Citral-bevattende etherische oliën als potentiële tyrosinase-remmers: een biologisch geleide fractioneringsbenadering

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstract:

Overmatige melanineproductie veroorzaakt ernstige dermatologische aandoeningen en kleine esthetische problemen (dwz sproeten en zonnelentigo). De neerwaartse regulatie van tyrosinase is een wijdverbreide benadering voor de behandeling van dergelijke aandoeningen, en plantenextracten hebben vaak bewezen waardevolle bronnen vantyrosinaseremmers. Citral (een mengsel van neral en geranial) is een belangrijke geurstof die een anti-tyrosinase-potentieel heeft aangetoond. Het is sterk geconcentreerd in de essentiële oliën (EO's) van Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. en Verbenaofficinalis L. Er is echter alleen L. cubeba EO onderzocht op gebruik als een potentieel huidbleekmiddel. Dit werk evalueert de in vitrotyrosinaseremmende activiteit van deze EO's en onderzoeken, met behulp van bio-assay-georiënteerde fractionering, of hun verschillende chemische samenstellingen de algehele EO-remmende activiteiten beïnvloeden via mogelijke synergetische, additieve en/of competitieve interacties tussen EO's-componenten. De remmende activiteit van C. schoenanthus EO en die van M. officinalis EO's, met verwaarloosbare (plus)-citronellale hoeveelheden, waren in lijn met hun citral-gehalte. Aan de andere kant, L. cubebaand V. officinalis EO's geremdtyrosinasein aanzienlijk grotere mate omdat ze -myrceen bevatten, wat bijdroeg aan de algemene EO-activiteiten. Soortgelijke waarnemingen werden gedaan voor M. officinalis EO, dat een hoog (plus)-citronellalgehalte heeft dat de citral-activiteit verhoogde.

trefwoorden:tyrosinaseremming; essentiële oliën; citral

cistanche heeft een bleekfunctie

Invoering

Tyrosinaseis het sleutelenzym in de biosynthese van melaninepigmenten in verschillende bacteriën, schimmels, planten, dieren en mensen. Bij mensen katalyseert tyrosinase de snelheidsbeperkende stappen in de biosyntheseroute van melanine. Deze biosynthese wordt gekenmerkt door verschillende enzymatische en chemische reacties die leiden tot de vorming van melanine uit het aminozuur L-tyrosine, waarbij tyrosinase de hydroxylering ervan tot o-dopaquinon katalyseert via zijn mycofenolaat- en difenolactiviteiten. Hoewel er andere enzymen betrokken zijn bij melanogenese, kunnen alleen de door tyrosinase gekatalyseerde reacties niet spontaan plaatsvinden, terwijl de resterende stappen kunnen verlopen zonder enzymactiviteit bij fysiologische pH [1]. Om deze reden is tyrosinase-downregulatie een zeer wijdverbreide benadering van de reductie van overmatige melanine productie en het gebruik van tyrosinaseremmers als huidbleekmiddelen heeft aanzienlijke klinische en cosmetische bekendheid aangetoond [2].

Op de EU-markt zijn detyrosinaseremmers die als huidbleekmiddelen worden gebruikt, kunnen in twee hoofdcategorieën worden ingedeeld: de remmers die zijn verboden onder de EU-cosmeticaverordening 1223/2009 (dwz hydrochinon en monobenzyletherhydrochinon) vanwege hun ernstige bijwerkingen, maar die nog steeds worden gebruikt voor de behandeling van hyperpigmentatie onder medische toezicht;en tyrosinaseremmers die zijn toegestaan ​​voor gebruik in cosmeticaproducten (dwz arbutine, aloësine, kojiczuur) [2,3]. Deze tweede groep wordt echter nog steeds gekenmerkt door potentieel significante bijwerkingen; klinische onderzoeken naar kojiczuur hebben inderdaad gevallen van erytheem, branderig gevoel en contacteczeem na toediening aan het licht gebracht. Evenzo heeft het Europees Wetenschappelijk Comité voor consumentenveiligheid bezorgdheid geuit over het gebruik van arbutinas, een cosmetisch ingrediënt [2], vanwege de mogelijke hydrolyse van de glycosidische binding die hydrochinon vrijmaakt. Er is daarom behoefte aan nieuwe molecuultemplates en/of mengsels van bioactieve verbindingen om hyperpigmentatie te behandelen.

