Cistanche Deserticola-extract verhoogt botvorming in osteoblasten--Deel I

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet al

Abstract
Doelstellingen We onderzochten het effect van:Cistanchedeserticolama. (CD) opbotvormingdoor gekweekte osteoblasten. Methoden De gemineraliseerde knobbelvormingstest werd gebruikt om de in vitro effecten van CD . te onderzoeken(Cistanchedeserticola)Aanbotvorming. Alkalische fosfatase (ALP), botmorfogenetische eiwitten (BMP)-2 en mRNA-expressie van osteopontine (OPN) werden geanalyseerd door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie. Het werkingsmechanisme van CD(Cistanchedeserticola)extract werd onderzocht met behulp van Western blotting. Het in vivo anti-osteoporotische effect van CD(Cistanchedeserticola)extract werd beoordeeld in muizen die ovariëctomie hadden ondergaan.
Belangrijkste bevindingen

CD(Cistanchedeserticola)extract had geen effect op de proliferatie, migratie of wondgenezing van gekweekte osteoblasten, maar verhoogde ALP-, BMP-2- en OPN-mRNA en botmineralisatie. Mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) of nucleaire factor (NF)-kB-remmers verminderden CD(Cistanchedeserticola)extract-geïnduceerdebotvormingen ALP-, BMP-2- en OPN-expressie. Echter, CD(Cistanchedeserticola)extract had geen invloed op osteoclastogenese. Bovendien, CD(Cistanchedeserticola)extract verhinderde het botverlies veroorzaakt door ovariëctomie in vivo.
conclusies

CD(Cistanchedeserticola)kan een roman zijnbotvormingmiddel voor de behandeling van osteoporose.

Trefwoordenbotvorming; Cistanchedeserticola; Chinees kruid; osteoblasten

Cistanche deserticolais goed voorbotvorming

Invoering

Bot is een complex weefsel dat is samengesteld uit verschillende celtypen die een continu proces van vernieuwing en herstel ondergaan dat 'botremodellering' wordt genoemd. Twee belangrijke celtypen die verantwoordelijk zijn voor botremodellering zijn osteoclasten, die bot resorberen, en osteoblasten, die nieuw bot vormen. Botremodellering wordt gereguleerd door verschillende systemische hormonen (bijv. parathyroïdhormoon, 1, 25-dihydroxyvitamine D3, geslachtshormonen en calcitonine) en lokale factoren (bijv. stikstofmonoxide, prostaglandinen, groeifactoren en cytokinen).[1] Osteoporose ontstaat wanneer resorptie en botvorming ongecoördineerd zijn en overmatige botafbraak groter is dan botopbouw.[2] Huidige behandelingen voor osteoporose omvatten bisfosfonaten, calcitonine en oestrogeen, die botresorptieremmers zijn die de botmassa in stand houden door de osteoclastactiviteit te remmen. [3] Het effect van deze medicijnen op het vergroten of herstellen van botmassa is echter relatief klein, zeker niet meer dan 2 procent per jaar.[3] Er is daarom behoefte aan botopbouwende middelen, zoals teriparatide, die nieuwebotvormingen corrigeer de verandering in de trabeculaire microarchitectuur die kenmerkend is voor gevestigde osteoporose. [4,5] Omdat nieuwbotvormingis voornamelijk een functie van de osteoblast, middelen die werken door ofwel de proliferatie van cellen van de osteoblastische lijn te verhogen of differentiatie van de osteoblasten te induceren, kunnen de botvorming verbeteren. [5,6]
Hoewel de mechanismen van osteoporose onduidelijk blijven, zijn ze waarschijnlijk gerelateerd aan de verminderde beschikbaarheid of effecten van botgroeifactoren, zoals botmorfogenetische eiwitten (BMP's). BMP's, die structureel verwant zijn aan de transformerende groeifactor-b-superfamilie, werden oorspronkelijk geïdentificeerd door hun vermogen om ectopischebot vormingbij knaagdieren.[8] BMP's spelen een belangrijke rol bijbotvormingen botceldifferentiatie door het stimuleren van alkalische fosfatase (ALP) activiteit evenals de synthese van proteoglycaan, collageen en osteopontine (OPN).[9] Een recente studie vond een verband tussen osteoporose en specifieke polymorfismen in de BMP-2-, ALP- en OPN-genen, wat suggereert dat ze geassocieerd zijn met de ontwikkeling van osteoporose.[10]

