Cistanoside van Cistanche Herba verbetert door hypoxie geïnduceerde reproductieve schade bij mannen door onderdrukking van oxidatieve stress-Ⅰ

Invoering

Momenteel worden wereldwijd ongeveer 48,5 miljoen (15%) paren in de vruchtbare leeftijd getroffen door onvruchtbaarheid, waarvan 40-50% van de gevallen wordt toegeschreven aan mannelijke onvruchtbaarheid, een aandoening die sterk verband houdt met omgevings- en levensstijlfactoren. Er zijn aanwijzingen dat de gevoeligheid van de testis van zoogdieren voor lage zuurstofdruk een oorzakelijke factor is bij sommige vormen van mannelijke onvruchtbaarheid. Zoals in eerdere onderzoeken is aangetoond, wordt de spermatogenese verstoord en verminderd bij blootstelling aan hypobare hypoxie.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Om het onderliggende mechanisme te onderzoeken, hebben onderzoeken aangetoond dat blootstelling aan hypobare hypoxie de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) verhoogt. ROS speelt een belangrijke rol in het mannelijke voortplantingssysteem. Op lage niveaus zijn ze nodig voor de capaciteit van het sperma, de acrosoomreactie en de fusie van spermatozoa en eicellen [10]. Overmatige ROS kan echter schade aan het kern-/mitochondriale DNA van het sperma en peroxidatieve schade aan het plasmamembraan veroorzaken, wat op zijn beurt belangrijke etiologische factoren zijn voor de ziekte.verhoogd risico op mannelijke onvruchtbaarheid. De accumulatie van door hypoxie geïnduceerde ROS zou dus een oorzaak kunnen zijn van mannelijke onvruchtbaarheid.

Cistanches Herba, een meerjarige parasitaire medicinale plant, wordt wijd verspreid in droge gebieden en wordt op grote schaal gebruikt vanwege zijn farmacologische activiteiten. Onder alle effectieve inhoud vanCistanches Herbaworden PhG's beschouwd als het belangrijkste actieve bestanddeel. Tot nu toe zijn er 34 PhG's geïsoleerdCistanches-planten. Cistanoside(Cis), een actief PhG geïsoleerd uitCistanches Herba, heeft aandacht gekregen vanwege de antioxiderende effecten.

Gezien de antioxiderende effecten van Cis en de rol van ROS bij door hypoxie geïnduceerde mannelijke onvruchtbaarheid, wordt Cis beschouwd als een potentieel kandidaat-geneesmiddel voor de behandeling vanhypoxie-geïnduceerde mannelijke onvruchtbaarheid. Er zijn echter weinig rapporten die ingaan op de antioxiderende effecten van Cis geëxtraheerd uit Cistanches Herba bij de behandeling van door hypoxie geïnduceerde mannelijke onvruchtbaarheid of de betrokken signaalroutes. In deze studie werden in vitro en in vivo experimentele modellen voor hypoxie geconstrueerd en werden de effectcomponenten van verschillende Cis beoordeeld.

materialen en methodes

Celcultuur en reagens

De muis-spermatogonia-cellijn GC-1spg (GC-1) werd gekocht bij de American Type Culture Collection (ATCC) en gekweekt in DMEM (Invitrogen, VS) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% L-glutamine (100 mM), penicilline (100 U/ml) en streptomycine (100 ug/ml) bij 37 graden in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) werd gekocht bij Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (China).

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cellevensvatbaarheidstest

De levensvatbaarheid van de cellen werd getest met een celtelkit{{0}}-test (CCK-8). In het kort werden GC-1-cellen in platen met 96-putjes gezaaid bij 1,5×103 per putje, en 24 uur bij 37 graden gekweekt. Vervolgens werden de cellen behandeld met verschillende concentraties (20%, 15%, 10%, 5%) zuurstof of verschillende concentraties (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) gedurende de vereiste tijd. Vervolgens werd het supernatant weggegooid en werd de levensvatbaarheid van de cellen gedetecteerd met behulp van een CCK-8-kit (Dojindo Japan). De absorptie van elk putje werd gemeten bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer (BioRad USA). Ten slotte werden de levensvatbaarheid van de cellen berekend volgens de volgende formule: Levensvatbaarheid van de cellen=(ODexperimentele groep - ODblank-groep)/ (OD-controlegroep - ODblank-groep) × 100%.

Western blot-analyse

Geoogste cellen of weefsels werden gehomogeniseerd in RIPA-buffer om eiwitten te extraheren (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Zwitserland). Supernatanten werden verzameld en de concentratie van eiwitten werd getest met de BCA-methode (Beyotime). Ongeveer 40 µg van de geëxtraheerde eiwitten uit elk monster werd gescheiden door SDS-PAGE en elektrisch overgebracht op een nitrocellulose (NC) filtermembraan (Beyotime China). NC-filtermembranen werden gedurende 1,5 uur geblokkeerd met 5% magere melk en geïncubeerd met specifieke antilichamen (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1 :1000, anti-GAPDH 1:1000; alle antilichamen werden 's nachts bij 4 graden gekocht bij Cell Signaling Technology, VS. Vervolgens werden alle NC-membranen gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met het overeenkomstige met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichaam en afgebeeld met een beeldvormingssysteem (Tannon, China).

