Cistanche Tubulosa beschermt dopaminerge neuronen door regulatie van apoptose en van gliacellen afgeleide neurotrofe factor: in vivo en in vitro-Ⅰ

INVOERING

De ziekte van Parkinson (PD) is een veel voorkomende neurodegeneratieve ziekte die voorkomt bij ouderen met de pathologische manifestaties van verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra (SN) als gevolg van degeneratie. De ernst van de ziekte is gecorreleerd met dopamine (DA) neuronale celverlies in de SN, wat consistent is met de opvatting dat het neurodegeneratieve proces vele jaren voortschrijdt voordat er symptomen optreden.Sawle en Myers, 1993). De progressieve aard van de ziekte suggereert interessante mogelijkheden voor therapeutische interventie door het onderliggende neurodegeneratieve proces te blokkeren. De zoektocht naar door therapie geïnduceerde krachtige en specifieke acties van neurotrofe factoren op de overleving van DA-neuronen is daarom van aanzienlijk belang.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR BESCHERMING DOPAMINERGISCHE NEURONEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Neurotrofe factoren zijn essentiële eiwitten, waaronder zenuwgroeifactor (NGF), van de hersenen afkomstige neurotrofe factor (BDNF) en van gliacellen afkomstige neurotrofe factor (GDNF), die de zenuwgroei, neurologische ontwikkeling, axonale geleiding en neuronale functie bevorderen. Van alle neurotrofe factoren die het herstel van dopaminerge neuronen beschermen en bevorderen, heeft GDNF de sterkste effecten (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Er is aangetoond dat GDNF in vitro krachtige neurotrofe effecten op DA-neuronen bezit (Lin et al., 1993) en in vivo neuroprotectieve effecten uitoefent. Er is aangetoond dat GDNF nigrale DA-neuronen redt van door laesies geïnduceerde celdood na chirurgische of toxine-geïnduceerde axotomie bij ratten (Beck et al., 1995; Kearns en Gash, 1995; Sauer et al., 1995) en gedeeltelijk ook daarna systemische toediening vanN-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)bij muizen (Tomac et al., 1995). De verhoogde incidentie van neuronale apoptose en verminderde beschermende effecten van neurotrofe factoren, mogelijk veroorzaakt door verschillende pathologische factoren, liggen ten grondslag aan de degeneratie van dopaminerge neuronen (Holden et al., 2006).

C. tubulosa is een kruidengeneesmiddel afkomstig van verschillende planten van het geslacht Cistanche. Het is een belangrijke therapeutische optie voor het nierdeficiëntiesyndroom, dat nauw verwant is aan androgeenhormonen in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM). Tot op heden heeft veel klinisch en fundamenteel onderzoek naar C. tubulosa de activiteiten van neurodegeneratieve ziekten aangetoond. De identificatie van TCM-nierversterkende voorschriften bij de behandeling van Parkinson kan dus een alternatieve klinische behandeling voor de ziekte van Parkinson opleveren.Echinacoside (ECH)is een belangrijke bioactieve component die wordt aangetroffen in het geneeskrachtige kruid C. tubulosa. Studies hebben de therapeutische effecten van glycosiden van Cistanche en ECH aangetoond,verbascoside(VER) en icariin (ICA) bij de ziekte van Alzheimer (AD), PD en andere patiënten met vasculaire dementie (Urano en Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) suggereerden dat extracten van C. tubulosa die voldoende ECH en acteoside bevatten, de cognitieve disfunctie veroorzaakt door A -42 verbeterden via het blokkeren van de afzetting van amyloïd en het omkeren van de cholinerge en hippocampale dopaminerge neuronale functie. Tao et al. (2015) vonden datfenylethanoïde glycosidenvan C. tubulosa (Ph Gs-Ct) voorkwam hersenoedeem op grote hoogte door de eiwit- en mRNA-expressie van AQP4 in het hersenweefsel van rattenmodellen te verminderen.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA EXTRACTEN SNACKS VERBETEREN HET GEHEUGEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eerdere studies hebben aangetoond dat Chinese kruidenverbindingen, waaronder de drie ingrediënten van C. tubulosa, epimedium en rhizoma polygonati, de schade aan dopaminerge neuronen en verhoogde niveaus van dopamine verlichtten door de expressie van neurotrofe factoren te reguleren (Wu et al., 2013). Het is dus nog niet bekend of de door C. tubulosa geïnduceerde neuroprotectieve effecten langdurig zijn en in welke mate het redden van nigrale DA-neuronen door toediening van GDNF een significant behoud van motorisch gedrag kan opleveren dat relevant is voor de symptomatologie van Parkinson-dieren. Deze studie maakte gebruik van een TCM-niertonificerend recept, C. tubulosa nanopoeder, dat in China een nationaal patent (patentnummer: 2011103028541) heeft gekregen en eerder een bepaald therapeutisch effect bij de ziekte van Parkinson heeft aangetoond. De huidige studie was daarom ontworpen om de neuroprotectieve en regeneratieve effecten van de behandeling met C. tubulosa te onderzoeken en om de apoptose op de MES23.5-cellen en gedragsdefinitieve ratten te onderzoeken, en de regulatie van GDNF, zoals gemeten door een reeks doeltests. .

