Cistanche Rb1 vermindert leeftijdsgebonden vasculaire stoornissen door het gas6-traject te moduleren

Resultaten Rb1 verlichtte veroudering in de aorta's van ouder wordende muizen

Om het antisenescentie-effect van Rb1 te identificeren, hebben we eerst cellulaire veroudering onderzocht, die wordt gekenmerkt door de expressie van eiwitten die betrokken zijn bij remming van de celcyclus en onomkeerbare groeistop (Yang et al. 2019). Zoals de resultaten van de immunohistochemie worden getoond in figuur 1 (A, B), vergeleken met die in de Young-groep, toonden muizen uit de Old + Vehicle-groep aan dat veroudering de opregulatie van p21Cip1 en p16INK4a in thoracale aortacellen versnelde. Behandeling met Rb1 verlichtte echter cellulaire veroudering in bloedvaten, vooral in de groep Old þ Rb1-20. Bovendien waren de resultaten van de Western-blot in overeenstemming met deimmunohistochemie resultaten. Zoals weergegeven in figuur 1(C), was de eiwitexpressie van p21Cip1 en p16INK4a significant ongeveer 2-voudig verhoogd in de thoracale aorta's van oude muizen in vergelijking met jonge muizen. Na behandeling met 20 mg/kg Rb1 waren de eiwitniveaus van p21Cip1 en p16INK4a net verhoogd met 41,92 procent en 37,52 procent in vergelijking met die van de Young-groep, die significant lager waren dan die van de Old plus Vehicle-groep. Bovendien was er geen significant verschil in de expressie van p21Cip1 of p16INK4a tussen jonge muizen met en zonder Rb1-behandeling.

Figuur 1. Effect van Rb1 op thoracale aorta-senescentie. Afbeeldingen van de immunohistochemische kleuring (400 ) van p21Cip1 (A) en p16INK4a (B) in dwarsdoorsneden van de thoracale aorta van muizen. ( C ) Western-blotanalyse van p21Cip1- en p16INK4a-expressie van de thoracale aorta van de muis. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. p < 0,01 vs. de Young-groep; # p < 0,05 vs. de groep Oldþ Vehicle.

Rb1 verbeterde vasculaire reactiviteit bij oude muizen

Een vasculair ringexperiment werd gebruikt om endotheelafhankelijke vasodilatatie te evalueren. Zoals weergegeven in figuur 2, resulteerde de toediening van Ach in alle thoracale aortaringen van muizen in vasorelaxatie. Bij maximale concentraties (10-5 mol/L) induceerde Ach ongeveer 88,84 procent ± 1,20 procent en 58,35 procent ± 2,50 procent vasorelaxatie in respectievelijk de Young-groep en de Old þ Vehicle-groep, wat aantoont dat veroudering geassocieerd is met verminderde vasculaire reactiviteit. Behandeling met Rb1 met 10 en 20 mg/kg resulteerde echter in respectievelijk ongeveer 70,48 procent ± 2,20 procent en 80,90 procent ± 3,24 procent relaxatie in verouderende thoracale aortaringen van muizen als reactie op 105 mol/L Ach.

Klik hier om Cistanche voor anti-veroudering te krijgen

Rb1 verminderde de expressie van cellulaire adhesiemoleculen in de thoracale aorta's van ouder wordende muizen

We onderzochten de eiwitexpressie van bepaalde celadhesiemoleculen om deopruiendEnontstekingsremmende effectenvan Rb1 op oude muizen. De resultaten toonden aan dat de eiwitexpressie van ICAM-1, VCAM-1 en PAI-1 significant ongeveer 2-4 keer zo hoog was in de thoracale aorta's van oude muizen in vergelijking met in de Young-groep (Figuur 3). Daarentegen remde Rb1-behandeling deze veranderingen in verouderde thoracale aorta's van muizen significant, maar had geen effect op de jonge muizengroepen. De kwantitatieve analyse gaf aan dat behandeling met 20 mg/kg Rb1 resulteerde in ongeveer 36,58 procent, 46,66 procent en 49,34 procent downregulatie van respectievelijk ICAM-1-, VCAM-1- en PAI{17}}-eiwitexpressie, in verouderend thoracaal aortaweefsel, vergeleken met die van muizen uit de Old plus Vehicle-groep.