Detectie van de celcyclus

Een flowcytometrische test (FCM) werd uitgevoerd om de celcyclus te analyseren. Cellen werden 72 uur onder verschillende omstandigheden behandeld en geoogst. De cellen werden vervolgens gewassen met PBS, gefixeerd in 75% ethanol en gekleurd met propidiumjodide (PI). Voor elk monster werden 1 x 104 cellen verzameld en geanalyseerd met behulp van flowcytometrie (FACS Calibur, BD Biosciences). Vervolgens werden het aandeel G1/S/G2-fasecellen en de proliferatie-index [Fase(S+G2)/Phase(G1+S+G2) × 100%] berekend.

Ki-67 kleuring

Cellen werden gekweekt in een confocale schaal en gedurende 72 uur behandeld met hypoxie of verschillende subtypes van Cis. Nadat alle cellen waren gefixeerd met 4% paraformaldehyde, werden ze geïncubeerd met een anti-Ki-67 antilichaam (1:200, Cell Signaling Technology). Vervolgens werden alle cellen geïncubeerd met een overeenkomstig CY-3-geconjugeerd anti-konijn IgG-antilichaam (1:200, Boster, China) en DAPI-oplossing (1,0 ug/ml, Beyotime). Fluorescentie werd waargenomen met een Fluoview FV1000 confocale microscoop (Olympus, Japan).

TOP-TIER CISTANCHE TUBULOSA-EXTRACT VOOR HET VERHOGEN VAN TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Detectie van ROS

FCM werd geïntroduceerd om intracellulaire ROS-niveaus te meten met behulp van DCFH-DA. Gesuspendeerde cellen werden in 6-putjesplaten gezaaid en onderworpen aan verschillende behandelingen. Na 72 uur behandeling werden de cellen gesuspendeerd in serumvrij DMEM met 10 μM DCFH-DA (Beyotime). De ROS-inhoud werd vervolgens bepaald door fluorescentie-geactiveerde celsortering op een Beckman Coulter Flow Cytometry System met een excitatiegolflengte van 488 nm en emissiegolflengte van 525 nm [18].

Bepaling van lipideperoxidatie (LPO)

De test met thiobarbituurzuurreactieve stoffen (TBARS) werd uitgevoerd om LPO te detecteren. Alle bedieningsstappen werden uitgevoerd volgens de instructies (Sigma USA). De concentraties werden berekend met behulp van een molaire extinctiecoëfficiënt van 1,56 x 105/(M·cm), die werd verkregen met gebruikmaking van malondialdehyde als standaard. De resultaten worden uitgedrukt als nmol MDA-equivalenten/mg eiwit.

Bepaling van enzymactiviteiten

De enzymactiviteiten werden getest met behulp van testkits, waaronder glutathionreductase (GR), glutathionperoxidase (GPx) en superoxide-dismutase (SOD). Alle bedieningsstappen werden uitgevoerd volgens de meegeleverde instructies (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).

Dieren en experimenteel protocol

Volwassen mannelijke Wistar-ratten (180-220 g, 8 w oud) werden verkregen van het dierencentrum van de Vierde Militaire Medische Universiteit, Xi'an, China. Toestemming voor het gebruik van de dieren is verkregen van de Universitaire Ethische Commissie (referentienummer: 20190506). De dierproef is uitgevoerd volgens universitaire richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

Alle ratten mochten zich ongeveer 1 week vóór aanvang van het experiment aanpassen. Na acclimatisatie werden de ratten willekeurig verdeeld in 6 groepen met 5 dieren in elke groep. De ratten in de controlegroep werden grootgebracht onder normale druk (PO2: 20%; luchtdruk: 101,3 kPa), terwijl de ratten in de model- en Cis-behandelde groepen werden grootgebracht in een lagedrukzuurstofkamer (interne druk van 61,6 kPa). , equivalent aan een hoogte van 4000 meter boven zeeniveau; PO2: 14,55%) om een ​​hypoxische omgeving op grote hoogte te simuleren. Alle ratten hadden vrije toegang tot voedsel en water in plastic kooien bij een temperatuur van 22 ± 2 graden en een vochtigheidsgraad met een automatische licht/donkercyclus van 12- uur. De ratten in de model- en Cis-behandelde groepen bleven onder hypobare omstandigheden, maar werden elke 96 uur overgebracht naar normobare omstandigheden, waarna hen voedsel en water werd verstrekt en de kooien werden schoongemaakt. De duur van de overgang van hypobaar naar hypobaar was ongeveer 2 uur. Alle behandelingsgroepen werden behandeld met de overeenkomstige Cis (8 mg/kg/d) via orale sondevoeding gedurende 8 weken, terwijl de controle- en modelratten werden behandeld met een gelijk volume water.

