ser473; cat. no. ab8805), Akt (cat. no. ab81283), p-eNOS (Ser1177; cat. no. ab184154) en eNOS (cat. no. ab76198) werden gekocht bij Abcam. De remmers van nilutamide en IcI 182780 werden verkregen van Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME werd gekocht bij Adamas-Beta, Ltd. en wortmannine werd gekocht bij Pribolab.

Cel cultuur endrugs behandeling.HUVEc's werden verkregen van Sciencell Research Laboratories Inc. en gekweekt in endotheelcelmedium (EcM; Sciencell Research Laboratories) met 5 procent (v/v) foetaal runderserum (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) en 1 procent endotheelcel groeisupplement (ECGS) bij 37˚C (5 procent CO2 en 95 procent vochtigheid) (14). Bij het bereiken van confluentie werden de cellen gedigereerd met trypsine en uitgeplaat in EcM met 1% FBS en 1% EcGS. Voor alle experimenten werden HUVEcs uitgeplaat in een concentratie van 1x104/ml en gekweekt totdat ze samenvloeiden. Voorafgaand aan de behandeling met EcH of andere stimulatoren werden de cellen gedurende 6 uur geïncubeerd in fenolroodvrij EcM zonder FBS en EcGS om

groei stilstand. In de remmende experimenten werden HUVEcs voorgeïncubeerd met verschillende antagonisten of remmers, waaronder 10 µM nilutamide, 10 µM IcI 182780, 0,5 mM L-NAME of 5 µM wortmannine, gedurende 30 minuten, met of zonder ECH, bij 37˚C. In alle groepen, inclusief de controle, werd dMSO als oplosmiddel gebruikt in gelijke concentraties van 0,001%.

Meting van intracellulair GEEN productie.

Relatieve veranderingen in de cytosolische NO-concentratie in HUVEcs werden gevolgd met behulp van de fluorescerende NO-sonde DAF-FM (Cayman Chemical Company), zoals eerder gemeld (12). In het kort werden de cellen geladen met 5 µM DAF-FM-diacetaat gedurende 20 minuten bij 37°C in een zwarte microtiterplaat en verschillende keren gespoeld met PBS (pH 7,4). De fluorescentie werd bepaald bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 495 en 515 nm met behulp van een fluorescerende microplaatlezer (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) en een compacte omgekeerde microscoop (Nikon eclipse Ts2R; Nikon Corporation).

Westers vlek analyse.Zoals eerder gemeld (15), werden samenvloeiende monolagen van cellen tweemaal gewassen in ijskoude PBS en gelyseerd met RIPA-buffer (P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology). De eiwitconcentratie in het supernatant werd gemeten met behulp van de bicinchoninezuurtestmethode (16). Vervolgens werd 30 µg eiwit per baan geladen, gescheiden met 10 procent polyacrylamidegels en overgebracht op polyvinylideendifluoridemembranen. De vliezen werden gedurende 1 uur bij 25°C geblokkeerd met 5 procent magere melk. Na incubatie met monoklonale antilichamen tegen Akt (1:1,000 verdunning), p-Akt (1:500 verdunning), eNOS (1:2,000 verdunning), of p-eNOS (1 :1,000 verdunning) bij 4°C overnacht, werden de membranen 4 keer gewassen met TBST (bevat 0,1 procent Tween-20) gedurende ~15 min per wasbeurt bij 25°C. Vervolgens werden de membranen geïncubeerd met aan mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichamen (1:5, 000 verdunning; anti-muis antilichaam, cat. nr. A0216, of anti-konijn antilichaam, cat. nr. A0208, Beyotime Institute van biotechnologie) gedurende 1 uur bij 25°C, en gedetecteerd met behulp van een verbeterde chemiluminescentiekit (cat. nr. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met behulp van Image J gelanalysesoftware, versie 1.8.0_112 (National Institutes of Health).

