Cistanche-polysacchariden verbeteren de absorptie van echinacoside in vivo en beïnvloeden de darmmicrobiota

Contactpersoon: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu, et al

Abstract

De polysachariden enfenylethanoïde glycosidenvanCistanche deserticolawaarvan is aangetoond dat ze verschillende gezondheidsvoordelen hebben, maar het interactieve effect tussen deze twee soorten verbindingen in vivo is niet in detail bekend. Het doel van deze studie was om de synergetische werking van cistanche polysachariden met fenylethanoïde glycoside en de effecten van polysachariden op de darmflora te onderzoeken. Sprague-Dawley-ratten kregen gedurende 20 dagen verschillende soorten cistanche-polysacchariden, op de laatste dag kregen alle ratten deechinacosidebij 100 mg/kg. De resultaten werden voornamelijk vergeleken op het verschil in farmacokinetische parameters, de samenstelling van de darmmicrobiota en het gehalte aan korteketenvetzuren. De resultaten gaven aan dat alle cistanche polysachariden, inclusief ruwe polysachariden, hoogmoleculairgewicht polysachariden, en polysachariden met een laag molecuulgewicht, zouden de diversiteit van de darmmicrobiota kunnen reguleren, nuttige bacteriën kunnen verhogen en in het bijzonder de groei van Prevotella spp. evenals de productie van vetzuren met een korte keten en de opname van echinacoside verbeteren. Door de synergetische werking van polysachariden met kleine moleculen te onderzoeken, suggereren deze bevindingen dat cistanche-polysachariden, met name polysachariden met een laag molecuulgewicht, kunnen worden gebruikt als een manipulator van de darmmicrobiota voor gezondheidsbevordering.

trefwoorden:CistanchedeserticolapolysacharideEchinacosideDarmmicrobiota

Klik hier voor meer informatie over cistancheproducten

1. Inleiding

In de afgelopen jaren is het duidelijk geworden dat polysachariden de samenstelling van de darmmicrobiota moduleren en dat veranderingen meerdere voedingsopnames kunnen mediëren [1], waardoor een fysiologische functie ontstaat [2,3]. Van polysachariden uit de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) is aangetoond dat ze ideale kandidaten zijn voor de regulatie van de darmmicrobiota en prebiotische effecten vertoonden. In het spijsverteringskanaal vertonen de polysachariden en enig contact met kleine moleculaire verbindingen onvermijdelijk enige effecten op biologische activiteiten [4]. Als een van de belangrijkste actieve ingrediënten in Panax-ginseng, die al duizenden jaren op grote schaal wordt gebruikt, vertoonden de polysachariden een goedeverbeteringin deintestinaalmetabolismeenabsorptievanginsenosidenin vivo [5]. Codonopsis pilosula-polysacchariden toonden het bevorderende effect van de absorptie van saponinen in muizen met door dextraansulfaat-natrium geïnduceerde colitis-muizen [6]. Ganoderma lucidum polysachariden, vooral de fractie met een hoog molecuulgewicht, blekenprebiotischfunctiesin muizenmodellen met een hoog vetdieet-geïnduceerde darmdysbiose [7]. Longan-polysacchariden reguleerden de darmmicrobiota en de darmmetabolieten (verhogen van de inhoud van pyruvaat en butanoaat) om immunomodulerende activiteiten te produceren [8].

Cistanche deserticola, als traditionele Chinese geneeskunde, wordt in China veel gebruikt als voedingssupplement. Farmacologische studies hebben aangetoond dat hetneuroprotectief, immunomodulerende, hormonaalbalanceren, anti-vermoeidheid, anti-opruiend, hepatoprotectie,anti-oxidatief, anti-bacterieel, anti-viraal, enanti-tumoreffecten [9]. Chemische analyse toonde aan dat fenylethanoïde glycosiden en polysachariden de belangrijkste actieve bestanddelen waren. Echinacoside, het belangrijkste fenylethanoïde glycoside in C. deserticola, heeft een brede farmacologische werking laten zien, maar de geneesmiddelbaarheid ervan is beperkt vanwege de slechte biologische beschikbaarheid, het snelle en uitgebreide metabolisme in vivo. Studies hebben aangetoond dat echinacoside in vitro kan worden gemetaboliseerd door de darmmicrobiota [10,11]. Het bewijs in vivo is echter niet onderzocht. Zoals we weten, speelde de darmmicrobiota een belangrijke rol bij het mediëren van de metaboliserende bioactiviteit van kruidengeneesmiddelen. Daarom was het belangrijkste doel van dit werk om de invloed vancistanche polysacharidenop de darmflora en de effecten op het metabolisme van echinacoside.

2. materialen en methoden

2.1. Materialen en chemicaliën

Cistanche deserticola YC Ma werd verkregen van Alashan, Inner Mongolia Mandela sand industry development Co., LTD, China. Ze werden geauthenticeerd door professor Lijuan Zhang (Tianjin University of Traditional Chinese Medicine). Een voucher-exemplaar werd in ons laboratorium gedeponeerd. De standaardstof zoals echinacoside, acteoside en chlorogeenzuur werd verkregen van het National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (Beijing, China). De zuiverheid van elke standaard was groter dan of gelijk aan 98 procent. Acetonitril en methanol van chromatografiekwaliteit werden gekocht bij Fisher Scientific (Pitts burgh, PA). Mierenzuur werd gekocht bij Anaqua Chemical Supply Inc. (Wilmington, VS). De andere chemische reagentia waren van analytische kwaliteit en gekocht bij Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China).

Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (200-220 g) werden geleverd door Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Beijing, China, licentienummer SCXK (Jing) 2014- 0004). Alle dieren werden gefokt en gehuisvest onder SPF-omstandigheden in de dierenfaciliteit. Het experiment werd uitgevoerd volgens de richtlijnen opgesteld door de dierenzorg en maakt gebruik van een commissie van TJUTCM en conform de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH-publicatie nummer 85-23, herzien 1996 ). Na een acclimatiseringsperiode van 1 week werden ratten willekeurig verdeeld in vier groepen: controlegroep, totale polysacharidegroep, hoogmoleculaire polysacharidegroep en laagmoleculaire polysacharidegroep. Elke groep bestond uit 6 ratten, die in dezelfde kooi werden gefokt.

2.2. Cistanche polysachariden voorbereiding

3.0 kg Cistanche deserticola YC Ma werd gereinigd en gedroogd op 40 graden in de luchtdroogoven, daarna werd vermalen tot een grof poeder. Het droge, grove poeder werd tweemaal geëxtraheerd met 85 procent waterige ethanol (v/v) bij 60 graden en telkens 2 uur. De vast-vloeistofverhoudingen waren respectievelijk 1:12 en 1:10. De kruidenresten werden nog twee keer geëxtraheerd met water op 100 graden, de extractietijd en vast-vloeistofverhoudingen waren hetzelfde met 85 procent ethanol. De waterige oplossing werd gecombineerd en onder verminderde druk geconcentreerd en vervolgens geprecipiteerd in 80% ethanol, gedurende 24 uur bij 4°C staan. Het precipitaat werd geïsoleerd door middel van centrifugatie bij 8000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 graden en vervolgens gevriesdroogd om de totale polysachariden (ZT) te verkrijgen. ZT werd vervolgens opgelost in gedeïoniseerd water en gefiltreerd op een 100 kDa holle vezel ultrafiltratiemembraan, de retentieve infiltraat hoogmoleculaire polysachariden (HM) werden verzameld. Het gepermeeerde filtraat werd gefiltreerd met een ultrafiltratiemembraan van 6 kDa. De retentieve filtraat middenmoleculaire polysachariden (MM) en de gepermeeerde filtraat laagmoleculaire polysachariden (LM) werden verkregen.

2.3. Primaire karakterisering van cistanche polysachariden

Het gehalte aan polysachariden werd bepaald met de zwavelzuurfenolmethode met glucose als standaard [12]. Het totale eiwitgehalte werd bepaald met de BCA-methode [13]. De analyse van de monosaccharidesamenstelling werd uitgevoerd door HPLC (UltiMate 3000-systeem) uitgerust met een SinoPak C18-kolom (5 m, 150 mm x 4,6 mm) en diode-arraydetector (VWD-3000). De chromatografische scheiding van PMP (1-fenyl-3- methyl-5-pyrazolon) pre-kolomderivaten werd uitgevoerd met 100 mM fosfaatbuffer en acetonitril in een verhouding van 82:18 (v/v , procent) als mobiele fase bij een stroomsnelheid van 1,0 ml/min. Van elk monster werd 10 L geïnjecteerd en er werd een analyseduur van 30 minuten met detectie bij 245 nm gebruikt. Gegevensverzameling en -verwerking werden uitgevoerd met Chromeleon Software 7.1 (Dionex, Sunnyvale, CA, VS).

Het molecuulgewicht (Mw) werd bepaald door middel van high-performance size-exclusiechromatografie (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0-systeem), uitgerust met een TSK-gel G3000 PWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japan) en TSK-gel GMPWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japan) kolom en een RefractoMax521-brekingsindexdetector (RID). De monsters werden geëlueerd met 0,1 mol/L Na2S04 met een stroomsnelheid van 0,5 ml/min. De temperatuur van de kolom werd op 35 graden gehouden. Dextran als de standaarden en de standaardcurve werden uitgezet volgens de elutietijd uitgezet tegen de logaritme van het molecuulgewicht.