MATERIALEN EN METHODEN

Materialen, reagentia en apparatuur

C. tubulosa werd gekocht bij Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Beijing, China. ECH, VER en ICA kwamen van de National Institutes for Food and Drug Control, China. De dopaminerge neuronale cellijn MES23.5 was een geschenk van professor Biao Chen, Laboratorium voor Neurobiologie, Capital Medical University, Beijing, China. Vijftig mannelijke C57BL/6-muizen (elk met een gewicht van 20-25 g) werden gekocht bij Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (licentienummer: SCXK2012-0002), Shanghai, China.

MPP+, MTT en glutamine werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, VS); DMEM/F12-medium en foetaal runderserum werden gekocht bij Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, VS); en MPTP, DA-standaard en homovanillinezuur (HVA)-standaard werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, VS). -actine, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF-familiereceptor-alfa (GFR 1) en Ret-antilichamen werden gekocht bij Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, VS); 3,3'-diaminobenzidine (DAB) kleurreagenskit werd gekocht bij Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, China); en SDS-PAGE gelmonstervoorbereidingskit, ultragevoelige verbeterde chemiluminescentie (ECL) detectiekit en bicinchoninezuur (BCA) test werden gekocht bij Beyotime Institute of Biotechnology (Beijing, China).

Bij dit onderzoek zijn de volgende instrumenten gebruikt: ELX800 microplaatlezer (Bio Tek Winooski, VT, VS); CO2-incubator (Heraeus, Hanau, Duitsland); Gel DOC 2000 gelbeeldvormingsanalysesysteem, elektroforesecel en elektroforesetank (Bio-Rad, Hercules, CA, VS); DU-650 eiwitanalysator (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, VS); 5417R hogesnelheidskoelcentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Duitsland); SXQM dubbele planetaire kogelmolen (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, China); MM400 mengmolen (Retsch GmbH, Haan, Duitsland); Agilent 1200 hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, VS); PowerPac Basic-elektroforese, PowerPac Basic transmembraanoverdrachtsysteem, Universal Hood II chemiluminescentie-imager, S1000 Thermal Cycler RNA reverse transcriptiesysteem (Bio-Rad); Motic Med 6.0 weefsel- en celbeeldanalysesysteem (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China).

Voorbereiding vanC. tubulosaNanopoeder

C. tubulosa werd gewogen, vervolgens gezuiverd en gedehydrateerd. Na conventionele verpulvering werd het fijne poeder van C. tubulosa door een zeef met mazen van 200- gevoerd en gevriesdroogd. Een temperatuurgecontroleerde vacuüm- en hoogenergetische kogelmolen werd gebruikt om het C. tubulosa nanopoeder te bereiden. Eerst werd ruw C. tubulosa-nanopoeder in een vacuümkogelmolentank geplaatst die was geladen met hardmetalen maalkogels. De verhouding tussen de maalkogels en het nanopoeder van C. tubulosa varieerde van 15:1 tot 5:1. Om een ​​fijn poeder te verkrijgen werden de snelheid en de duur van de hoogenergetische kogelmolen ingesteld op respectievelijk 300 rpm en 20 minuten. Het fijne poeder werd gewogen voor de verwerking van materialen op nanoschaal en verwerkt in de mengmolen met een frequentie van 25/s en een oscillatie van 20s gedurende drie herhalingen. PBS werd gebruikt om een ​​voorraadoplossing van 25 mg/ml op te lossen en te bereiden, gevolgd door 30 minuten ultrasone trillingen, autoclaveren en uiteindelijk opslag bij −20◦C.