Klein bemoeienis (si) RNA voorbereiding en transfectie.De lange dubbelstrengs RNA's werden gesynthetiseerd door het doel-mRNA van de AR en oestrogeenreceptor (ER) met sequenties die worden weergegeven in tabel I. De voorwaarden voor siRNA-knockdown omvatten het transfecteren van HUVEC's bij 70 procent confluentie die wordt gehandhaafd in niet-antimicrobiële kweekmedium in met collageen beklede kweekschalen van 60 mm. Transfectie van 5 nM AR-siRNA of 10 nM ER-siRNA met Lipofectamine 3000-reagens (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) werd afzonderlijk uitgevoerd, volgens de protocollen van de fabrikant. Transfectie-efficiëntie werd geëvalueerd door reverse transcriptie kwantitatieve-PcR-analyse (RT-qPcR), zoals eerder gerapporteerd (17). De thermocyclische omstandigheden waren als volgt: 10 min bij 95˚C; 40 cycli van 95˚C gedurende 5 sec en 60˚C gedurende 1 min, en een smeltcurve bij 95˚C gedurende 15 sec, 60˚C gedurende 1 min en 95˚C gedurende 15 sec; voor elk monster werden drie onafhankelijke biologische replica's uitgevoerd. De daaropvolgende experimenten werden 48 uur na transfectie uitgevoerd. Primer-paren zijn ontworpen met behulp van Primer Premier v5.0-software (PREMIER Biosoft) met de volgende sequenties: AR forward, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' en reverse, 5'-GAcTTGTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ER vooruit, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' en achteruit, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; en GAPdH vooruit, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' en omgekeerd, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

Statistisch analyse.Alle gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie. Statistische vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met behulp van de Kruskal-Wallis-test of tweeweg-ANOVA met Tukey's post-hoctest voor meerdere vergelijkingen. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultaten

ECH induceert NEE productie en eNOSfosforylering.Zoals getoond in Fig. 2A en B, verhoogde 1 µM ECH de intracellulaire NO-productie in HUVEcs significant in vergelijking met de negatieve controlecellen, terwijl het stimulerende effect van EcH werd afgezwakt tot het controleniveau door voorbehandeling met L-NAME. Om de optimale concentratie te verkrijgen, werd eNOS-fosforylering getest 60 minuten na behandeling met EcH in concentraties

van {{0}}, 0.01, 0.1, 1 en 10 µM. De resultaten onthulden dat EcH bij concentraties van 0, 01-10 M eNOS-fosforylering op Ser 1177 significant kan induceren op een concentratieafhankelijke manier, met de maximale eNOS-fosforylering waargenomen bij 10 µM EcH-inductie (Fig. 2c en d). Verder werd eNOS-fosforylering op Ser1177 onderzocht door Western-blot-analyse op 0, 5, 15, 30, 60 en 120 minuten na incubatie met 1 µM EcH. Er werd waargenomen dat eNOS-fosforylering snel werd geactiveerd door EcH na 5 minuten en bleef toenemen tot 30 minuten incubatie (Fig. 2E en F). Vervolgens bleef de relatieve omvang van de eNOS-fosforylering, ondanks de behandeling met EcH, stabiel vanaf 30 minuten; daarom had EcH geen invloed op de totale eNOS-expressie (Fig. 2c en E).