2.4. Farmacokinetische studie

Bloedmonsters werden verzameld uit de binnenste ooghoek om {{0}} h, 0.083 h, 0.167 h, 0.25 u, 0,5 u, 0,75 u, 1.0 u, 2.0 u, 3.{{20}} h, 4.0 h, 6.0 h, 8.0 h, 10 h, 12 h en 24 h na toediening van echinacoside (100 mg/kg). Plasmamonsters werden verkregen door gedurende 10 minuten bij 7500 pm te centrifugeren. Aan 100 L van het plasmamonster werd 10 μL IS (chlorogeenzuur) oplossing en 500 μL methanol toegevoegd. Het mengsel werd vervolgens 3 min gevortext en 10 min gecentrifugeerd bij 14 000 rpm. Het supernatant werd verzameld en bij kamertemperatuur in stikstof gedroogd. Vervolgens werd het residu opgelost in 100 L 50 procent waterige methanol, opnieuw 10 minuten gecentrifugeerd bij 14 000 rpm. Ten slotte werd 3 L van het supernatant voor analyse in het LC-MS/MS-systeem geïnjecteerd. De monsters werden geanalyseerd met behulp van de methode volgens een eerder gerapporteerde. De mobiele fase bestond uit CH3CN (oplosmiddel A) en H2O (met 0,1 procent HCOOH; oplosmiddel B) met de volgende gradiënt: 0-1 min, 10 procent A; 1–8 min, 10-90 procent A; 8–9 min, 90–10 procent A; 9-11 min: 10 procent A. Het monster werd gescheiden op de ACQUITY HSS T3-kolom (1,8 m, 100 mm x 2,1 mm id). De stroomsnelheid was 0,3 ml/min en de kolomtemperatuur was ingesteld op 35 graden. In de MS-analyse werd de negatieve ionisatiemodus gebruikt, met de volgende geoptimaliseerde parameters: capillaire spanning, 2,5 kV; desolvatietemperatuur, 450 graden. Stikstof werd gebruikt als desolvatie- en kegelgas, met een stroomsnelheid van respectievelijk 900 L/h en 150 L/h. Kwantificering werd dus uitgevoerd met behulp van MRM van de overgangen van m/z 785,29 → 623,26 voor echinacoside, m/z 353,06 → 191,07 voor chlorogeenzuur (IS), m/z 623,24 → 161,09 voor acteoside. De kegelspanning voor echinacoside, IS en acteoside was 100 V, 32 V en 74 V; botsingsenergie, 32 V, 14 V en 30 V.

2.5. Onderzoek naar korteketenvetzuren (SCFA's)

Mannelijke Sprague-Dawley-ratten kregen gedurende 3 weken oraal ZT, HM en LM toegediend. Bepaling van SCFA's (azijnzuur, propionzuur, isoboterzuur, boterzuur, isovalerinezuur, valeriaanzuur en hexaanzuur) door middel van gaschromatografie (GC) werd gedaan zoals eerder beschreven met enkele aanpassingen [14]. In het kort werd 0,5 g fecaal monster gedispergeerd in 2,5 ml Milli-Q-water, 10 min. gevortext en 7,5 ml 1 procent HCl/ethanoloplossing met interne standaarden (boterzuur 24,0 ug /mL en 2- ethylhexaanzuur 1,32 ug/ml als interne standaarden) werden toegevoegd. De mengsels werden 5 min gehomogeniseerd en 10 min gecentrifugeerd bij 14,000 rpm bij 4 graden. Vijf microliter supernatant werd in gesplitste modus geïnjecteerd in een verhouding van 30:1. Het dragergas was N2 (99,999 procent) bij 1 ml/min. Het suppletiegas (N2) was 25 ml/min. De stroomsnelheid van H2 en lucht was respectievelijk 30 ml/min en 300 ml/min. Fecale monsters werden verzameld op de 20e dag van dit onderzoek en onmiddellijk bewaard bij -80 graden.

2.6. Ontlastingverzameling, DNA-extractie en 16S rRNA-gensequencing

Ongeveer 200 mg van een vers fecaal monster werd verzameld in een steriele Eppendorf-buis van 1,5 ml per rat en bewaard bij -80 graden voor latere DNA-bereiding. DNA werd uit de ontlasting geëxtraheerd met behulp van de QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN). De hoeveelheid DNA werd bepaald met behulp van een NanoDrop-spectrofotometer (Thermo Electron Corporation); de integriteit en grootte werden gecontroleerd door 1,0 procent agarosegelelektroforese. Afhankelijk van de concentratie werd het DNA met steriel water verdund tot 1 ng/μL.

16S-rRNA werd geamplificeerd met behulp van een specifieke primer (V4: 515F-806R) met de streepjescode. Alle PCR-reacties werden uitgevoerd met Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). Meng gelijk volume van 1 × laadbuffer (bevat SYB groen) met PCR-producten en gebruik elektroforese op 2 procent agarosegel voor detectie. De heldere hoofdstroken tussen 400 en 450 bp werden gekozen voor verdere experimenten. PCR-producten werden gemengd in EU-dichtheidsverhoudingen. Vervolgens werd een mengsel van PCR-producten gezuiverd met Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Duitsland).

Sequentiebibliotheken werden geconstrueerd met behulp van TruSeq® DNA PCR Free Sample Preparation Kit (Illumina, VS) volgens de aanbevelingen van de fabrikant en indexcodes werden toegevoegd. De bibliotheekkwaliteit werd beoordeeld op de Qubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) en het Agilent Bioanalyzer 2100-systeem. De sequentie van de bibliotheek werd bepaald op een Illumina HiSeq 2500-platform en er werden 250 bp gepaarde einduitlezingen gegenereerd.