Planten zijn waardevolle bronnen van huidbleekmiddelen geweest en drie van de vijf van de meest gebruikte middelen, zowel medisch als cosmetisch, zijn gespecialiseerde plantenmetabolieten (dwz hydrochinon, -arbutine, aloësine). Tot op heden zijn fenolische verbindingen voornamelijk onderzocht als potentieeltyrosinaseremmers, en deze omvatten flavonoïden (bijv. quercetine [4]), stilbenen (bijv. resveratrol [1]), fenylpropanoïden (bijv. kaneelaldehyde [5] en eugenol [6]), en fenolzuren (bijv. anijszuur en benzoëzuur [7]). De belangstelling voor forterpenoïden is aanzienlijk lager geweest en ze zijn relatief weinig onderzocht als anti-tyrosinasemiddelen.

Citral behoort tot het beperkte aantal terpenoïdederivaten met anti-tyrosinase-eigenschappen die zijn onderzocht. Het is een mengsel van twee isomeren, cis- en trans-3,7-dimethyl-2,6-octadienal (dwz neral en geranial), waarvan is bewezen dat ze de in vitro enzymatische activiteit van paddenstoelentyrosinase[8]. Naast het belang ervan als geurig ingrediënt in dranken, voedingsmiddelen en cosmetica, heeft citral veelbelovende in vitro biologische activiteiten aangetoond, waaronder antischimmel-, antibacteriële, antioxiderende en ontstekingsremmende effecten [9-11]. Bovendien hebben recente studies benadrukte dat citral potentiële therapeutische betekenis heeft als een gladde spierontspanner en lokaal anestheticum, omdat het ontspanning bevordert in de tracheale, baarmoeder en aorta gladde spieren en de zenuwprikkelbaarheid remt in diermodellen [12-15].

Citral wordt verkregen uit de essentiële oliën (EO's) van verschillende botanische soorten, waaronder Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. en Verbena officinalis L. kennis, alleen L. cubeba EO is onderzocht voor zijntyrosinaseremmende activiteit [16]. Daarom heeft deze studie tot doel de tyrosinaseremmende activiteiten van C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis en V.officinalis EO's te evalueren, met behulp van een in vitro colorimetrische test, om te beoordelen of de verschillende chemische samenstellingen de algehele EO-remmende activiteiten beïnvloeden via mogelijke synergetische, additieve en/of competitieve interacties tussen hun componenten. Deze studie maakt gebruik van een door bioassay geleide fractioneringsbenadering om de EO-bestanddelen en hun enantiomeren, indien chiraal, die bijdragen aan de EO-remmende activiteit tegen een paddenstoelenbron van tyrosinase, uitgebreid te evalueren, wat een goed modelsysteem is voor de voorlopige screening vantyrosinaseremmers [17].

2. Resultaten en discussie

2.1. Chemische samenstelling en citralgehalte van de onderzochte etherische olie

In onze poging om alle potentiële EO-componenten die bijdragen aan de beschouwde biologische activiteit volledig te karakteriseren, werden de onderzochte EO's geanalyseerd door GC, met zowel FID- als MS-detectie. De genormaliseerde relatieve percentage-abundanties (berekend uit de absolute gebieden genormaliseerd naar de interne standaard C13 met behulp van responsfactoren [18,19]) van alle gedetecteerde verbindingen werden bepaald en gebruikt om de EO-samenstellingen te vergelijken. Figuur 1 geeft het GC-MS-profiel weer van de onderzochte EO's die zijn geanalyseerd met een conventionele kolom. Tabel 1 geeft voor elke onderzochte EO de verbindingen weer die een genormaliseerde percentage-abundantie boven 0.1 vertoonden, terwijl de volledige EO-chemische samenstellingen worden gerapporteerd in de aanvullende materialen (tabellen S1-S5).