Rb1 remde leeftijdsgebonden vasculaire calcificatie en fibrose

We hebben HE-kleuring en alizarine-rode S-kleuring uitgevoerd om respectievelijk de weefselstructuur van de aorta en vasculaire mediale verkalking bij ouder wordende muizen te beoordelen. HE-kleuring toonde aan dat door veroudering veroorzaakte verdikte wanden van de thoracale aorta en desorganisatie van de extracellulaire matrix van de aorta konden worden verlicht door Rb1-behandeling (Figuur 4(A)). Zoals weergegeven in figuur 4(B), ontwikkelden ouder wordende muizen meer ernstige mediale verkalking (rood gekleurd gebied) dan jonge muizen, terwijl Rb1-interventie deze pathologische verandering verminderde. Vervolgens onderzochten we dwarsdoorsneden van de thoracale aorta door Masson's trichroomkleuring om vasculaire mediale fibrose bij ouder wordende muizen te beoordelen. De resultaten toonden aan dat er een merkbare toename was in de afzetting van collageen (blauw gekleurd gebied) in de groep Old + Vehicle in vergelijking met de Young-groep (Figuur 4 (C)), en dit effect werd significant geremd door Rb1-interventie. Bovendien toonde Western-blotting aan dat de expressie van collageen I en collageen III significant 4,{11}} en 2,{13}}voudig toenam bij muizen uit de Old þ Vehicle-groep in vergelijking met jonge muizen; behandeling met Rb1 reguleerde echter de expressie van collageen I en collageen III bij oude muizen (Figuur 4 (D)). Bovendien had behandeling met Rb1 geen invloed op de mate van verkalking van de thoracale aorta en fibrose bij jonge muizen (Figuur 4 (A – D)).

Rb1 reguleerde de Gas6-signaleringsroute

We hebben verder onderzocht of Rb1 functioneerde via de Gas6 / Axl-signaleringsroute om leeftijdsgebonden thoracale aorta-insufficiëntie bij muizen te verbeteren. De neerwaartse regulatie van Gas6-eiwitexpressie met 41,72 procent en mRNA-expressie met 52,73 procent bij oude muizen in vergelijking met jonge muizen werd opgeheven door Rb1-behandeling (Figuur 5 (A, B)). We hebben ook de eiwitexpressie van Axl bepaald door Western-blotting. Interessant genoeg was er geen significant verschil in Axl-eiwitexpressie tussen de vijf experimentele groepen (Figuur 5(A)). We hebben ook geen significant verschil gedetecteerd in de mRNA-niveaus van Axl tussen de groepen (Figuur 5(B)).

Figuur 2. Rb1-behandeling verzwakte leeftijdsgebonden endotheelafhankelijke vasorelaxatiestoornissen in vasculaire ringen van de thoracale aorta. Cijfers die de analyseresultaten tonen. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. p < 0.05, p < 0.01 vs. de Young-groep; # p < 0,05, ## p < 0,01 vs. de groep Oud þ Voertuig.

Figuur 3. Rb1 verminderde de expressie van cellulaire adhesiemoleculen in oude thoracale aorta's van muizen. Western-blotanalyse van ICAM-1-, VCAM-1- en PAI-1-expressie in thoracale aortaweefsels. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. p < 0.01 vs. de Young-groep; # p < 0.05, ##p < 0.01 vs. de Oldþ Vehicle-groep.