2.7. Bioinformatica analyse

Het afsnijden van de streepjescode en primervolgorde, het samenstellen van de volgorde en de gegevensfiltratie volgens de QIIME (V 1.7.0). Sequenties met een overeenkomst van meer dan of gelijk aan 97 procent werden toegewezen aan dezelfde OTU's. De OTU's zijn geannoteerd als SILVA-labels. De alfa-diversiteitsindices die de rijkdom van de darmmicrobiële gemeenschap evalueren (de ACE- en Chao1-statistieken) en de gemeenschapsdiversiteit (de Shannon- en Simpson-metrieken) werden berekend met behulp van Qiime (versie 1.9.1). Bèta-diversiteitsanalyse werd gebruikt om de structurele variaties van de microbiële gemeenschappen te onderzoeken met behulp van UniFrac-afstand. Verschillen tussen alle groepen werden getest door de Tukey-test en de Wilcox-test. De belangrijkste coördinatenanalyse (PCoA) werd toegepast om de verschillen in samenstelling tussen de vier groepen te verklaren met behulp van R-pakketten. De lineaire discriminantanalyse-effectgrootte (LEfSe) -methode is specifiek ontworpen voor het ontdekken van biomarkers en het verklaren van sequentiegegevens. En lineaire discriminantanalyse (LDA) werd gebruikt om de effectgrootte van elke differentieel darmmicroben en de kenmerken die bij elke groep ratten horen, te berekenen. De correlatieanalyse werd geïmplementeerd met behulp van R-pakketten gcorrplot (versie 1.1.463).

SCFA's-gegevens werden geanalyseerd met behulp van de ANOVA van SPSS 22.0.

3. Resultaten en discussie

3.1. Bereiding en chemische analyse van cistanche-polysachariden

Cistanches Herba wordt in China zowel als voedsel als als medicijn gebruikt. De daaruit geïsoleerde polysachariden hebben veel aandacht getrokken vanwege hun belangrijke activiteiten. In deze studie werden de vier delen van cistanche-polysacchariden (ZT, HM, MM en LM) verkregen door de methode van waterextractie, alcoholprecipitatie en ultrafiltratie. De chemische samenstellingen van vier delen polysachariden worden weergegeven in Tabel 1.

Totaal suikergehalte van de monsters met behulp van een standaardcurve van glucose. Het resultaat toonde aan dat de opbrengsten van HM en LM hoger waren dan die van MM. Polysachariden vertoonden diverse farmacologische eigenschappen, vooral immuunactiviteit. Studies hebben aangetoond dat het monosacharidegehalte en type, molecuulgewicht, type substituentgroep een belangrijke rol spelen bij de activiteiten van polysachariden [15]. De verschillende delen van de monosacharidesamenstelling van cistanchepolysachariden waren vergelijkbaar, en mannose (Man), galacturonzuur (GalUA), glucose (Glc), galactose (Gal) en arabinose (Ara) waren de belangrijkste monosachariden.

De inhoud was echter verschillend tussen de vier delen. Glucose en arabinose waren de belangrijkste componenten van ZT en HM, terwijl glucose de belangrijkste suikereenheid van LM was, bovendien werd in deze fracties ook weinig rhamnose en glucuronzuur (GlcUA) gedetecteerd.

De relatieve molecuulgewichten van de monsters werden onderzocht met high-performance size-exclusiechromatografie (HPSEC). Volgens de standaardcurve van de dextranen en retentietijd in de kolommen werden de belangrijkste piekmolecuulgewichten in ZT waargenomen bij 1,68 × 106 Da en 1,70 × 104 Da, in HM werd vastgesteld dat ze 1,54 × 106, 2,06 × 105 waren, en 4,81 × 104, in MM en LM werden vastgesteld op respectievelijk 1,09 × 104 en 2,05 × 104. De opbrengsten ervan werden vermeld in Tabel 1 en de opbrengst aan MM was laag en niet genoeg voor het dierexperiment. Eerdere studies hebben de structuurafhankelijke effecten van cistanche-polysacchariden op diverse biologische activiteiten aangetoond [16]. Verdere experimenten zijn nog steeds nodig, met name zuivering, Fifine-structuuranalyse moet worden toegepast voor het structuur-activiteitsonderzoek

3.2. Onderzoek naar farmacokinetiek

De farmacokinetiek van het echinacoside werd onderzocht door middel van ultra-high-performance vloeistofchromatografie triple quadrupool massaspectrometrie (UPLC en Xevo TQ-S) na orale toediening van echinacoside. De gemiddelde plasmaconcentratie-tijdprofielen van echinacoside werden getoond in Fig. 1. Volgens de software voor geneesmiddelen en statistieken (DAS, versie 2.0) past de farmacokinetiek van echinacoside in een model met één compartiment en het andere parameters in ZT-, HM- en LM-groepen zijn samengevat in Tabel 2, inclusief de tijd om de maximale concentratie (Tmax), maximale concentratie (Cmax), oppervlakte onder de concentratie-tijdcurve (AUC) en gemiddelde verblijftijd (MTR) te bereiken. ). Een farmacokinetisch onderzoek toonde aan dat de gemiddelde Cmax van echinacoside in de ZT-, HM- en LM-groepen 646,4 ng/ml, 732.0 ng/ml en 898,4 ng/ml was, die 1,6, 1,8 en 2,2 waren. keer vergeleken met de controlegroep (406,8 ng/ml), respectievelijk. Door voorbehandeling met polysachariden werd de AUC(0-24} h) van echinacoside respectievelijk verhoogd met 6,6 procent, 36,7 procent en 63,6 procent in de ZT-, HM- en LM-groepen, vergeleken met de controlegroep, wat aantoonde dat de polysachariden vertoonden de activiteit van het bevorderen van de absorptie van een klein molecuul. Deze resultaten waren vergelijkbaar met die van de chitooligosacchariden die de biologische beschikbaarheid van fenylethanoïde glycosiden in Fructus Forsythia-extract verbeterden [17] en de polysacchariden van Polygonum multiflorum de biofarmaceutische eigenschappen van 2, 3, 5, 4′-tetrahydroxy-stilbeen verbeterden- 2- O- -D-glucoside bij normale Sprague-Dawley-ratten [18]. Darmmicrobiota bevat een verscheidenheid aan geneesmiddelmetaboliserende gerelateerde enzymen en de mechanismen van de microbioom vormen de farmacokinetiek en farmacodynamiek van geneesmiddelen zijn nog onbekend [19]. Polysachariden kunnen de darmflora voeden door het immuunsysteem te versterken, voedingsstoffen te absorberen en de groei van ziekteverwekkers te verminderen [20,21]. Hoewel de literatuur meldde dat cistanche-polysachariden de metabolieten van echinacoside (zoals acteoside) in vitro zouden kunnen verhogen, vonden we niet dat de naast elkaar bestaande polysachariden gunstig waren voor de omzetting van echinacoside in acteoside in vivo [10,11].