Na 8 weken werden ratten onder verdoving gedood. Testes, epididymis en zaadblaasjes werden gescheiden en gewogen, en de orgaanindex werd berekend volgens de volgende formule: (gewicht van orgaan/diergewicht) x 100%. Vervolgens werd sperma in de epididymis verzameld en werden hun beweeglijkheid en acrosoomenzymactiviteit getest. Op dezelfde manier werden testiculaire weefsels verzameld voor histopathologische onderzoeken en detectie van ROS-, LPO- en antioxidant-enzymactiviteit.

CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT CISTANCHE KRUID VERHOOGT SEX POWER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Evaluatie van het aantal levende spermacellen

De epididymis werd ingesneden met een chirurgische schaar en de spermasuspensie werd bereid in een normale zoutoplossing. Om de hoeveelheid levend sperma te evalueren, werd 5 μl van de spermasuspensie zorgvuldig gemengd met een gelijk volume eosine-Y-kleuring. Het sperma werd vervolgens geteld onder een lichtmicroscoop. De aantallen levend sperma werden beoordeeld door zowel gekleurd (dood sperma) als ongekleurd sperma (levend sperma) te berekenen.

Bepaling van de activiteit van het sperma-acrosoomenzym

De sperma-acrosoomenzymactiviteitstest werd gebruikt om sperma-acrosoomenzymen te evalueren [19]. De resultaten in elke groep werden berekend met behulp van de volgende formule: Acrosoom-enzymactiviteit (μIU)=(ODExperimentgroep - ODBlank-groep)/(247,5×10) × 106.

Resultaten

Effecten van hypoxie op GC-1-cellen

Om de effecten van hypoxie op geslachtscellen te bepalen, onderzochten we eerst de veranderingen in de levensvatbaarheid van de cellen na behandeling met hypoxie met verschillende zuurstofconcentraties (20%, 15%, 10% en 5%) voor 1, 3, 5 en respectievelijk 7 dagen. De resultaten van de CCK-8-test toonden aan dat cellen die waren blootgesteld aan hypoxie, vergeleken met de controlegroep (20% zuurstofconcentratie), een significante afname in levensvatbaarheid vertoonden (P <0,01; Figuur 1A). Bovendien was hun overlevingspercentage omgekeerd evenredig met de zuurstofconcentratie en nam verder af naarmate de inductietijd verstreek. Om een ​​overmatig cytotoxisch effect te voorkomen, werden een zuurstofconcentratie van 10% en een inductietijd van 3-dagen geselecteerd als de hypoxische modelcriteria voor daaropvolgende in vitro-experimenten.

Vervolgens werden FCM- en immunofluorescentiekleuring uitgevoerd om de proliferatieverandering van GC{{0}}-cellen onder hypoxiebehandeling verder te evalueren. De resultaten toonden aan dat hypoxie het arresteren van GC-1-cellen in de G1-fase kan veroorzaken, waardoor de celtoegang tot de S-fase wordt verminderd en de DNA-replicatie wordt geremd. Hypoxie verminderde dus aanzienlijk de proliferatie-index van GC-1-cellen (P <0,01; Figuur 1B). Positieve Ki-67-kleuring is een andere specifieke biomarker voor prolifererende cellen. Daarom onderzochten we ook de verhouding van Ki-67-positieve cellen met of zonder hypoxiebehandeling. Vergeleken met de controlegroep verminderde behandeling met hypoxie opmerkelijk de Ki-67--positieve cellen, zoals weergegeven in figuur 1C.

Vervolgens wilden we de wijze van remming van de levensvatbaarheid van GC{0}}-cellen, geïnduceerd door hypoxie, onderzoeken. Zoals gerapporteerd in de literatuur nam het niveau van ROS toe naarmate ratten werden blootgesteld aan een hypobare hypoxische omgeving [8, 20]. Daarom werden endogene ROS-niveaus in GC-1-cellen gemeten met behulp van de FCM-test. De resultaten toonden hogere ROS-niveaus onder hypoxie in vergelijking met de normale zuurstofgroep (P <0,01; Figuur 1D). Geaccumuleerde ROS veroorzaakt duidelijke DNA-schade, die op zijn beurt activering van de celapoptoseroute veroorzaakt en mogelijk de belangrijkste etiologische factor is voor het toenemende risico op mannelijke onvruchtbaarheid [21, 22]. Vervolgens hebben we het apoptotische activeringseffect van hypoxie op GC-1-cellen gedetecteerd door middel van TUNEL-kleuring. Zoals weergegeven in Figuur 1E resulteerde de behandeling met hypoxie in een toename van de TUNEL-fluorescentie vergeleken met de controlegroep, wat wijst op een toename van de apoptose in de modelgroep.

Omdat door ROS geïnduceerde celbeschadiging meestal wordt veroorzaakt door OS, hebben we de OS van GC-1-cellen verder getest. Zoals weergegeven in Figuur 1F waren de LPO-niveaus van GC-1-cellen in de modelgroep aanzienlijk verhoogd vergeleken met de LPO-niveaus van GC-1-cellen in de controlegroep. Deze bevindingen suggereerden dat door hypoxie geïnduceerde GC-1-celbeschadiging verband zou kunnen houden met OS, dat wordt geïnduceerd door ROS-accumulatie.