Cistanche Glyside Rg1 verbetert door veroudering geïnduceerde leverfibrose door remming van het NOX4/NLRP3-ontstekingsmasker in SAMP8-muizen

Abstract.Verouderinggaat vaak gepaard metLever letselEnfibrose, uiteindelijk leidend tot een daling vanlever functie. Het mechanisme vandoor veroudering veroorzaakte leverbeschadigingEnfibrosewordt nog steeds niet volledig begrepen, voor zover wij weten, en er zijn momenteel geen effectieve behandelingsopties beschikbaar voor leververoudering. Van Cistanche Glycoside Rg1 (Rg1) is gemeld dat het krachtige anti-verouderingseffecten heeft vanwege zijn krachtige antioxiderende en ontstekingsremmende werking. De huidige studie was gericht op het onderzoeken van het beschermende effect en het onderliggende werkingsmechanisme van Rg1 indoor veroudering veroorzaakte leverbeschadigingEnfibroseinveroudering — versneldmuis gevoelig 8 (SAMP8) muizen behandeld gedurende 9 weken.

Klik hier voor meer informatie over Cistanche Anti-verouderingsbehandeling voor de lever

De histopathologische resultaten toonden aan dat de rangschikking van hepatocyten verstoord was, vacuole-achtige degeneratie optrad in de meerderheid van de cellen, en collageen IV en TGF- 1-expressieniveaus, die werden gedetecteerd via immunohistochemie, waren ook significant opgereguleerd in de SAMP8-groep. Rg1-behandeling aanzienlijk verbeterddoor veroudering veroorzaakte leverbeschadiging en fibrose, en verminderde de expressieniveaus van collageen IV en TGF aanzienlijk; 1. Bovendien toonden de dihydro-ethyleenkleuring en Western-blotting-resultaten aan dat Rg1-behandeling de niveaus van reactieve zuurstofspecies (ROS) en IL-1 aanzienlijk verlaagde , en verlaagde de expressieniveaus van NADPH-oxidase 4 (NOX4), p47phox, p22phox, gefosforyleerd-NF-κB, caspase-1, apoptose-geassocieerd stip-achtig eiwit met een C-terminaal caspase-recruteringsdomein en het NLR-familiepyrine-domein met 3 (NLRP3) ontstekingsmasker, die significant waren opgereguleerd in de leverweefsels van oudere SAMP8-muizen. Concluderend suggereren de bevindingen van de huidige studie dat Rg1 kan verzwakkendoor veroudering veroorzaakte leverbeschadiging en fibrosedoor NOX4-gemedieerde ROS-oxidatieve stress te verminderen en NLRP3-inflammasoomactivering te remmen.

Invoering

Leverfibrose is een dynamisch proces dat verband houdt met de continue afzetting en resorptie van de extracellulaire matrix, voornamelijk fibrillair collageen (3), wat vaak de eerste stap is in architecturale vervorming en disfunctie die de normale werking van de lever verhindert (4). Indien onbehandeld, kan leverfibrose leiden tot vergevorderde levercirrose en hepatoom (4). Steeds meer bewijs suggereert dat de gevoeligheid voor leverfibrose en hepatitis aanzienlijk toeneemt met de leeftijd (5). Het blijft dus van groot belang om leververoudering en de bijbehorende onderliggende mechanismen te bestuderen om nieuwe strategieën te bieden om verouderingsgerelateerde leverfibrose te voorkomen.7

herkenningsreceptor van caspase-1 en apoptose-geassocieerd stip-achtig eiwit dat een C-terminaal caspase-rekruteringsdomein (ASC) bevat. Volgens de bevinding van eerdere studies werd ontdekt dat het NLRP3-ontstekingsmasker, een type ontstekingsmasker dat alom aanwezig is in tal van weefsels, waaronder de lever, betrokken is bij de evolutie van leverfibrose en de progressie van leverbeschadiging en leeftijdsgebonden leverziekte ( 20‑22). Wanneer geactiveerd door diverse irriterende stoffen, zoals ATP- en cholesterolkristallen, evenals bacteriële, virale en schimmelpathogenen (23,24), reageert het NLRP3-ontstekingsmasker op ontsteking door de rijping van een reeks pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1, te bevorderen. en IL-18 (25). Bovendien is gemeld dat overmatige ROS-accumulatie het NLRP3-ontstekingsmasker in de lever activeerde tijdens het verouderingsproces, wat uiteindelijk leidde tot met veroudering geassocieerde leverziekte (26).