AR bemiddelt ECH-geïnduceerd NEE productie en eNOSinterfererende effecten van AR-siRNA-1 en ER-siRNA-2 waren het meest succesvol in het remmen van de expressie van AR en ER in HUVEcs in de huidige studie (Fig. 3). Vervolgens werden een antagonist voor AR-remming-van-functie-analyse en siRNA voor AR-verlies-van-functie-analyse toegepast om de betrokkenheid van AR bij door EcH geïnduceerde eNOS-activering en NO-productie te evalueren. Zoals getoond in Fig. 4A, verhoogde 1 µM ECH significant de NO-productie in HUVEcs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH activeert de PI3K/Akt pad.In de huidige studie werd Akt-fosforylering op Ser473 getest 60 min na EcH-incubatie bij concentraties van 0, 0.01, 0.1 , 1 en 10 µM. De resultaten gaven aan dat EcH (0.01-10 µM) Akt-fosforylering aanzienlijk kan induceren. De relatieve expressieniveaus van p-Akt bereikten een piek bij 1 en 10 µM EcH-behandeling (Fig. 5A en B). Verder werd Akt-fosforylering onderzocht met Western-blot-analyse op 0, 5, 15, 30, 60 en 120 minuten na de toevoeging van 1 µM EcH aan HUVEc-kweken. Zoals getoond in Fig. 5c en d, verhoogde EcH de Akt-fosforylering snel na 5 minuten incubatie en het maximale eiwitniveau van p-Akt werd waargenomen na 60 minuten. Daarentegen had EcH geen invloed op de totale Akt-expressie (Fig. 5A en c). Om het potentiële effect van de PI3K-route op de eNOS-fosforylering te onderzoeken, werden HUVEc's bovendien voorbehandeld met de PI3K-remmer wortmannine voorafgaand aan de toepassing van EcH. Wortmannine bleek door EcH geïnduceerde NO-productie te verlagen tot basislijnniveaus (Fig. 5E). Een soortgelijk fenomeen werd waargenomen met behulp van fluorescentiemicroscopie bij het onderzoeken van EcH-geïnduceerde DAF-FM-fluorescentie (Fig. 5F). Bovendien kan wortmannine het vermogen hebben om snelle eNOS-fosforylering in HUVEcs af te schaffen (Fig. 5G en H). De bovengenoemde resultaten suggereren dat EcH eNOS-fosforylering en NO-productie kan activeren via de PI3K/Akt-route.

Discussie

EcH is een natuurlijke verbinding geïsoleerd uit HerbaCistanche, met verschillende farmacologische eigenschappen. Eerder werd aangetoond dat EcH een endotheel-afhankelijk vasculair relaxatie-effect uitoefende door NO-cGMP-PKG-BKca-kanalen in gladde spiercellen van bloedvaten te openen (7,8). De huidige bevindingen leveren bewijs dat ECH AR-afhankelijke activering van eNOS uitoefende om NO-productie te induceren met de betrokkenheid van de PI3K/Akt-signaleringsroute in vasculaire endotheelcellen.

Als de binnenste laag van de vaatwand kan het endotheel snel veranderingen in de bloedstroom waarnemen en erop reageren, wat op zijn beurt resulteert in signaaloverdracht naar de onderliggende gladde spiercellen om de vaattonus te reguleren (18). Er is algemeen gerapporteerd dat er meerdere van het endotheel afgeleide vaatverwijdende verbindingen bestaan, met de meest prototypische stofzijnde NO, gevormd uit de endotheliale isovorm van eNOS, wat resulteert in fosforylering (19). Onder normale omstandigheden blijft eNOS inactief wanneer gebonden aan caveolin, en wordt geactiveerd met de volgende opeenvolging van gebeurtenissen in endotheelcellen: i) eNOS dissocieert van caveolin-1 en associeert met ca2 plus /caM; ii) heat shock protein (HSP)90 bevordert eNOSdimerisatie en is voorstander van een sterische formatie om Akt te rekruteren; en iii) calcineurine defosforyleert Thr495 om de activeringstoestand te versterken (20). In de huidige studie was de NO-productie significant verhoogd in HUVEC's die waren behandeld met 1 M ECH. Dit fenomeen was vergelijkbaar met eerdere resultaten, waarbij EcH de NO-afgifte verhoogde en de synthese van cGMP in thoracale aortaringen van ratten stimuleerde (7). Bovendien lijken twee fosforylatieplaatsen, Ser1177 en Thr495, bijzonder belangrijk te zijn voor het reguleren van de eNOS-activiteit (20), en de huidige studie onthulde dat EcH op een concentratieafhankelijke manier acute eNOS-fosforylering op Ser1177 induceerde. Bovendien bepalen de stimuli die geassocieerd zijn met de effecten op eNOS-eiwitniveaus voornamelijk de eNOS-mRNA-stabiliteit, en als de stimulus voor een langere periode wordt gehandhaafd, vindt eNOS-mRNA-transcriptie plaats via mitogeen-geactiveerd proteïnekinase en nucleaire factor κB (20). Alles bij elkaar genomen geven deze waarnemingen aan dat de activering van eNOS op Ser1177 verantwoordelijk is voor de NO-synthese die wordt geïnduceerd door EcH.