Kwaliteitscontrole van de actieve componenten vanC. tubulosadoor HPLC

De ECH en VER bevatten gradiëntelutie met octadecylsilaan-gebonden silica als vulmiddel, methanol als mobiele fase A en 0,1% mierenzuuroplossing als mobiele fase B. De detectiegolflengte was 330 nm. De ICA bevatte gradiëntelutie met aan octadecylsilaan gebonden silica als vulmiddel en acetonitril-water (30:70) als de mobiele fase. De detectiegolflengte was 270 nm. Het monster, de controle en de negatieve controle werden voor de test gemeten als 10 µl elk.

Celcultuur en MTT-test om de levensvatbaarheid van MPP te meten+-Behandelde cellen

MES23.5-cellen werden geïnoculeerd met 5% foetaal kalfsserum, 1% glutamine, 2% 50x Sato's oplossing en DMEM/F12-medium met 2% penicilline/streptomycine. Ze werden bij 37◦C geïncubeerd in een incubator met 5% CO2 en een verzadigde luchtvochtigheid. De cellen werden geïsoleerd en gepasseerd met 0,25% trypsine en de celsuspensie werd geoogst in de logaritmische groeifase. Geïsoleerde cellen met een dichtheid van 1 x 105 werden uitgezaaid in met polylysine gecoate 96-putjesplaten, gevolgd door de toevoeging van verschillende eindconcentraties (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 en 800 µmol/l ) van MPP+-media. MES23.5-cellen die 24 uur en 48 uur met normaal kweekmedium waren geïncubeerd, werden gebruikt als negatieve controles in de in vitro-experimenten. De cellen uit de verschillende behandelingsgroepen werden 4 uur geïncubeerd met MTT-reagens. De oplossing in de putjes werd vervolgens weggegooid en 150 µl DMSO werd toegevoegd en gedurende 10 minuten geschud. De absorptie van elk monster bij een golflengte van 570 nm werd gemeten met behulp van een automatische microplaatlezer. Het percentage cellevensvatbaarheid (%)=gemiddelde absorptie van de experimentele groep/gemiddelde absorptie van de negatieve controlegroep × 100%.

Relevante concentraties MPP+-medium werden toegevoegd voor de behandeling van 24- uur in MES23.5-cellen met dezelfde aanpak als voor de in vitro kweek. Na de behandeling werd de oplossing in het putje weggegooid. Media die verschillende concentraties (10, 50, 100, 200, 250, 500 en 1000 µg/ml) C. tubulosa nanopoeder bevatten, werden aan de MES23.5-cellen in verschillende putjes toegevoegd en 24 uur en 48 uur laten incuberen. De MES23.5-cellen die 24 uur en 48 uur met normaal kweekmedium waren geïncubeerd, werden als negatieve controles gebruikt. De MES23.5-cellen die met MPP+-medium waren geïncubeerd, werden als drager gebruikt. De metingen werden voor elk monster in drievoud uitgevoerd. De absorptie van de overeenkomstige behandelings- en controlegroepen werd gemeten om de levensvatbaarheid van de cellen te berekenen.