materialen en methodes

Animals and treatment. In total, 9 male senescence‑accelerated resistant mouse 1 (SAMR1) and 45 male SAMP8 mice (both age, 6 months; weight, 30‑40 g) were purchased from the Department of Experimental Animal Science, Peking University Medical Science Center (Beijing, China). The mice were maintained in an environmentally controlled room (temperature, 22‑25˚C; relative humidity, 50‑70%) under a 12‑h light/dark cycle with unlimited access to food and water. The SAMP8 mice were randomly divided into five groups (n=9 in each group): i) SAMP8 model group; ii) SAMP8 + apocynin (50 mg/kg) group; iii) SAMP8 + tempol (50 mg/kg) group; iv) SAMP8 + Rg1 (5 mg/kg) group; v) SAMP8 + Rg1 (10mg/kg) group; and vi) SAMR1 mice group, which were used as the control group. The treatments were administered intragastrically (0.1 ml/10 g body weight), and the mice treated with either apocynin (MilliporeSigma), tempol (MilliporeSigma) or Rg1 (content >98 procent; Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.) eenmaal per dag gedurende 9 weken. De SAMP8- en SAMR1-groepen werden gedurende 9 weken behandeld met gedestilleerd water. Na 9 weken behandeling werden zes muizen in elke groep opgeofferd via cervicale dislocatie. De levers werden geoogst en bewaard bij -80˚C voor later gebruik in western blotting-experimenten, of

boekdeel (Leica CM3050; Leica Microsystems GmbH) bij -20˚C. De secties werden gewassen met PBS en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met 5 mg/l Hoechst 33258-oplossing (Sigma-Aldrich; Merck KGaA). Vervolgens werden de secties afgesloten met een anti-fluorescentie doofmiddel (Beyotime Institute of Biotechnology) en gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Olympus IX72; Olympus Corporation; vergroting, x400). Image Pro Plus 6.0-software (Media Cybernetics, Inc.) werd gebruikt om de gemiddelde dichtheid van rode fluorescentie te detecteren uit drie willekeurig geselecteerde gezichtsvelden in elke sectie om ROS-productie aan te geven.

Pathologisch onderzoek van het leverweefsel.

De morfologische veranderingen in de lever werden onderzocht met behulp van H&E, perjoodzuur-Schiff (PAS) en Masson's trichroomkleuringstechnieken. H&E-kleuring is de meest gebruikelijke methode voor het observeren van pathologische veranderingen in weefsels (38). In het kort: leverspecimens werden gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde gedurende 24-48 uur, gedehydrateerd en in paraffine ingebed, en vervolgens in secties van 5 µm dik gesneden. Levercoupes (n=4) werden van paraffine ontdaan in xyleen en gerehydrateerd in gegradeerde alcoholreeksen (watervrije ethanol, 85 procent ethanol, 75 procent ethanol), vervolgens gekleurd met hematoxyline gedurende 3 minuten en eosine gedurende 30 seconden. Al deze stappen werden bij kamertemperatuur uitgevoerd. De secties werden afgesloten met neutrale hars en geobserveerd met behulp van een lichtmicroscoop (Olympus IX72; Olympus Corporation; vergroting, x200).

Immunohistochemische kleuring.

De in paraffine ingebedde secties (n=4) werden gedeparaffineerd en gerehydrateerd, volgens de methode beschreven voor H&E-kleuring. Vervolgens werden de secties geïncubeerd met 3 procent H2O2 gedurende 10 minuten bij 37 °C om de endogene peroxidase-activiteit te blokkeren voordat ze gedurende 7 minuten in kokende natriumcitraatbuffer in een magnetron werden ondergedompeld om antigeen op te halen. De secties werden vervolgens geïncubeerd met 10 procent geitenserum (cat. nr. C0265; Beyotime Institute of Biotechnology) bij 37 °C gedurende 30 minuten om niet-specifieke binding te blokkeren. De secties werden vervolgens gedurende de nacht bij 4 °C geïncubeerd met de volgende primaire antilichamen: Polyklonaal anti-collageen IV van konijn (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat.nr. BS1072), polyklonaal anti-NLRP3 van konijn (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. nr. BS90949) en konijnen polyklonaal anti-TGF-1 (1:100; Abcam; cat. nr. ab92486).

Western-blotten.