Cistanchedeserticolama. (Orobanchaceae; afgekort als CD)(Cistanchedeserticola)is een inheems kruid in China en wordt veel gebruikt in de traditionele geneeskunde als een therapeutisch middel vanwege de kalmerende, pijnstillende en immunostimulerende eigenschappen.[11] Moderne farmacologische studies hebben aangetoond dat CD(Cistanchedeserticola)extracten kunnen de immuniteit stimuleren,[12] vrije radicalen wegvangen[13] en de activiteit van superoxide-dismutase verhogen.[14] Ontstekingsremmende en antioxiderende middelen hebben het potentieel om osteoporose te behandelen door debot vormingen/of het onderdrukken van botresorptie. [15,16] Het effect van CD(Cistanchedeserticola)op de botcelfunctie is nog niet vastgesteld. Hier melden we dat CD(Cistanchedeserticola)extract had geen invloed op de proliferatie, migratie of wondgenezingsactiviteit van gekweekte osteoblasten, maar verhoogde de expressie van ALP, BMP-2 en OPN en botmineralisatie. Bovendien laten we zien dat de door mitogeen geactiveerde proteïnekinase (MAPK) en nucleaire factor (NF)-kB-signaalroutes mogelijk betrokken zijn bij de CD-gemedieerde toename in genexpressie en botmineralisatie. In tegenstelling, de CD(Cistanchedeserticola)extract onderdrukte osteoclastogenese in vitro niet. Met name behandeling van muizen met CD(Cistanchedeserticola)extract voorkwam botverlies veroorzaakt door ovariëctomie in vivo. Onze gegevens suggereren daarom dat CD(Cistanchedeserticola)kan worden gebruikt om te stimulerenbotvormingvoor de behandeling van osteoporose.

Cistanche deserticolaboost de immuniteit

Materialen en methodes

Cistanche deserticola extract en materialen

CD(Cistanchedeserticola)extract werd gekocht bij Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Extractie en isolatie van CD(Cistanchedeserticola)werden gevolgd zoals eerder beschreven (op basis van spectrale gegevens hebben ze de chemische samenstelling geïdentificeerd, waaronder bèta-sitosterol, daucosterol, barnsteenzuur, triacontanol, acteoside, betaïne en polysaccharide). Polyklonale antilichamen van konijnen die specifiek zijn voor p-extracellulaire signaal-gereguleerde kinasen (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminale kinasen (JNK), JNK, p-p65 en p65 werden gekocht bij Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, VS). De osteocalcine ELISA-kit werd gekocht bij Biosource Technology (Nijvel, België). De C-terminale telopeptiden van de type-I collageen ELISA-kit werden verkregen van Cross Laps (Herlev, Denemarken). De p38 dominant-negatieve mutant werd geleverd door Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, VS). De JNK dominant-negatieve mutant werd geleverd door Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA). De ERK2 dominant-negatieve mutant werd geleverd door Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Alle andere reagentia werden verkregen van Sigma-Aldrich (St. Louis, VS).

Cel cultuur

De muizen-osteoblastcellijn MC3T3-E1 werd gekocht bij American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, VS). Cellen werden gekweekt in 95 procent lucht, 5 procent CO2 met a-MEM dat was aangevuld met 20 mm HEPES en 10 procent door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum, 2 mm-glutamine, penicilline (100 U/ml) en streptomycine (100 mg /ml).

Meting van gemineraliseerde knobbelvorming

De vorming van gemineraliseerde knobbeltjes werd geëvalueerd zoals beschreven. In het kort, osteoblasten werden gedurende twee weken gekweekt in een medium dat vitamine C (50 mg/ml) en b-glycerofosfaat (10 mm) bevat, en het medium werd om de drie dagen vervangen. Na incubatie met CD(Cistanchedeserticola)extract gedurende 12 dagen, werden de cellen tweemaal gewassen met 20 mm Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,15 m NaCl (pH 7,4) bevatte, gedurende 30 minuten gefixeerd in ijskoude 75 procent (v/v) ethanol, en lucht- droog. Calciumafzetting werd bepaald met behulp van alizarinerood-S-kleuring. In het kort werden met ethanol gefixeerde cellen en matrix 1 uur gekleurd met 40 mm alizarine rood-S (pH 4,2) en uitgebreid gespoeld met water. De gebonden kleurstof werd geëlueerd met 10% (w/v) cetylpyridiniumchloride en alizarine rood-S in de monsters werd gekwantificeerd door de absorptie bij 550 nm te meten en vergeleken met een standaardcurve. Eén mol alizarine rood-S bindt selectief ongeveer twee mol calcium.