Bovendien hebben steeds meer onderzoeken aangetoond dat AR tot expressie wordt gebracht in endotheelcellen in een aantal menselijke weefsels, wat wijst op een mogelijke rol voor androgenen en hun analogen, die werken via AR-gemedieerde processen, bij de modulatie van menselijke endotheelcellen. celhomeostase (21). In de niet-klassieke PI3K/Akt-route kan AR PI3K activeren door directe interactie met PI3K-regulerende subeenheid p85 (22). De huidige studie toonde aan dat een AR-antagonist of AR-siRNA de NO-productie en eNOS-fosforylering veroorzaakt door EcH in HUVEcs verminderde. Er is eerder gemeld dat oestrogenen eNOS-fosforylering induceren en NO-productie stimuleren via klassieke ER-activering in endotheelcellen (23), en de toediening van ECH verbetert de expressie van ER in de baarmoeder aanzienlijk (24). In de huidige studie was het effect van AR echter prominenter in vergelijking met dat van ER op door EcH geïnduceerde eNOS-activering en NO-productie. Bovendien werd waargenomen dat EcH binnen enkele minuten acute NO-productie veroorzaakte via AR-betrokken eNOS-activering in HUVEcs, wat consistent is met de niet-genomische aard van de respons in endotheelcellen. De AR is geassocieerd met steigereiwitten, waaronder HSP90, HSP70 en kinase Src, in het cytoplasma, en het kan binnen 5 minuten na behandeling met testosteron naar het membraan worden getransporteerd vanuit het AR-complex (23). Op basis van de 'target fishing'-strategie werd HSP90 geïdentificeerd als het PhGs-gekoppelde doelwit, wat aangaf dat EcH de dissociatie van AR van de steigereiwitten kan vergemakkelijken (25). Een andere studie suggereerde dat EcH in de hypothalamus kan combineren met de AR-pocket bij aminozuren Met-894 en Val-713 en het transport van cytoplasmatische AR naar de kern remt (26). Het onderliggende mechanisme waardoor EcH cytoplasmatische AR-translocatie naar het membraan medieert, vereist echter verder onderzoek. Daarom is verder onderzoek nodig om het mechanisme op te helderen waardoor EcH AR-afhankelijke eNOS-activering bereikt en hoe het kan worden geassocieerd met binding aan HSP90 in vasculaire endotheelcellen.

De PI3K/Akt-route is een van de belangrijkste signaalcascades, waarvan de activering wordt geïnduceerd door de productie van fosfatidylinositol-3,4,5-trifosfaat om te binden aan het N-terminale pleckstrin-homologiedomein van de Ser/ Thr kinase Akt. Dit vergemakkelijkt de rekrutering van Akt naar het plasmamembraan (27). De PI3K/Akt-route kan een belangrijke rol spelen bij de controle van NO-afhankelijke relaxatie die door EcH wordt geïnduceerd.

De huidige studie onthulde dat door EcH geïnduceerde NO-productie significant werd verminderd wanneer de cellen werden geïncubeerd met de PI3K-remmer wortmannine. Een eerder rapport toonde aan dat 15 mg/kg EcH de PI3K/Akt-signaleringsroute in 5-fluorouracil-onderdrukte beenmergcellen activeerde (28). In de huidige studie verminderden PI3K-remmers de door EcH geïnduceerde eNOS-fosforylering op Ser1177 aanzienlijk. Bovendien werd Akt-activiteit voornamelijk gereguleerd door stroomopwaartse regulerende routes, met name PI3K-afhankelijke fosforylering op Ser473 (20). In de huidige studie induceerde EcH Akt-fosforylatie op Ser473 op een dosisafhankelijke manier; op dezelfde manier toonde een eerdere studie aan dat 5, 10 of 20 M EcH een cardioprotectief effect uitoefende tegen anoxie/reperfusiebehandeling op een dosisafhankelijke manier door mogelijk p-Akt en SLc8A3 te verhogen (29). De transcriptionele regulatie van het Akt-gen blijft grotendeels onbekend (30); daarom concentreerde de huidige studie zich op de post-transcriptionele regulerende effecten van EcH op Akt. Rekening houdend met de bovengenoemde bevindingen, werd geconcludeerd dat de toepassing van EcH op HUVEcs kan leiden tot de activering van de PI3K/Akt-route, die eNOS fosforyleert en vervolgens de NO-productie verhoogt.