Discussie

In de huidige studie hebben we aangetoond dat Rb1 verbeterdeleeftijdsgebonden vasculaire stoornissendoor verkalking en fibrose te onderdrukken door de regulatie van Gas6-expressie maar niet Axl-expressie, wat een potentiële therapeutische strategie biedt voor het voorkomen van leeftijdsgebonden vasculaire aandoeningen. Het is algemeen aanvaard dat senescentie van vasculaire cellen, die wordt gekenmerkt door endotheliale disfunctie en de fenotypische overgang van gladde spiercellen, kan resulteren in verhoogde vasculaire stijfheid en dikkere vaatwanden (Liu et al. 2019). Veroudering van vaatcellen is een veelvoorkomend kenmerk van verschillende complexe, leeftijdsgerelateerde ziekten, met name hart- en vaatziekten (O'Rourke et al. 2010). Met de ontwikkeling van senescentie van vasculaire cellen wordt de vasculaire functie aangetast (Gong et al. 2014). Leeftijdsgerelateerde vasculaire disfunctie wordt geïllustreerd door pathofysiologische veranderingen, waaronder een progressieve afname van endotheelafhankelijke vasodilatatie (Herrera et al. 2010; Gong et al. 2014). In onze studie bevestigden we cellulaire veroudering in de thoracale aorta's van oude muizen, wat werd aangegeven door een verhoogde expressie van de leeftijdsgerelateerde eiwitten p21Cip1 en p16INK4a, evenals een afname van endotheelafhankelijke vasodilatatie. De consistentie van onze resultaten met de bovengenoemde onderzoeken suggereert dat er enkele belangrijke moleculaire mechanismen waren die verband hielden met de veranderingen in vasculaire celpathofysiologie tijdens veroudering. Middelen die op deze mechanismen inwerken, zouden de senescentie van vasculaire cellen waarschijnlijk sterk verminderen en vertragen.

Figuur 4. Rb1-behandeling verbeterde door veroudering veroorzaakte vasculaire calcificatie en fibrose. (A) Kleuring met hematoxyline en eosine (HE) (400 ), (B) Kleuring met Alizarine rood S (400 ) en (C) Kleuring met trichroom van Masson (400 ) van representatieve thoracale aortasecties in elke groep. (D) Western-blotanalyse van collageen I- en collageen III-expressies in thoracale aortaweefsels. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. p < 0,01 vs. de Young-groep; # p < 0,05, ## p < 0,01 vs. de Oldþ Vehicle Group

Figuur 5. De invloed van Rb1 op het Gas6/Axl-signaalpad. (A) Western-blotting werd uitgevoerd om de eiwitexpressie van Gas6 en Axl te onderzoeken. (B) qPCR werd uitgevoerd om de mRNA-expressie van Gas6 en Axl te onderzoeken. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. p < 0.05, p < 0.01 vs. de Young-groep; # p < 0,05 vs. de groep Oud þ Voertuig.

Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat Rb1 wordt beschouwd als een veelbelovend medicijn voor het voorkomen van vasculaire schade (Zhou et al. 2017, 2019a, 2019b; Zheng et al. 2020). Eerdere studies hebben aangetoond dat Rb1 vasculaire celveroudering voorkomt en vasculaire calcificatie remt (Nanao-Hamai et al. 2019; Zhou et al. 2019b; Zheng et al. 2020). Het is echter nog steeds onzeker of Rb1 arteriële functies kan beschermen tegen veroudering en het relevante moleculaire mechanisme. Hier ontdekten we dat Rb1 arteriële senescentie bij oudere muizen verminderde en vertraagde, zoals aangetoond door verminderde expressie van verwante eiwitten en verbeterde vasculaire vasodilatatie, wat aangeeft dat Rb1 efficiënt overmatige veroudering in verouderende thoracale aorta's van muizen kan blokkeren en kan worden gebruikt als een effectief middel om behandelen of voorkomen van leeftijdsgebonden arteriële stoornissen.