3.3. SCFA's-gehalte in uitwerpselen van ratten

Darmmicrobiota gefermenteerde polysachariden, die verschillende bioactieve polymeren en metabolieten produceren, zoals SCFA's [3]. Als belangrijkste metabolieten van polysachariden werden SCFA's geanalyseerd in de feces. Van de SCFA's, waaronder azijnzuur, propionzuur en butyraat, is gemeld dat ze gunstige effecten hebben op het glucose-, cholesterol- en lipidenmetabolisme. Acetaat is de belangrijkste SCFA's in de dikke darm en is een belangrijk substraat voor cholesterolsynthese, propionaat is een substraat voor gluconeogenese in de lever en butyraat is het geprefereerde energiesubstraat van colonocyten en werkt ontstekingsremmend in de darm [22,23].

Onze resultaten toonden aan dat acetaat de belangrijkste SCFA's waren die in de feces werden gevormd voor alle groepen, gevolgd door butyraat en propionaat, terwijl de concentratie van valeraat en vertakte SCFA's (isoboterzuur en isovalerinezuur) lager was. Het is aangetoond dat het acetaat de enzymactiviteit in het leverweefsel verhoogt, wat resulteert in een betere controle van de bloedsuikerspiegel [24]. Op de 20e dag (Fig. 2) had de LM-groep een significant hoger niveau van acetaat (pb 0,05), het aandeel propionaat had de neiging af te nemen en het aandeel butyraat nam toe, hoewel de verandering was onbeduidend in de ontlasting in vergelijking met de controlegroep.

De HM-groep had echter een significant lager aandeel butyraat dan de controlegroep (pb 0.05). De inhoud van de totale SCFA's tussen LM en HM was tegengesteld aan de trend in vergelijking met de controlegroep en alleen de LM-groep had een significant verschil.

Veel factoren beïnvloeden het niveau van SCFA's in de ontlasting, waaronder de samenstelling en de hoeveelheid darmmicrobiota, de voedingsbron en de tijd die het voedsel nodig heeft om door het spijsverteringskanaal te gaan [22]. Accumulerende studies tonen aan dat de structuur van polysachariden, met inbegrip van de samenstelling van monosacharideresiduen, de mate van polymerisatie, beide de fermentatie-eigenschappen en de productie van SCFA's kunnen beïnvloeden [25]. Uit onze resultaten kunnen we concluderen dat cistanche-polysachariden de productie van SCFA's moduleren en dat polysachariden met verschillende structuren een ander effect hebben.

3.4. Cistanche-polysacchariden veroorzaakten kernveranderingen in samenstelling en diversiteit van darmmicrobiota

De bacteriële samenstelling van de fecale monsters (n=4) werd onderzocht met behulp van een Illumina high-throughput sequencing-techniek. De bibliotheek werd gesequenced op een Illumina HiSeq2500-platform en 250 bp gepaarde-end reads werden geproduceerd. Ze werden verwerkt voor taxonomische identificatie en diversiteitsanalyse. Rarefactiecurven (Fig. 3a) toonden aan dat voor elk monster de rijkdom aan bacteriële soorten afnam naarmate de bemonsteringsdiepte toenam, wat aangeeft dat de sequencing-inspanning voldoende was en dat de totale diversiteit binnen het monster werd vastgelegd. De Shannon-curve (figuur 3b) toonde aan dat het aantal unieke bacteriesoorten toenam naarmate het aantal geïdentificeerde sequenties toenam. Verzadiging van de Shannon-curven betekent dat de sequentiegegevens voldoende waren om alle bacteriesoorten te dekken.

Alfa-diversiteitsanalyse wordt gebruikt om de diversiteit binnen een monster te meten. De diversiteitsindices van Chao1, ACE, Shannon en Simpson werden berekend met de Tukey-test om de alfadiversiteit te beschrijven. De diversiteitsanalyse op basis van ACE- en Chao 1-indexen onthulde de gemeenschapsrijkdom van de darmmicrobiota op OTU-niveau. ACE- en Chao 1-indexen waren significant lager in de fecale monsters van de LM-groep in vergelijking met de controlegroep (pb 0.05) (Fig. 4a, b), wat impliceert dat de soortenrijkdom van de darmmicrobiota was afgenomen door LM-voeding. De diversiteitsanalyse op basis van Shannon- en Simpson-indexen onthulde de gemeenschapsdiversiteit van de darmmicrobiota. Er was geen duidelijke verandering in de Shannon- en Simpson-diversiteitsindexen bij behandeling met cistanche-polysacchariden in vergelijking met de controlegroep.