Alle onderzochte EO's zijn rijk aan neral (cis{{0}},7-dimethyl-2,6-octadienal) engeranial (trans-3,{ {5}}dimethyl-2,6-octadienal), de meest voorkomende verbindingen. De verhouding algemeen/geraniaal was in alle onderzochte EO's zeer vergelijkbaar en kwam overeen met 0.74 ± 0.05. De EO's van C. schoenanthus en L. cubeba vertonen het hoogste gehalte aan neral en geranial, dat gemiddeld 60 procent van hun totale EO-composities uitmaakt, en dat 1.5-maal groter is dan in V. officinalis EO en in de drie M. officinalis EO's (dwz monster 1, 2 en 3). De extra zuurstofverbindingen die alle EO's gemeen hebben, zijn 6-methyl-5-hepten-1-one, linalool en citronellal. Dit laatste komt significant meer voor in de M. officinalis EO 1 dan in de andere onderzochte EO's, waaronder de M. officinalis EO2 en 3.

De abundantie van de koolwaterstoffractie varieert aanzienlijk in de verschillende EOs.M. officinalis EO 1 bevat alleen trans- -caryofylleen en -humuleen als sesquiterpeenkoolwaterstoffen, die respectievelijk 2,7 procent en 0,13 procent van de totale EO uitmaken. De C.schoenanthus EO heeft een iets rijkere koolwaterstoffractie dan M. officinalis EO 1 (dwz 7,0 procent), die beide monoterpenen (dwz kamfeen, cis) bevat{{1{{20} }}}}ocimeen, limoneen, -pineen,trans- -ocimeen, -thujeen) en sesquiterpenen (dwz trans- -caryofylleen, -cadineen,δ-cadineen, germacrene D, -elemene) in matige bedragen. In de EO's van L. cubeba en V.officinalis is de koolwaterstoffractie goed voor 20 procent van de totale EO en is limoneen de meest voorkomende verbinding (respectievelijk 15,0 en 10,9 procent), gevolgd door -pineen, pineen , sabineen, trans- -caryofylleen, -myrceen, kamfeen en -copaeen. Ten slotte worden M.officinalis EO 2 en 3 gekenmerkt door het hoogste gehalte aan koolwaterstoffracties (respectievelijk 38,8 procent en 31,8 procent van de totale EO). In beide monsters bevat de koolwaterstoffractie voornamelijk sesquiterpenen, namelijk trans- -caryofylleen (respectievelijk 27,8 procent en 20,0 procent) en -humuleen (3,0 procent en 2,6 procent), en een gereduceerde monoterpeenfractie die voornamelijk wordt gekenmerkt door limoneen ( respectievelijk 4,2 procent en 3,2 procent).

Drie monsters van L. cubeba, V. officinalis en C. schoenanthus Eos die in verschillende jaren waren geproduceerd, evenals drie monsters van M. officinalis EO's van verschillende fabrikanten werden onderzocht. GC-MS-analyses van C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis en V. officinalis brachten geen significante kwalitatieve en kwantitatieve verschillen aan het licht in de chemische samenstelling van de drie monsters van verschillende productiejaren. Dit kan worden toegeschreven aan optimale bewaarcondities, dwz in een amberkleurige glazen container bij 4 ◦C in het donker met een verwaarloosbare kopruimte. Anderzijds lieten GC-MS-analyses significante verschillen zien in de abundanties van citronellal en trans{{4 }}caryofylleen in de drie onderzochte M. officinalis EO's. Citronellala bedroeg respectievelijk 19,6 procent, 0,26 procent en 0,31 procent in de M. officinalis EO 1, 2 en 3. Integendeel, zoals eerder beschreven, komt trans- -caryofylleen aanzienlijk meer voor in de M. officinalis EO's 2 en 3 dan in M. officinalis EO 1. Deze resultaten komen overeen met de bevindingen gerapporteerd door Seidler-Lozykawska et al., die significante verschillen in citral-, citronellal- en trans- -caryofylleen-abundanties in de EO's benadrukten die werden verkregen uit 22 geselecteerde M. officinalis-genotypen afkomstig uit Europese botanische tuinen [20].