NATUURLIJK CISTANCHE TUBULOSA-EXTRACT ANTI VERMOEIDHEID PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TH-expressie gemeten door immunocytochemie

Toen het nanopoeder van C. tubulosa een concentratie van 100, 200 en 250 µg/ml had, nam het celoverlevingspercentage aanzienlijk toe (Figuur 2G). Daarom testten we in daaropvolgende experimenten de drie concentraties: groepen met een lage dosis, een middendosis en een groep met een hoge dosis. Voor elk van de C. tubulosa-groepen werden drie replicaties getest. Gesteriliseerde, met polylysine gecoate dekglaasjes werden in 6-putjesplaten geplaatst. Vervolgens werden 5 x 104 cellen in elk putje gezaaid en 24 uur geïncubeerd. Conventioneel vers medium werd vervangen in de normale controlegroep en een eindconcentratie van 100 µmol/L MPP+ medium werd vervangen in de resterende behandelingsgroepen om 24 uur te incuberen. Conventionele verse media werden vervolgens vervangen in de normale controle- en vehiculumgroepen, en eindconcentraties van 100, 200 en 250 μg / ml C. tubulosa nanopoeder werden 24 uur met de cellen geïncubeerd in de lage, matige en hoge dosis. respectievelijk C. tubulosa-behandelingsgroepen. De MES23.5-cellen in de verschillende groepen werden driemaal gewassen in PBS om het supernatant te verwijderen en gedurende 15 minuten verder gefixeerd in 4% paraformaldehyde. Na wassen met PBS werden de cellen gedurende 30 minuten bij 37◦C geïncubeerd met een peroxidaseblokker en vervolgens opnieuw gewassen met PBS. Een 0,2% Triton X-100-oplossing werd gedurende 10 minuten gebruikt voor celpermeabilisatie, gevolgd door wassen met PBS. Normaal geitenserum werd aan elk monster toegevoegd en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het normale geitenserum werd vervolgens verwijderd en het primaire antilichaam, 1:400 verdund in PBS, werd aan elk monster toegevoegd en een nacht bij 4◦C geïncubeerd. De cellen in de negatieve controlegroep werden een nacht bij 4◦C met PBS geïncubeerd. Na wassen met PBS werden de cellen gedurende 20 minuten bij 37◦C geïncubeerd met biotine-gelabelde secundaire antilichamen in de vochtkamer. Elk monster werd vervolgens gewassen in PBS en gedurende 20 minuten bij 37◦C gelabeld met mierikswortelperoxidase-streptavidine-conjugaten (werkoplossing C). Na wassen met PBS werden de cellen gedurende ongeveer 1-10 minuten in het donker gekleurd met DAB-reagens en werd de ontwikkeling van een bruine kleur gevolgd onder lichtmicroscopie. Elk monster werd vervolgens tweemaal gedurende 1 à 2 minuten gewassen in gedestilleerd water en de kernen werden gedurende 0,5 à 1 minuut tegengekleurd met een hematoxyline-oplossing. Na elk monster grondig in water te hebben gespoeld, werden de cellen ondergedompeld in 1% zoutzuuralcohol voor differentiatie en 1% waterige ammoniak, gevolgd door grondig wassen van de cellen in water. De cellen van elk monster werden vervolgens gedehydrateerd in 70% ethanol gedurende 2 minuten, 80% ethanol gedurende 2 minuten, 90% ethanol tweemaal gedurende 2 minuten, 95% ethanol tweemaal gedurende 2 minuten en 100% ethanol tweemaal gedurende 2 minuten. De cellen werden vervolgens tweemaal gedurende 2 minuten ondergedompeld in xyleenoplossing en met neutrale harsen op een glasplaatje gemonteerd. Onder lichtmicroscopie onderging elk monster beeldopname en willekeurige selectie van 5-10 effectieve visuele velden om de expressie van geselecteerde eiwitten in dopaminerge neuronen te bepalen, aangegeven door de intensiteit van de bruine deeltjes, en om het eiwitgehalte semi-kwantificeerbaar te maken aan de hand van de gemiddelde grijswaarde. .