Totaal eiwit werd geëxtraheerd uit leverweefsels (n{{0}}) met behulp van RIPA-lysisbuffer (cat.nr. P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) en een automatische snelslijpmachine voor monsters (Jinxing Industrial Development Co., Ltd. .) bij 65 Hz gedurende 60 sec bij 4˚C. Het totale eiwit werd gekwantificeerd met behulp van een BCA-eiwitassaykit en de eiwitten (20 µg) werden gescheiden via 8-15 procent SDS/PAGE. De gescheiden eiwitten werden vervolgens overgebracht op PVDF-membranen (MilliporeSigma) en geblokkeerd met 5 procent magere melk in TBS-0,05 procent Tween-20 (TBST)-buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De membranen werden vervolgens een nacht bij 4 °C geïncubeerd met de volgende primaire antilichamen: Anti-NLRP3 (1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat.nr. BS90949), anti-ASC (1:1 ,000; BIOSS; cat.nr. bs‑67412‑R), anti‑caspase‑1(1:1,000; Abcam; cat.nr. ab1872), anti‑IL‑1 (1:500; Abcam;cat.nr. ab9722), anti‑NOX4 (1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat.nr. BS60435), anti‑p47phox (1:1,{ {40}}; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat.nr. BS4852), anti‑p22phox (1:1,000;Bioworld Biotechnology, Inc.; cat.nr. BS60290), anti‑NF‑KB p65 (1:1,000; Wuhan Service Technology Co., Ltd.;

Na de incubatie van het primaire antilichaam werden de membranen driemaal gewassen met TBST (elke keer 10 min) en geïncubeerd met HRP-geconjugeerd geit-anti-konijn-IgG (1:10,000; Affinity Biosciences; cat.nr. S 0001) en geiten-antimuis-IgG (1:10.000 Affinity Biosciences; cat.nr. S0002) secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Eiwitbanden werden gevisualiseerd met behulp van een ECL-kit (Bio-Rad Laboratories, Inc.) en een Bioshine Chemi Imaging System (Q4600 Mini; Shanghai Bioshine Technology). De optische dichtheid van elke band werd semi-gekwantificeerd met behulp van ImageJ 1.53a-software (National Institutes of Health) en genormaliseerd naar GAPDH-expressie.

Statistische analyse.

Alle gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD van groter dan of gelijk aan 3 onafhankelijke experimenten. GraphPad Prism 8.0-software (GraphPad Software, Inc.) werd gebruikt om de statistische analyses uit te voeren. Eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest werd uitgevoerd om verschillen tussen groepen te vergelijken. P< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Resultaten

onderzoeken of Rg1 verouderingsgerelateerde leverfibrose verlicht, collageenafzetting werd gemeten in leverweefsels met behulp van Masson's kleuring. De resultaten toonden aan dat de blauwe positieve gebieden significant waren toegenomen in de leverweefsels van de SAMP8-groep in vergelijking met de SAMR1-groep (Fig. 2A en B). In vergelijking met de SAMP8-modelgroep waren de niveaus van collageenafzetting echter significant verlaagd in de behandelgroepen tempol, apocynine en Rg1 (5 en 10 mg/kg) (Fig. 2A en B). Bovendien werden de expressieniveaus van collageen IV en TGF-1 gemeten in leverweefsels met behulp van immunohistochemische kleuring.

De resultaten van de collageen IV-kleuringen onthulden dat collageen IV op lage niveaus tot expressie werd gebracht in de leverweefsels in de SAMR1-groep (Fig. 3A en C). Echter, vergeleken met de SAMR1-groep,

Rg1-behandeling vermindert de ROS-productie en NOX4-expressie in de lever van SAMP8-muizen. ROS is een belangrijke factor in de ontwikkeling van leverfibrose (41). In de huidige studie werd een ROS-sonde, DHE, gebruikt om het niveau van ROS-productie in leverweefsels te detecteren. De resultaten toonden aan dat er lage niveaus van ROS-productie waren in de leverweefsels van de SAMR1-groep. In vergelijking met de SAMR1-groep waren de niveaus van ROS-productie echter significant verhoogd in de SAMP8-groep (Fig. 4A en B), terwijl in vergelijking met de SAMP8-groep de behandeling met tempol, apocynin en Rg1 (5 en 10 mg / kg) significant was verminderde de niveaus van ROS-productie in de leverweefsels (Fig. 4A en B). Om het effect van NOX4 op ROS-accumulatie tijdens veroudering te bevestigen, werden de expressieniveaus van NOX4-gerelateerde eiwitten geanalyseerd. De resultaten toonden aan dat, vergeleken met de SAMR1-groep, de expressieniveaus van NOX4, p22phox en p47phox in de leverweefsels significant opgereguleerd waren in de SAMP8-groep (Fig. 5A-D).

Vergeleken met de SAMP8-groep verlaagden behandeling met tempol, apocynine en Rg1 (5 en 10 mg/kg) echter significant de expressieniveaus van NOX4, p22phox en p47phox in leverweefsels tijdens veroudering (Fig. 5A-D). Deze gegevens suggereerden dat Rg1-behandeling ROS-geïnduceerde oxidatieve stressschade in leverweefsels kan verbeteren door NOX4 tijdens veroudering bij muizen te remmen.