Eerder bewijs heeft de accumulatie aangetoond van chronische laaggradige arteriële ontsteking met het vorderen van de leeftijd, wat bijdraagt ​​aan leeftijdsgebonden vasculaire structurele en functionele veranderingen (Wang et al. 2014). Aanvullende studies hebben aangetoond dat een micro-omgeving verrijkt met ontstekingsprofielen een fenotypische verschuiving in VSMC's veroorzaakt van het contractiele naar het synthetische type. Deze fenotypische verschuiving wordt gekenmerkt door de verzwakte expressie van SMC-specifieke contractiele eiwitten en de secretie van aanvullende pro-inflammatoire cytokines, chemokines, ECM-eiwitten en celadhesiemoleculen, zoals collageen, ICAM-1, VCAM-1 en PAI-1 (Wang et al. 2011; Lacolley et al. 2018). Bovendien dragen adhesiemoleculen bij aan door ontsteking geïnduceerde hermodellering van de slagaders, met name door ECM-VSMC-interacties te reorganiseren en de fenotypische modulatie van VSMC's te beïnvloeden (Intengan et al. 1999). Bovendien hebben studies aangetoond dat Rb1 ontstekingsremmende effecten heeft in vivo en in vitro (Miao et al. 2017; Zhou et al. 2017). In de huidige studie ontdekten we dat Rb1-behandeling de expressieniveaus van celadhesiemoleculen die verband houden met ontstekingsprocessen bij oudere muizen significant zou kunnen verlagen, wat suggereert dat Rb1 zou kunnen werken als een ontstekingsremmend medicijn en het vaatstelsel zou kunnen beschermen tijdens veroudering.

Naast ontstekingsschade, remodellering van de arteriële wand gekenmerkt door verkalking en fibrose is de andere belangrijkste pathofysiologische verandering in leeftijdsgebonden avasculaire modificaties en veroorzaakt vasculaire stijfheid die bijdraagt ​​aan een afname van vasodilatatie (McEniery et al. 2005; Iyemere et al. 2006; Kovacic et al. 2011). Grootschalige studies hebben aangetoond dat coronaire atherosclerotische verkalking toeneemt met de leeftijd (Tesauro et al. 2017). Ander onderzoek toonde ook de aanwezigheid aan van verhoogde verkalking bij veroudering in het gebied van de halsslagader (Wendorff et al. 2015). Evenzo gaven onze resultaten aan dat ouder wordende muizen meer ernstige vasculaire mediale verkalking ontwikkelden dan jonge muizen. Rb1-interventie remde deze veranderingen aanzienlijk. Dit resultaat suggereerde dat Rb1-toediening de mate van leeftijdsgebonden vasculaire calcificatie in vivo verlichtte. Voldoende bewijs heeft aangetoond dat vasculaire calcificatie een verscheidenheid aan pathobiologische processen omvat in plaats van eenvoudige calciumafzetting, waarbij VSMC-omschakeling naar osteoblastachtige cellen een cruciale rol speelt (Zhou et al. 2019b). Een beperking van onze studie is dat, ondanks het feit dat werd onthuld dat Rb1-interventie vasculaire calcificatie significant remde in verouderende muizen, thoracale aorta's, contractiele VSMC-markers (zoals A-gladde spieractine en calponine) en osteogene VSMC-markers (zoals runt-gerelateerde transcriptiefactor 2). ) vereisen nader onderzoek.

Bovendien hebben we in de huidige studie ook verlaagde interstitiële collageenniveaus en verminderde expressie van verwante eiwitten waargenomen bij met Rb1- behandelde oude muizen in vergelijking met met drager behandelde oude muizen, wat suggereerde dat Rb1 een gunstig effect zou kunnen hebben op de vasculaire functie bij ouder wordende thoracale aorta's door leeftijdsgeïnduceerde vasculaire fibrose te verbeteren. Harvey et al. (2016) rapporteerden dat arteriële verstijving veroorzaakt door overmatige fibrose en verhoogde collageenafzetting kan leiden tot een verhoogde vasomotorische tonus en veranderde weefselperfusie. Middelen die fibrose verminderen, worden geacht te beschermen tegen leeftijdsgebonden vaatziekten (Kim et al. 2018).