Concluderend, EcH is een natuurlijk product dat voornamelijk is geïsoleerd uit HerbaCistanche.Het mogelijke mechanisme dat ten grondslag ligt aan door EcH geïnduceerde NO-productie in endotheelcellen kan het volgende omvatten (Fig. 6): i) EcH werkt als een functionele ligand van AR die is gelokaliseerd in de caveolae in het celmembraan; ii) PI3K bindt aan het hydrofobe domein van Akt op Ser473 en vergemakkelijkt de rekrutering van Akt naar het celmembraan; iii) de rekrutering van de PI3K/Akt-cascades triggert AR-afhankelijke eNOS-fosforylering; en iv) de vorming van NO wordt gemedieerd door eNOS in endotheelcellen. De waarneming dat EcH NO-productie induceert door de AR-afhankelijke fosforylering van eNOS met de betrokkenheid van de PI3K/Akt-route kan bijdragen aan een beter begrip van de vaatverwijdende effecten van EcH. Bovendien kan de EcH die zich richt op de van endotheel afkomstige NO-routes, te wijten zijn aan niet-genomische effecten. Daarom kan de huidige studie helpen bij het ophelderen van de mechanismen waarmee EcH zijn farmacologische effecten uitoefent om hart- en vaatziekten te voorkomen.

Dankbetuigingen

Niet toepasbaar.

Financiering

De huidige studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of china (grant no. 81503333).

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De datasets die tijdens het huidige onderzoek zijn gegenereerd en geanalyseerd, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.

auteurs' bijdragen

LG en XL bedachten en ontwierpen de experimenten. dL en YZ voerden de experimenten uit. WZ en JG hebben de gegevens geanalyseerd. LG heeft het manuscript opgesteld. XL heeft het manuscript beoordeeld en geredigeerd. Alle auteurs hebben het definitieve manuscript gelezen en goedgekeurd.

1202 GUet al: ECHINACOSIDE INDUCEERT STIKSTOFOXIDE PROdUcTIE DOOR AR-AFHANKELIJKE PI3K/AKT PATHWAY

Ethiek goedkeuring en toestemming tot deelnemen

Niet toepasbaar.

Geduldig toestemming voor publicatie

Niet toepasbaar.