Cistanche deserticolais goed voorbotvorming

Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit osteoblasten met behulp van een TRIzol-kit (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd met 2 mg totaal RNA en een oligo(dT)-primer. [19,20] Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) werd uitgevoerd met behulp van TaqMan® eenstaps PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). Totaal cDNA werd toegevoegd (100 ng per 25-ml reactie) met sequentiespecifieke primers en Taqman®-probes. Alle target-genprimers en probes werden commercieel gekocht, inclusief b-actine als interne controle (Applied Biosystems). qPCR-assays werden in drievoud uitgevoerd op een StepOnePlus-sequentiedetectiesysteem (Applied Biosystems). De cyclusomstandigheden waren 10-min polymerase-activering bij 95 graden gevolgd door 40 cycli van 95 graden gedurende 15 seconden en 60 graden gedurende 60 seconden. De drempel werd ingesteld boven de niet-sjablooncontroleachtergrond en binnen de lineaire fase van doelgenamplificatie om het cyclusnummer te berekenen waarbij het transcript werd gedetecteerd (aangeduid als CT).

Western-blot-analyse

Cellysaten werden bereid zoals eerder beschreven. [21,22] Eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar Immobilon polyvinyldifluoridemembranen (Millipore, Billerica, VS). De blots werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 4 procent runderserumalbumine en vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onderzocht met anti-menselijke antilichamen van konijnen tegen p-65, of p-p65 (1:1000). Na drie wasbeurten werden de blots gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met peroxidase-geconjugeerd ezel-anti-konijn secundair antilichaam (1:1000). De blots werden zichtbaar gemaakt door verbeterde chemiluminescentie met behulp van X-OMAT LS-film (Eastman Kodak, Rochester, VS).

Door ovariëctomie geïnduceerde osteoporose

Voor dit onderzoek werden vrouwelijke ICR-muizen, vier weken oud, 22~28 g gebruikt. Muizen werden bilateraal onder anesthesie met trichlooracetaldehyde (100 mg/kg) aan de eierstokken verwijderd en controlemuizen werden ter vergelijking schijngeopereerd (Sham). Botmineraaldichtheid en botmineraalgehalte werden gemeten na orale toediening van verschillende concentraties CD(Cistanchedeserticola)extract elke twee dagen gedurende vier weken. De totale lichaamsbotmineraaldichtheid en het botmineraalgehalte werden bepaald door een dual-energy röntgenabsorptiometer (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, VS) met behulp van een modus voor kleine proefpersonen zoals eerder beschreven.[18, 23] Alle protocollen voldeden aan de institutionele richtlijnen en werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de China Medical University.

statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met Prism 4.01 software. (GraphPad Software Inc., San Diego, VS). De gegeven waarden zijn gemiddelde SEM. Statistische analyse tussen twee monsters werd uitgevoerd met behulp van de Student's t-test. Statistische vergelijkingen van meer dan twee groepen werden uitgevoerd met behulp van een one-way variantieanalyse met Bonferroni's posthoc-test. In alle gevallen werd P <0,05 als="" significant="">