Cistanche-polysachariden veroorzaakten grote veranderingen in taxa. Bovendien was in vier groepen N98 procent van de OTU's gerelateerd aan de phyla Bacteroidetes, Firmicutes en Proteobacteria. De meest overheersende stam was Bacteroidetes die 55,09 procent, 57,89 procent, 52,72 procent en 69 bijdroeg.{{20}}4 procent van de fecale microbiota onder controle, ZT, HM en respectievelijk LM-groepen, gevolgd door Firmicutes, die respectievelijk 41,39 procent, 38,03 procent, 42,15 procent en 28,15 procent bijdroegen (Fig. 5a, b). Vergeleken met de controlegroep bleek de ZT-groep te resulteren in zwakke effecten op de relatieve abundantie van de belangrijkste phyla, behalve dat de lage abundantie van Actinobacteria aanzienlijk was toegenomen (MetaStat, pb 0,05). In de HM-groep was Proteobacteria significant verhoogd (pb 0,01). Dit gaf aan dat HM Cistanche-polysaccharide de verrijking van Proteobacteria zou kunnen bevorderen om het metabolisme van stoffen bij ratten te beïnvloeden. In de LM-groep nam de abundantie van de Bacteroidetes, waarvan de belangrijkste bijdragers Prevotellaceae en Prevotellaceae waren_UCG-001 aanzienlijk toe (pb 0,05) en de abundantie van Firmicutes, waaronder Peptococcaceae, nam aanzienlijk af (pb 0,01) . Leden van de Prevotella en Bacteroides werden eerder beschreven als afbrekers van voedingsvezels [26], die metabolische eindproducten produceren zoals succinaat en acetaat [27]. Dergelijke bevindingen bevestigden eerdere studies die aantoonden dat sommige Prevotella spp. kunnen complexe plantaardige polysachariden afbreken. Eerdere rapporten toonden ook aan dat de twee dominante bacteriële divisies, de verhoogde verhouding van de phyla Firmicutes/Bacteroidetes, geassocieerd zijn met obesitas [28]. De lagere abundantie van de eerste en de hogere abundantie van de laatste in de LM-groep suggereerden dat LM zou kunnen helpen om kilo's kwijt te raken.

Van de 72 gedetecteerde families werden de taxa top1 0 geïsoleerd en geanalyseerd (Fig. 5c, d). De Lachnospiraceae en Ruminococcaceae zijn twee van de meest voorkomende families in de darmomgeving van zoogdieren en zijn in verband gebracht met het behoud van de darmgezondheid [29]. In de huidige studie, families Bacteroidales_S24-7_groep (39,11 ± 6,04 procent, 36,88 ± 4,44 procent, 28,37 ± 4,01 procent, 35,81 ± 7,91 procent), Prevotellaceae (10,66 ± 3,84 procent, 15,14 ± 5,50 procent, 19,65 ± 8,97 procent, 21,05 ± 8,39 procent), Lachnospiraceae (18,21 ± 5,20 procent, 15,09 ± 3,29 procent, 12,13 ± 7,14 procent, 13,12 ± 6,82 procent), en Ruminococcaceae (9,64 ± 0,88 procent, 10,44 ± 2,45 procent, 11,27 ± 4,70 procent, 8,19 ± 1,72 procent) domineerden in elke groep. Er is gerapporteerd dat de S24-7-familie overvloedige koolhydraatafbrekende enzymen bevatte [30]. Prevotellaceae vertoonde een stijgende lijn en Lachnospiraceae vertoonde een dalende tendens in de polysacharidengroep in vergelijking met de controlegroep [31]. Er werd aangenomen dat er geen overeenkomstige actieve enzymen van cistanchepolysacchariden in Bacteroidales_S24-7_groep en Lachnospiraceae of koolhydraatbindende modules van bacteriën bij polysacchariden waren. Prevotella-geslachten zijn gemeld in verband met loci voor het gebruik van polysachariden en koolhydraat-actieve enzymen [32]. Om de relatie tussen bacteriën en SCFA's te vinden, werd Spearman-correlatieanalyse toegepast. Sommige geslachten zoals Bacteroides, Prevotella en Lactobacillus in de darmflora spelen een belangrijke rol bij de hydrolyse van polysachariden tot SCFA's [33]. Onze resultaten toonden ook aan dat de Bacteroidaceae positief correleerden en de gedomineerde microbiota meer butyraat produceerden [34], terwijl de Prevotellaceae positief correleerden en de gedomineerde microbiota meer acetaat produceerden. Door Lactobacillaceae en Ruminococcaceae gedomineerde microbiota produceerden meer propionaat (Fig. 6).

Bèta-diversiteitsanalyse werd gebruikt om de structurele variaties van de darmmicrobiota in de monsters te onderzoeken met behulp van UniFrac-afstandsmetrieken. Verschillen in de Unifrac-afstanden werden geanalyseerd met de Tukey- en Wilcox-test (Fig. 7). Met behulp van ongewogen uniFrac-analyse, ontdekten we dat LM-voermuizen clusteren weg van andere groepen. Een schijnbaar clusteringpatroon werd geïdentificeerd voor controle-, ZT-, HM- en LM-groepen.