Concurreren interesses

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Referenties

1. Chinese Farmacopee-commissie:CistancheHerba. In: Farmacopee van de Volksrepubliek China 1. kin. Med. Wetenschap. Pers, Peking, pp 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X en Zhang X: Echinacoside enCistanche tubulosa(Schenk)R. wight verbetert door bisfenol A geïnduceerde schade aan testikels en sperma bij ratten door middel van door de gonadenas gereguleerde steroïdogene enzymen. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, dong Y, Zhang B en Ma X: Echinacoside, een onschatbaar natuurlijk product bij de behandeling van neurologische en andere aandoeningen. Moleculen 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S en Muraoka O: Fenylethanoïde oligoglycosiden en geacyleerde oligosuikers met vaatverwijdende activiteit vanCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal cK, Katsuki S en Murad F: Stikstofmonoxide activeert guanylaatcyclase en verhoogt de guanosine-3':5'-cyclische monofosfaatspiegels in verschillende weefselpreparaten. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wuren TN, Lu dX, Zhou Y en Ge RL: antiproliferatief effect van echinacoside op gladde spiercellen van de longslagader van ratten onder hypoxie. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ en Tu PF: Echinacoside wekt endotheel-afhankelijke relaxatie op in aortaringen van ratten via een NO-cGMP-route. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y en Ge RL: Echinacoside induceert vasorelaxatie van de longslagader bij ratten door het openen van de NO-cGMP-PKG- BKca-kanalen en het verminderen van intracellulaire ca2 plus-niveaus. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y en Higashi Y: beoordeling van endotheelonafhankelijke vasodilatatie: van methodologie tot klinische perspectieven. J Hypertensie 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J en derivaat van endotheelcellen van de menselijke navelstrengader tegen oxidatieve stress-geïnduceerde schade: betrokkenheid van antioxidatie en PI3k/Akt/eNOS/NO-signaleringsroutes. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y en Okabe T: Src-kinase bemiddelt androgeenreceptor-afhankelijke niet-genomische activering van signaalcascade die leidt tot endotheliale stikstofoxidesynthase . Biochem Bioph Res commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y en Okabe T: Androgeenreceptor-afhankelijke activering van endotheel stikstofoxidesynthase in vasculaire endotheelcellen: rol van fosfatidylinositol {{3} }kinase/Akt-route. Endocrinologie 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F en Reno F: NO-afhankelijke proliferatie en migratie geïnduceerd door vitamine D in HUVEc. J Steroïde Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X en Xu X: Overexpressie van ontkoppelingseiwit 2 remt de hoge glucose-geïnduceerde apoptose van humane endotheelcellen van de navelstrengader. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z en Bing S: Icariin vertraagt ​​homocysteïne-geïnduceerde endotheliale cellulaire veroudering waarbij activering van de PI3K/AKT-eNOS-signaleringsroute betrokken is. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ en Klenk dc: Meting van eiwit met behulp van bicinchoninezuur. Anale Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H en Liu X: triterpenoïde biosynthese en de transcriptionele respons opgewekt door stikstofmonoxide bij fermentatie onder waterGanoderma lucidum. Proces Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellinsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY en Gutterman dd: van endotheel afgeleide hyperpolarisatie en coronaire vasodilatatie: diverse en geïntegreerde rollen van epoxy-icosatrieenzuur, waterstofperoxide en gap junctions. Microcirculatie 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK en Gutterman dd: communicatie is de sleutel: mechanismen van intercellulaire signalering bij vasodilatatie. J cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Fromy B en debret R: detectie van endotheelmicro-omgeving die leidt tot door stikstofmonoxide gemedieerde vasodilatatie: een overzicht van nerveuze en biomechanische signalen. Stikstofmonoxide 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, carreno dV, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS en Smith GJ: androgeenreceptor in menselijke endotheelcellen. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H en Gui YT: Niet-genomische werking van androgenen wordt gemedieerd door snelle fosforylering en regulatie van androgeenreceptorhandel. Celfysiol Biochem 43: 223-236,2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP en Ghedini Pc: activering van PI3K/Akt-route gemedieerd door oestrogeenreceptoren verklaart oestron-geïnduceerde vasculaire activering van cGMP-signalering. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z en Li P: antiosteoporotische activiteit van echinacoside bij ratten waarvan de eierstokken zijn verwijderd. Fytogeneeskunde 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y en Tu PF: identificatie van farmacologische doelen en analyse van de werkzaamheid van fenylethanoïde glycosiden uitCistanchesHerba gebaseerd op 'target fishing'-strategie. chin Tradit Kruidengeneesmiddelen 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM en Zhang X: Echinacoside verhoogt de hoeveelheid sperma bij ratten door zich te richten op de hypothalamische androgeenreceptor. Wetenschappelijk vertegenwoordiger 8: 3839-3850, 2018.

27. koffer PJ, Jin J en Woodgett JR: Proteïnekinase B (c-Akt): Een multifunctionele mediator van fosfatidylinositol 3-kinase-activering. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y en Qian J: Echinacoside verbetert de hematopoëtische functie bij 5-FU-geïnduceerde myelosuppressie-muizen. Leven Sci 123: 86-92, 2015.

29. chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W en Zhou H: beschermende effecten van echinacoside tegen anoxie / reperfusieschade in H9c2-cellen via opregulerende p-AKT en SLc8A3. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P en Su Y: de cruciale rol van Akt in de cardiovasculaire functie. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.