Cistanche deserticolais goed voorbotvorming

Resultaten

Cistanche deserticolaextract verhoogt botmineralisatie door osteoblasten Toevoeging van de CD(Cistanchedeserticola)extract gedurende 24 of 48 uur had geen invloed op de proliferatie van muis osteoblast MC3T3-E1-cellen in een MTT-assay (gegevens niet getoond). Omdat osteoblastdifferentiatie een complex proces is waarbij celproliferatie en migratie betrokken zijn, hebben we ook het migratievermogen van MC3T3-E1-cellen getest na behandeling met CD(Cistanchedeserticola)extract. Met behulp van Transwell- en wondgenezingsassays ontdekten we dat CD(Cistanchedeserticola)extract had geen invloed op osteoblastmigratie (gegevens niet getoond). De vorming van gemineraliseerde knobbeltjes is een van de markers van osteoblastrijping. Kleuring met alizarinerood S toonde aan dat gemineraliseerde knobbeltjes werden gevormd wanneer osteoblasten gedurende twee weken werden gekweekt in een medium dat vitamine C (50 ug/ml) en -glycerofosfaat (10 mm) bevat, de concentratie-afhankelijke manier door toevoeging van CD(Cistanchedeserticola)(Figuur 1a). Daarom, CD(Cistanchedeserticola)extract geïnduceerde botknobbelvorming door gekweekte osteoblasten, maar niet hun proliferatie of migratie. We onderzochten ook de rol van CD(Cistanchedeserticola)extract in RANKL-geïnduceerde osteoclastogenese maar vond geen effect (gegevens niet getoond).

Cistanche deserticola-extract verhoogt de expressie van alkalische fosfatase, botmorfogenetisch eiwit-2 en osteopontine in gekweekte osteoblasten

Gedifferentieerde osteoblasten vertonen verhoogde ALP-activiteit, wat correleert met hoge niveaus van enzymexpressie. We vonden dat behandeling met CD(Cistanchedeserticola)extract gedurende 72 uur verhoogde de osteoblast ALP-activiteit significant (Figuur 1b). Gezien de cruciale rol van BMP-2, ALP en OPN in osteoblastdifferentiatie, hebben we getest of CD(Cistanchedeserticola)extract oefent zijn effect uit op osteoblastdifferentiatie door BMP-2-, ALP- en OPN-expressie te reguleren. Behandeling van cellen met CD(Cistanchedeserticola)extraheert verhoogde mRNA-expressie van ALP, BMP-2 en OPN op een concentratieafhankelijke manier (Figuur 1c), wat aantoont dat CD(Cistanchedeserticola)extract geïnduceerde differentiatie van osteoblasten door ALP-, BMP-2- en OPN-expressie te verhogen.

Cistanche deserticola-extract verhoogt de vorming van botknobbeltjes via de door mitogeen geactiveerde proteïnekinaseroute

Er is gemeld dat MAPK een belangrijke rol speelt bijbotvorming[24,25] dus onderzochten we vervolgens of deze signaalroute betrokken is bij CD(Cistanchedeserticola)extract-geïnduceerde botmineralisatie. Voorbehandeling van cellen met ERK-remmer U0126, p38-remmer SB203580 of JNK-remmer SP600125 verminderde CD(Cistanchedeserticola)extract-verhoogde botmineralisatie (figuren 2a, 3a en 4a). Bovendien blokkeerden de remmers ook CD(Cistanchedeserticola)extract-geïnduceerde ALP-, BMP-2- en OPN-expressie (figuren 2b-4c). Transfectie van cellen met ERK2, p38 of JNK-mutant verminderde CD(Cistanchedeserticola)extract-toename in ALP-, BMP-2- en OPN-mRNA-expressie (figuren 2c, 3c en 4c). Vervolgens onderzochten we direct de ERK-, p38- en JNK-activering na CD(Cistanchedeserticola)extract behandeling. Incubatie van cellen met CD(Cistanchedeserticola)extract geïnduceerde ERK-, p38- en JNK-fosforylering (figuren 2d, 3d en 4d). Daarom bemiddelen ERK, p38 en JNK de verhoogdebotvorminggeïnduceerd door CD(Cistanchedeserticola)behandeling van osteoblasten.

Cistanche deserticola-extract verhoogt de vorming van botknobbeltjes via de nucleaire factor-kB-route

Zoals eerder vermeld, is NF-kB-activering nodig voor:botvorming[26,27] Vervolgens behandelden we osteoblasten met de NF-kB-remmers pyrrolidine dithiocarbamaat (PDTC) en N-tosyl-L-fenylalanine chloormethylketon (TPCK) werden gekocht bij Calbiochem (Darmstadt, Duitsland) om te bepalen of NF-kB-activering is betrokken bij CD(Cistanchedeserticola)extract-geïnduceerde botmineralisatie. Figuur 5a laat zien dat voorbehandeling van osteoblasten met PDTC of TPCK CD . remde(Cistanchedeserticola)extract-geïnduceerde botknobbelvorming, en verminderde ook de toename van ALP-, BMP-2- en OPN-expressie (Figuur 5b en 5c). Fosforylering van de NF-kB p65-subeenheid is een indicator van NF-kB-activering; [28] consistent hiermee vonden we dat CD(Cistanchedeserticola)extraheer verhoogde p65-fosforylering in de osteoblasten (Figuur 5d). Deze resultaten gaven aan dat NF-kB-activering belangrijk is voor door CD-extract geïnduceerde ALP-, BMP-2- en OPN-expressie en botknobbelvorming.