De overvloed van deze microbiële werd differentieel gemoduleerd met polysacharidebehandelingen. Om de specifieke bacteriële taxa in elke groep te identificeren, werd de samenstelling van de microbiota van de controle-, ZT-, HM- en LM-groepen vergeleken met de lineaire discriminantanalyse-effectgrootte (LEfSe) -methode. Linear Discriminant Analysis (LDA) wordt gebruikt om de effectgrootte van elk differentieel overvloedig kenmerk te berekenen. De drempel voor LDA-scores is hoger dan de lijst met 4 waren, wat wijst op een hogere relatieve dichtheid in de gemeenschap in de overeenkomstige groep dan in andere groepen. Met behulp van deze methode ontdekten we dat 19 OTU's significant verschillend waren in alle groepen, namelijk 6 OTU's in de controlegroep waren hoger, slechts 1 OTU in de ZT-groep was hoger, 10 OTU's in de HM-groep waren hoger en 2 OTUS in de LM-groep waren hoger dan in andere groepen (Fig. 8). De overvloed aan g_Prevotellaceae_ UCG_001 in LM was significant toegenomen (8,47 ± 1,9 procent in LM, 0,40 ± {{21 }}.09 procent in de controlegroep, pb 0,01). Het resultaat was consistent met het rapport dat Porphyra haitanensis en Ulva prolifera polysacchariden duidelijk de proliferatie van Prevotellaceae UGC-001 (pb 0.05) en Rikenellaceae RC9 (pb 0.01) [35] zouden kunnen bevorderen.

4. Conclusies

Het is duidelijk dat er een verband bestaat tussen de chemische bestanddelen van TCM, de darmmicrobiota en bepaalde metabolieten die afkomstig zijn van darmbacteriën. Onze huidige bevindingen leverden een methode op voor het bestuderen van synergieën van het echinacosidemetabolisme met verschillende soorten polysachariden op basis van de darmmicrobiota. Darmmicrobiota kan TCM metaboliseren en TCM kan de groei van darmmicrobiota beïnvloeden. Aan de ene kant, na orale toediening van polysachariden in de darm, coderen verschillende darmmicrobiota metabole enzymen, die een belangrijke rol spelen bij de afbraak van polysachariden en om bioactieve metabolieten te produceren. Aan de andere kant hebben de bijdragen van polysachariden enige invloed op de balans van de darmmicro-omgeving in het proces. Door vergelijking met of zonder polysachariden, ontdekten we dat polysachariden, hoewel ze rechtstreeks door de gastheer worden verteerd, mogelijk als prebiotica werkten, wat leidde tot gunstige veranderingen in de darmmicrobiota door de groei van probiotica te bevorderen. Cistanche-polysachariden reguleerden de diversiteit van de darmmicrobiota, verhogen nuttige bacteriën en vooral laagmoleculaire polysachariden versterkten de groei van Prevotella spp. Bovendien verbeterde de verbeterde darmmicrobiota vervolgens de opname van echinacoside in de Cistanche deserticola. Maar de reden is niet helemaal duidelijk, kan een gevolg zijn van de gecombineerde defecten van de darmmicrobiota, SCFA's en immuniteit, en verder onderzoek is nodig voor een ziektemodel. Het is moeilijk om de effecten van prebiotica te bewijzen in gezonde diermodellen waarvan de microbiota-gemeenschap stabiel en veerkrachtig is. Cistanche deserticola-polysacchariden kunnen worden ontwikkeld als probiotische producten om de darmmicrobiota te reguleren en kunnen in de toekomst worden toegepast op het synergetische metabolisme van kleine moleculen. Met deze gegevens kunnen we interventies ontwerpen om te voorkomen dat kwetsbare groepen mensen hun gezondheid verbeteren.

Verklaring van concurrerend belang

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Dankbetuigingen

Auteurs erkennen dankbaar de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81830112 en 81904058)