Dat kan worden afgeleidleeftijdsgebonden vasculaire stoornissenis een complex proces dat verschillende abnormale veranderingen met zich meebrengt, waaronder ontsteking, verkalking en fibrose. Wat nog belangrijker is, we ontdekten dat Rb1 deze bekende abnormale veranderingen in de thoracale aorta's van oude muizen kon remmen. Het onderliggende mechanisme is echter nog onbekend. Gas6 werd geïdentificeerd als de lig en voor de TAM-receptorfamilie, met name Axl-tyrosinekinasereceptoren (Rothlin et al. 2015). Een eerdere studie toonde de rol aan van Gas6/Axl bij het reguleren van meerdere cellulaire functies (Chen et al. 2019). Een recente studie suggereerde dat Gas6/Axl een cruciale rol speelde bij vasculaire calcificatie (Son et al. 2010; Kaesler et al. 2016; Nanao-Hamai et al. 2019) en mogelijk ook betrokken is bij door behandeling geïnduceerde neerwaartse regulatie van collageensynthese in VSMC's en verouderend hartweefsel (Chen et al. 2016; 2019). Bovendien hebben eerdere studies aangetoond dat Rb1 Gas6-transcriptie activeerde op de specifieke ARE-plaats in het promotorgebied (Son et al. 2010; Nanao-Hamai et al. 2019). Hier hebben we aangetoond dat de gas6-eiwitexpressie verlaagd was bij ouder wordende muizen, maar omgekeerd door Rb1-behandeling, wat aangeeft dat Gas6 mogelijk deelneemt aan Rb{21}}gemedieerde regulatie van arteriële stoornissen bij oudere muizen. Onze resultaten laten echter zien dat er geen verandering was in Axl-eiwit en mRNA-expressie, wat niet strookte met een eerdere studie (Chen et al. 2019). De TAM-receptorfamilie omvat Tyro3, ​​Axl en MerTK. Hoewel Gas6 de sterkste affiniteit voor Axl vertoont onder de drie leden (Rothlin et al. 2015), Sun et al. (2019) ontdekten dat Gas6-activering ontstekingsletsel en apoptose bij muizen verzwakte, maar er deden zich geen veranderingen voor in Axl-activering bij de experimentele groepen. Ander onderzoek suggereerde dat Axl-expressie, die apoptose en dus vasculaire calcificatie remt, ook ongewijzigd was in Gas6–/– muizen (Kaesler et al. 2016). Onze resultaten gaven duidelijk aan dat Rb1 specifiek leeftijdsgerelateerde Gas6-downregulatie verzwakte, maar geen invloed had op de expressie van Axl, waarvan werd gemeld dat het de primaire gebeurtenis was die verantwoordelijk was voor vasculaire calcificatie en fibrose, om leeftijdsgerelateerde vasculaire ontsteking en endotheelafhankelijke vasodilatatie te verbeteren. . De stabiele expressie van Axl kan het gevolg zijn van een voldoende hoeveelheid vóór Gas6-activering of aangeven dat Gas6 via andere receptoren functioneert. Verder onderzoek naar de effecten van Rb1 op andere TAM's die ook door Gas6 kunnen worden geactiveerd, zoals Tyro3 en MerTK, is nodig.

Conclusies

In de huidige studie hebben we bevestigd dat Rb1 vasculaire calcificatie en fibrose remde en de expressie van cellulaire adhesiemoleculen verminderde, die vervolgens allemaal leeftijdsgerelateerde vasculaire endotheelafhankelijke vasodilatatie verbeterden, althans gedeeltelijk door Gas6-expressie te reguleren, maar niet Axl-expressie. Bij oncontroleerbare veroudering is het van groot belang om middelen te vinden die leeftijdsgebonden vasculaire celverslechtering kunnen voorkomen of behandelen. Onze studie levert bewijs dat de effecten van Rb1 op het verbeteren van vasculair letsel bij ouder wordende muizen valideert.

Openbaarmakingsverklaring

Er zijn geen potentiële belangenconflicten gemeld door de auteur(s).

Financiering Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China [81370447], het Science and Technology Planning Project van de provincie Guangdong in China [2016A050502014], het Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund [SZXK002] en het Medical Scientific Research Oprichting van de provincie Guangdong in China [A2019079].

Verklaring gegevensbeschikbaarheid

Gegevens en materialen zijn op verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.

Auteur bijdragen

SYK, DHL en XXQ hebben bijgedragen aan het concept en ontwerp van dit werk. LW, GYS en MW hebben bijgedragen aan data-analyses. SYK, LW en JMZ schreven het manuscript. Alle auteurs hebben de definitieve versie gelezen en goedgekeurd.