Figuur 4 Betrokkenheid van c-Jun N-terminale kinasen (JNK) bijCistanchedeserticola(CD) extract-geïnduceerde botmineralisatie in osteoblasten. (a) Cellen werden uitgeplaat in 24-putjesplaten en gedurende twee weken gekweekt in een medium dat vitamine C (50 mg/ml) en b-glycerofosfaat (10 mM) bevat. De cellen werden gelijktijdig behandeld met CD(Cistanchedeserticola)extract (26 mg/ml) plus SP600125 (3 mM). De vorming van gemineraliseerde knobbeltjes werd bepaald door kleuring met alizarinerood-S (n=5). (b, c) Cellen werden 30 minuten voorbehandeld met SP600125 of getransfecteerd met JNK-mutant of 24 uur gevolgd door stimulatie met CD-extract en alkalische fosfatase (ALP) -activiteit en ALP, botmorfogenetisch eiwit (BMP) -2 en osteopontine (OPN) mRNA-expressie werd gemeten met ALP-kit en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie. ( d ) Cellen werden behandeld met CD-extract gedurende aangegeven tijdsintervallen en p-JNK-expressie werd onderzocht door Western-blotting. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)met extract behandelde groep.

Remming van botverlies door Cistanche deserticola-extract bij muizen waarbij de eierstokken zijn verwijderd

Het effect van CD onderzoeken(Cistanchedeserticola)extract op botverlies, werd osteoporose geïnduceerd bij vrouwelijke muizen door ovariëctomie. Zoals verwacht vertoonden ovariëctomie muizen een verminderde totale lichaamsbotmineraaldichtheid en botmineraalgehalte (Figuur 6a en 6b). Behandeling met CD(Cistanchedeserticola)extract gedurende vier weken remde het verlies van botmineraaldichtheid en botmineraalgehalte op een dosisafhankelijke manier (Figuur 6a en 6b). Bloedconcentraties van ALP kunnen de osteoblastische activiteit weerspiegelen.[29] Zoals weergegeven in figuur 6c, CD(Cistanchedeserticola)extract remde de afname in serum ALP-activiteit veroorzaakt door ovariëctomie. Bovendien, CD(Cistanchedeserticola)extract verhoogde ook het niveau van osteocalcine, een marker vanbotvormingen verminderde het niveau van C-terminale telopeptiden van type I collageen, een marker van botresorptie (Figuur 6d en 6e). Deze bevindingen ondersteunen dus de potentie en werkzaamheid van CD(Cistanchedeserticola)extract bij het voorkomen van botverlies in vivo.

Figuur 6 Door remming van ovariëctomie veroorzaakte de afname van de botmineraaldichtheid en het botmineraalgehalte metCistanchedeserticola(CD-)uittreksel. Vrouwelijke ICR-muizen kregen een schijnoperatie of werden ovariëctomie ondergaan. Ovariëctomie muizen werden behandeld met de aangegeven concentraties CD(Cistanchedeserticola)extract door orale voeding. Totale lichaamsbotmineraaldichtheid (a), botmineraalgehalte (b), serum alkalische fosfatase (ALP) activiteit (c), serum osteocalcine (d) en serum C-terminale telopeptiden van type I collageen (e), werden vier keer bepaald. weken na de operatie. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde SE, n=8–10 muizen/groep. *P < 0.05,="" vergeleken="" met="" schijnvertoning;="" #p=""><0,05, vergeleken="" met="" de="">

DISCUSSIE

Klik hier voor informatie over Deel II (Discussie en Conclusie) van dit artikel.

Van: 'Cistanchedeserticolaextract neemt toebotvormingin osteoblasten' doorTe-Mao Li^aet al

---© 2012 De auteurs. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Tijdschrift voor Farmacie en Farmacologie, 64, blz. 897-907