Referenties
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Potentiële prebiotica en hun transmissiemechanismen: recente benaderingen, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649-656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, Darmmicrobiota, gastheergezondheid en polysachariden, Biotechnol. Adv. 31 (2) (2013) 318-337.
[3] NT Porter, EC Martens, De cruciale rol van polysachariden in de darmmicrobiële ecologie en fysiologie, Annu. Rev. Microbiol. 71 (2017) 349-369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, Onderzoek naar de bindingskenmerken van drie polysachariden met verschillend molecuulgewicht en flavonoïden uit maïszijde (Maydis-stigma), Carbohyd. Polym. 198 (2018) 581-588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, darmmicrobiota -betrokken mechanismen bij het verhogen van de systemische blootstelling aan ginsenosiden door naast elkaar bestaande polysachariden in ginseng-afkooksel, Sci. Herhaling 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Absorptie van Codonopsis pilosula saponinen door naast elkaar bestaande polysacchariden verlicht darmmicrobiële dysbiose met dextransulfaat-natrium -geïnduceerde colitis bij modelmuizen, Biomed. Onderzoek Int. 2018 (2018), 1781036 (18 pagina's).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum vermindert obesitas bij muizen door de samenstelling van de darmmicrobiota te moduleren, Nat. gemeenschappelijk. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, Intestinale microbiota zijn betrokken bij de immunomodulerende activiteiten van longan-polysaccharide, Mol. Nutr. Voedsel res. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": een recensie, Am. J. Kin. Med. 40 (6) (2012) 1123-1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, identificatie van echinacoside-metabolieten geproduceerd door menselijke darmbacteriën met behulp van ultraperformante vloeistof
chromatografie-quadrupole vluchttijd massaspectrometrie, J. Agr. Voedsel Chem. 63 (30) (2015) 6764-6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Humaan gastro-intestinaal metabolisme van Cistanches Herba-waterextract in vitro: opheldering van het metabolische profiel op basis van uitgebreide identificatie van metabolieten in maagsap, darmsap, menselijke darm bacteriën en darmmicrosoom, J. Agric. Voedsel Chem. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Colorimetrische methode voor de bepaling van suikers en verwante stoffen, Anal. Chem. 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Nieuwe mucosale immunisatie met polysaccharide-eiwitconjugaten gevangen in alginaatmicrosferen, J. Control. Laat 53 (1-3) (1998) 215-224 los.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Gevoelige en vereenvoudigde detectie van antibiotische invloed op de dynamische en veelzijdige veranderingen van fecale korte -ketenvetzuren, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, Moleculaire modificatie van polysachariden en resulterende biologische activiteiten , Compr. ds. Eten. Wetenschap. F. 15 (2) (2016) 237-250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: een overzicht van de eigenschappen van chemie, farmacologie en farmacokinetiek, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233-247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Effect van chitooligosacchariden op
de intestinale absorptie van fenylethanoïde glycosiden in Fructus Forsythia-extract, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549-1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, De invloed van polysachariden van Ophiopogon japonicus op 2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbeen-2- Z. Fu et al. / International Journal of Biological Macromolecules 149 (2020) 732–740 739 O- -d-glucoside over biofarmaceutische eigenschappen in vitro en farmacokinetiek in vivo, Int. J. Biol. Macromol. 119 (2018) 677-682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Precisiegeneeskunde gaat microscopisch: het microbioom ontwerpen om de medicijnresultaten te verbeteren, Cell Host Microbe 26 (1) (2019) 22-34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Prospecting prebiotica, innovatieve evaluatiemethoden en hun gezondheidstoepassingen: een overzicht, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimer, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, De internationale wetenschappelijke vereniging voor probiotica en prebiotica (ISAPP) consensusverklaring over de definitie en reikwijdte van prebiotica, Nat. Eerwaarde Gastro. Hepat. 14 (8) (2017) 491-102.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Colongezondheid: fermentatie en vetzuren met een korte keten, J. Clin. Gastro-enterol. 40 (3) (2006) 235-243.
[23] SI Cook, JH Sellin, Review-artikel: vetzuren met een korte keten in gezondheid en ziekte, Aliment. apotheek daar. 12 (6) (1998) 499-507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Verbetering van obesitas en glucosetolerantie door acetaat bij type 2 diabetische Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty (OLETF) ratten, Biosci. Biotechnologie. Biochem. 71 (5) (2007) 1236-1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, In vitro fermenteerbaarheid van xylooligosacchariden en xylo-polysaccharidefracties met verschillende molecuulgewichten door menselijke fecale bacteriën, Carbohyd. Polym. 179 (2018) 50-58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Vezelbenuttingscapaciteit varieert in door Prevotella versus Bacteroides gedomineerde darmmicrobiota, Sci. Rep. 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii is een eerder heterotypisch synoniem van Bacteroides chinchilla en heeft prioriteit, Int. J. Syst. Evol. Microfoon 62 (6) (2012) 1241-1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, een met obesitas geassocieerd darmmicrobioom met verhoogde capaciteit voor energieoogst, Nature 444 (7122) (2006) 1027-1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Verbindingen tussen het darmmicrobioom en metabole hormonen in de vroege zwangerschap bij vrouwen met overgewicht en obesitas, Diabetes 65 (8) (2016) 2214 –2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, Genomische karakterisering van de ongecultiveerde Bacteroidales-familie S24-7 die leeft in de ingewanden van homeothermische dieren, Microbiome. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, gunstig effect van butyraat-producerende Lachnospiraceae op stress-geïnduceerde viscerale overgevoeligheid bij ratten, J. Gastro. Hepatol. 34 (8) (2019) 1368-1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, De diverse en uitgebreide planten polysacharide afbraakapparaten van de pens en de dikke darm Prevotella soorten: een factor in hun alomtegenwoordigheid? Syst. toepassing microbiologisch. 42 (2) (2019) 107-116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, De rol van koolhydraten in de darmgezondheid van varkens, Anim. Voer. Wetenschap. techniek. 173 (1-2) (2012) 41-53.
[34] SA Parker, A . Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, Inzicht in het prebiotische potentieel van verschillende voedingsvezels met behulp van een in vitro continu volwassen fermentatiemodel (PolyFermS), Sci. Rep. 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Effect van twee zeewierpolysacchariden op darmmicrobiota bij muizen geëvalueerd door Illumina PE250-sequencing, Int. J. Biol. Macromol. 112 (2018) 796-802.