Referenties

Acosta JC, O'Loghlen A, Banito A, Guijarro MV, Augert A, Raguz S, Fumagalli M, Da Costa M, Brown C, Popov N, et al. 2008. Chemokine-signalering via de CXCR2-receptor versterkt veroudering. Cel. 133(6): 1006-1018.

Brandes RP, Fleming I, Busse R. 2005. Endotheliale veroudering. Cardiovasc Res. 66(2):286-294.

Chen FF, Lied FQ, Chen YQ, Wang ZH, Li YH, Liu MH, Li Y, Lied M, Zhang W, Zhao J, et al. 2019. Exogeen testosteron verlicht cardiale fibrose en apoptose via de Gas6/Axl-route bij senescente muizen. Exp Gerontol. 119:128-137.

Chen YQ, Zhao J, Jin CW, Li YH, Tang MX, Wang ZH, Zhang W, Zhang Y, Li L, Zhong M. 2016. Testosteron vertraagt ​​de senescentie van vasculaire gladde spiercellen en remt de collageensynthese via de Gas6/Axl-signaalroute . Leeftijd. 38(3):60.

Fridell YW, Villa J, Attar EC, Liu ET. 1998. GAS6 induceert Axl-gemedieerde chemotaxis van vasculaire gladde spiercellen. J Biol Chem. 273(12): 7123-7126.

Gong X, Ma Y, Ruan Y, Fu G, Wu S. 2014. Langdurige atorvastatine verbetert leeftijdsgebonden endotheliale disfunctie door oxidatieve stress te verbeteren en de eNOS/iNOS-onbalans in de aorta van de rat te normaliseren. Exp Gerontol. 52:9–17.

Harvey A, Montezano AC, Lopes RA, Rios F, Touyz RM. 2016. Vasculaire fibrose bij veroudering en hypertensie: moleculaire mechanismen en klinische implicaties. Kan J Cardiol. 32(5):659-668.

Herrera MD, Mingorance C, Rodriguez-Rodriguez R, Alvarez de Sotomayor M. 2010. Endotheliale disfunctie en veroudering: een update. Aging Res Rev. 9(2):142-152.

Hsu JJ, Lu J, Umar S, Lee JT, Kulkarni RP, Ding Y, Chang CC, Hsiai TK, Hokugo A, Gkouveris I, Tetradis S, et al. 2018. Effecten van teriparatide op de morfologie van aortaverkalking bij verouderde hyperlipidemische muizen. Am J Physiol Hart Circ Physiol. 314(6):H1203-H1213.

Hurtado B, Abasolo N, Munoz X, Garcia N, Benavente Y, Rubio F, Garcia de Frutos P, Krupinski J, Sala N. 2010. Associatiestudie tussen polymorfimen in GAS{1}}TAM-genen en carotis-atherosclerose. Tromb Haemost. 104(3):592-598.

Intengan HD, Thibault G, Li JS, Schiffrin EL. 1999. Weerstandsslagadermechanica, structuur en extracellulaire componenten bij spontaan hypertensieve ratten: effecten van antagonisme van angiotensinereceptoren en remming van conversie-enzymen. Circulatie. 100(22):2267-2275.

Iyemere VP, Proudfoot D, Weissberg PL, Shanahan CM. 2006. Fenotypische plasticiteit van vasculaire gladde spiercellen en de regulatie van vasculaire calcificatie. J Intern Med. 260(3):192-210.

Kaesler N, Immendorf S, Ouyang C, Herfs M, Drummen N, Carmeliet P, Vermeer C, Floege J, Kruger T, Schlieper G. 2016. Gas6-eiwit: zijn rol bij cardiovasculaire verkalking. BMC Nefrol. 17(1):52. Kim EN, Kim MY, Lim JH, Kim Y, Shin SJ, Park CW, Kim YS, Chang YS, Yoon HE, Choi BS. 2018. Het beschermende effect van resveratrol op vasculaire veroudering door modulatie van het renine-angiotensinesysteem. Atherosclerose. 270: 123-131. Korshunov VA, Mohan AM, Georger MA, Berk BC. 2006. Axl, een receptortyrosinekinase, bemiddelt door stroming geïnduceerde vasculaire remodellering. Circ Res. 98(11):1446-1452.