Een echte kwantificering werd uitgevoerd door de externe standaardkalibratie om de overvloed aan potentiële bioactieve gespecialiseerde verbindingen (dwz neral, geranial, limoneen, -myrceen en citronellal) nauwkeurig te evalueren. Tabellen 2 en 3 rapporteren de diagnostische ionen (m/z) die worden gebruikt voor SIM- MS-kwantificering van de markerverbindingen die worden onderzocht samen met respectievelijk het kalibratiebereik, de kalibratiecurvevergelijking, correlatiewaarden en regressiestandaardfout van elke analyt en de kwantificeringsresultaten.

2.2. In vitro remmende activiteit van de onderzochte essentiële oliën tegen paddestoeltyrosinase

Zoals eerder beschreven, vertonen de EO's van C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba en V.officinalis hoge niveaus van citral, dat wordt gekenmerkt door niet-competitieve remmende activiteit tegen een schimmelbron van tyrosinase [8,16,21] . Deze studie was gericht op het onderzoeken van de in vitrotyrosinaseremmende activiteiten van deze EO's om te onderzoeken of hun remmende activiteit alleen kan worden toegeschreven aan hun citral-gehalte, of dat er andere bioactieve verbindingen zijn die de remmende effecten van de EO's beïnvloeden.

Paddestoeltyrosinasewerd hier aangenomen vanwege zijn hoge homologie met humantyrosinase, zijn relatief lage kosten en gemakkelijke beschikbaarheid, waardoor het een goed modelsysteem is voor de voorlopige screening van tyrosinaseremmers [17]. De precisie van de in vitrotyrosinaseDe remmingstest werd geëvalueerd in termen van herhaalbaarheid (door de enzymatische remmingstest vijf keer op dezelfde dag uit te voeren) en gemiddelde precisie (door de enzymatische remmingstest vijf keer per vier weken te herhalen gedurende een periode van zes maanden). Tabel 4 vermeldt de variatiecoëfficiënt (CV) voor remmingstests uitgevoerd met kojiczuur, dat als positieve controle werd gebruikt, en met L. cubeba EO. De resultaten waren bevredigend, aangezien de CV nooit hoger was dan 7 procent voor herhaalbaarheid en 10 procent voor middelmatige precisie. Tabel 4 vermeldt de variatiecoëfficiënt voor remmingstests uitgevoerd met kojiczuur, gebruikt als positieve controle, en met L. cubeba EO. Vergelijkbare precisiewaarden werden verkregen voor alle geteste EO's.

Citral-concentratie-responscurve werd bestudeerd door de waargenomen remmende activiteit uit te zetten als een functie van de concentratie ervan in het reactiemengsel. Alle EO's werden getest bij een concentratie van 166,7 µg/ml, wat, ongeacht de EO, een resulterende citralconcentratie opleverde binnen het lineariteitsbereik van de concentratie-responscurve (y=0.3956x plus 1.8094,R{{7} },9951, regressiefout: 2,08448, lineariteitsbereik: 6,7–166,7 µg/ml) en veroorzaakte geen oplosbaarheidsproblemen in het reactiemengsel.