Apoptosesnelheid van MES23.5-cellen gemeten met flowcytometrie

Hechtende cellen werden eenmaal gewassen met PBS. Voor celisolatie werd bij kamertemperatuur een geschikte hoeveelheid EDTA-vrije trypsine-oplossing toegevoegd en de oplossing werd voorzichtig gepipetteerd om de hechtende cellen los te laten. Vervolgens werd een celkweekmedium toegevoegd om de trypsinisatie te stoppen. Het mengsel werd overgebracht naar een nieuwe centrifugebuis en vervolgens gedurende 5 minuten bij 1500 rpm gecentrifugeerd om de geïsoleerde cellen te verzamelen. Nadat het supernatant was weggegooid, werd de celpellet voorzichtig opnieuw gesuspendeerd met behulp van PBS en werden de cellen geteld. Ongeveer 1 x 105 tot 5 x 105 opnieuw gesuspendeerde cellen werden 5 minuten bij 1500 rpm gecentrifugeerd en het supernatant werd weggegooid. Vijf microliter Annexine V-FITC-bindingsoplossing werd aan de celpellet toegevoegd om de cellen voorzichtig te resuspenderen. Nog eens 5 µl Annexine V-FITC werd toegevoegd en grondig gemengd. Vijf microliter propidiumjodide-oplossing werd gebruikt voor celkleuring door kort vóór de flowcytometrie 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.

Western Blot-analyse voorin vitro

De cellen werden verdeeld in een normale groep, de MPP+-behandelingsgroep, met een lage dosisC. tubulosabehandelingsgroep, behandelingsgroep met matige dosis C. tubulosa en behandelingsgroep met hoge dosis C. tubulosa. De expressie van Bcl2 en Bax werd in elk gemeten. Een totaal van 1 × 105 cellen per putje in de 6-putjesplaat werd gebruikt voor modellering en behandeling in elke groep vóór het oogsten van de cellen. Een gemengd lysaat, dat RIPA-buffer, proteaseremmer en fosfataseremmer bevat, werd toegevoegd om de cellen gedurende 30 minuten op ijs te lyseren. Na centrifugeren werd het supernatant gebruikt voor eiwitanalyse. Het totale eiwit werd gekwantificeerd met behulp van een BCA-test en gescheiden door 10% SDS-PAGE. De gescheiden eiwitten werden overgebracht naar een membraan en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met een 5% magere melkblokkerende buffer. Het membraan werd vervolgens overnacht bij 4◦C geïncubeerd in primair antilichaam (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, 1:200 verdunning). Na een wasstap werd het membraan gedurende 1 uur bij 4◦C geïncubeerd in een secundair antilichaam (0,5 mg/ml, verdunning 1:5000) en vervolgens gedurende 2 minuten in ECL-ontwikkelaar voor conventionele ontwikkeling. Hoeveelheid Eén software werd gebruikt voor de semi-kwantitatieve analyse van eiwitexpressie.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR ANTI VERMOEIDHEID BESCHERMEN LEVER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Experimentele diermodellering en geneesmiddelenadministratie

Vijftig specifiek pathogeenvrije 8-mannelijke muizen van een week oud werden willekeurig verdeeld in vijf groepen: een normale groep, een MPTP-behandelingsgroep (voertuig), een lage dosis C. tubulosa-behandelingsgroep, een matige dosis C. tubulosa-behandeling groep en de behandelingsgroep met hoge dosis C. tubulosa. De dieren werden gehuisvest bij 20–22◦C en hadden vrije toegang tot voedsel en water. De muizen in de normale groep werden gedurende zeven opeenvolgende dagen intraperitoneaal geïnjecteerd met een gelijk volume normale zoutoplossing. De muizen in de andere behandelingsgroepen werden gedurende zeven opeenvolgende dagen intraperitoneaal geïnjecteerd met MPTP (30 mg/kg/d) om vehikels vast te stellen.

Tijdens PD-modellering kregen de muizen in de behandelingsgroepen met lage dosis, matige dosis en hoge dosis C. tubulosa intragastrische equivalente klinische volumes toegediend van 4 g/kg/d, 8 g/kg/d en 16 g/d. kg/dC. tubulosa nanopoederrespectievelijk gedurende 14 opeenvolgende dagen. Aan de muizen in de controle- en vehikelgroepen kregen gedurende 14 opeenvolgende dagen intragastrische equivalente volumes normale zoutoplossing toegediend. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Fujian Universiteit van TCM en werden uitgevoerd volgens de internationaal aanvaarde principes voor het gebruik en de verzorging van proefdieren. In dit onderzoek is alles in het werk gesteld om het dierenleed tot een minimum te beperken.