De boxplot in figuur 2 geeft het percentage vantyrosinaseremming voor elke EO. Voor EO's van L. cubeba, V. officinalis en C. schoenanthus komen de in figuur 2 gerapporteerde resultaten overeen met de paddestoeltyrosinaseremmende activiteit van de EO's van 2020 omdat de variantieanalyse geen statistisch significante verschillen tussen EO's van verschillende jaar productie (p > 0,05). Met betrekking tot de EO's van L. cubeba en C. schoenanthus komen deze resultaten goed overeen met de resultaten die zijn verkregen uit de kwantitatieve GCMS-analyses die een bijna identieke hoeveelheid citral in de EO's van verschillende productiejaren aan het licht brachten. De batch 2020 van V. officinalis EO bevat een iets hogere citral-hoeveelheid dan de batches 2019 en 2018. Volgens de citral-concentratie-responscurve is de citral-overmaat in batch 2020 echter niet voldoende om een ​​statistisch significant hoger percentage enzymatische remming te bepalen, gezien de willekeurige fout in verband met de metingen. Zie figuur S1 in het aanvullende materiaal voor meer informatie. Aan de andere kant onthulde de variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey-Kramer post-hoctest dat de drie geteste M. officinalis EO's, geleverd door verschillende fabrikanten, paddenstoelen remdentyrosinasein verschillende mate, die in de volgende paragrafen verder zullen worden beschreven. De grootste remmende activiteiten werden waargenomen voor de EO's van L.cubeba, M. officinalis 1 en V. officinalis, die 59 ± 6 procent, 55 ± 7 procent en 52 ± 6 procent remden.tyrosinaseactiviteit, wanneer getest bij een concentratie van 166,7 µg/ml. Statistisch significante (p < 0.05)="" lagere="" activiteiten="" werden="" waargenomen="" voor="" de="" eo's="" van="" c.="" schoenanthus="" en="" m.officinalis="" 2="" en="" 3="" waarvan="" de="" enzymremmende="" activiteit="" 42="" ±="" 5="" procent,="" 40="" ±="" 5="" procent="" en="" 38="" ±="" 6="" was="" procent,="" respectievelijk.="" tabel="" 5="" geeft="" de="" remmerconcentratie="" die="" de="" enzymactiviteit="" halveerde="" in="" de="" gegeven="" experimentele="" omstandigheden="" (ic50)="" voor="" elke="" onderzochte="" remmer="" (dwz="" eo's,="" enkelvoudige="" verbindingen="" en="" kojiczuur).="" alle="" eo's="" remden="" effectief="" paddenstoelentyrosinase="" en="" vertoonden="" een="" remmende="" activiteit="" die="" gemiddeld="" 100-="" keer="" lager="" was="" dan="" die="" van="" kojicacid,="" dat="" als="" positieve="" controle="" werd="">

2.3. Identificatie van aanvullende bioactieve componenten, naast Citral, door middel van bioassay-geleide fractionering. alleen actieve verbindingen in de onderzochte EO's. Deze waarden werden gemeten via interpolatie van de citral-concentratie-responscurve. Zoals kan worden opgemerkt, vertoonden C. schoenanthus, M. officinalis 2 en M. officinalis 3 remmende activiteiten die in overeenstemming waren met hun citralgehalte, terwijl L. cubeba, M. officinalis 1 en V. officinalis EO's paddestoelen remden tyrosinase in grotere mate dan verwacht. Er werd een biogeleide benadering gevolgd om de aanvullende verbindingen te identificeren die bijdragen aan de activiteit van citral. De zuurstof- en koolwaterstoffracties van de L. cubeba, M. officinalis 1 en V. officinalis EO's werden geïsoleerd door flashchromatografie en afzonderlijk getest op hun paddenstoeltyrosinaseremmende activiteiten. De fytohemische fracties werden getest op hun remmende werking op paddestoeltyrosinase. De fytohemische fracties van de fracties werden getest in dezelfde concentratie als hun resulterende concentratie bij het testen van 166,7 µg/ml van de respectieve EO (zie de sectie Materialen en methoden in paragraaf 3.2). Tabel 6 vermeldt de concentratie van neral, geranial, citronellal, limoneen, en -myrceen in de geoxygeneerde en koolwaterstoffracties van de gefractioneerde EO's.

Wat betreft de EO's van L. cubeba en V. officinalis, remden zowel de geoxygeneerde als de koolwaterstoffracties paddestoeltyrosinase, zij het in verschillende mate. De activiteiten van de zuurstofrijke fracties (respectievelijk 53 ± 3 procent en 44 ± 5) zijn verantwoordelijk voor de meeste EO-anti-tyrosinasepotentieel en waren in lijn met het respectieve citralgehalte, wat suggereert dat de verbindingen die bijdragen aan de citral-activiteit tot de koolwaterstoffracties behoren. De koolwaterstoffracties van de L. cubeba en V. officinalis EO's vertonen vrij vergelijkbare chemische samenstellingen. Limoneen (respectievelijk 68,4 en 50,3 procent), trans- -caryofylleen (respectievelijk 12,0 en 7,8 procent), -pineen (respectievelijk 1,7 en 7,5 procent), -pineen (respectievelijk 2,5 en 12,9 procent), sabineen (respectievelijk 2,7 en 3,8) en -myrceen (respectievelijk 2,0 en 2,4 procent) zijn de meest voorkomende verbindingen in beide fracties en zijn in vrij vergelijkbare hoeveelheden aanwezig, met uitzondering van -pineen en -pineen, die de overhand hebben in de V. officinalis EO koolwaterstoffractie.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 procent in beide EO's), limoneen (respectievelijk 97 en 94 procent in L. cubeba en V. officinalis EO) en sabineen (87 procent in beide EO's), terwijl verschillende enantiomere excessen werden waargenomen voor -pineen ((-)- enantiomeer: ​​38 procent in L. cubebaEO en 73 procent in V. officinalis EO) en -pineen ((-)-enantiomeer: ​​67 procent in L. cubeba EO en 88 procent in V. officinalis EO). In beide EO's is (-)-limoneen goed voor meer dan 50 procent van de gehele fractie. Hoewel eerdere studies echter een remmende activiteit tegen paddestoeltyrosinase hebben gerapporteerd vanwege zijn hoge abundantie [22,23], vertoonde (-)-limoneen hier geen tyrosinase-remmende activiteit. Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor (plus)-limoneen, het racemische mengsel, en de verbindingen (-)-trans- -caryofylleen, (±)- -pineen en (±)- -pineen . Sabinene is niet getest omdat al bewezen was dat het een verwaarloosbare paddestoel bevattyrosinaseremmende effecten [8]. In overeenstemming met eerdere bevindingen [8] verminderde myrceen de tyrosinase-activiteit van paddenstoelen. Bij testen bij de concentratie waargenomen in 166,7 µg/ml L. cubeba en V. officinalis EO's, overbrugde -myrceenactiviteit de kloof tussen de verwachte remmende effecten van de EO's als citral de enige actieve verbinding was en de experimentele resultaten. In tegenstelling tot de waarnemingen van Matsuura et al. [8], -myrcene bleek een krachtigere paddenstoeltyrosinaseremmer te zijn dan citral, aangezien de IC50 bijna tien keer lager was (13,3 µg/ml vs. 121,8 µg/ml). Dit verschil kan worden toegeschreven aan de verschillende gebruikte substraten; Matsura et al. onderzochten alleen de tyrosinase difenolase-activiteit van paddenstoelen, omdat ze L-DOPA als substraat gebruikten, terwijl in deze studie L-tyrosine werd gebruikt. De huidige bevindingen suggereren dat -myrceen effectiever kan zijn bij het remmen van de activiteit van paddestoeltyrosinase-monofenolase dan de difenolase-activiteit.

De M. officinalis EO 1 vertoont een kleine koolwaterstoffractie die minder dan 3 procent van het totaal uitmaakt, en heeft geen tyrosinaseremmende activiteit. De geoxygeneerde fractie van M. officinalisEO 1 remde echter paddestoeltyrosinase in grotere mate dan zou worden verwacht op basis van het citral-gehalte (Figuur 3). Deze fractie bevat significante hoeveelheden citronellal naast neral en geranial en de chirale analyse onthulde een hoge enantiomere zuiverheid van citronellal in het voordeel van de (plus) enantiomeer (98,3 procent). Bij onafhankelijke tests, bij een concentratie van 166,7 µg/ml, remde (plus)-citronellal paddestoeltyrosinase in een verwaarloosbare mate, hoewel de activiteit ervan significant werd verhoogd wanneer getest in combinatie met citral. Deze resultaten kunnen de waargenomen verschillen in de percentages paddenstoelen verklarentyrosinaseremming in de verschillende M. officinalis EO's. M.officinalis EO 2 en 3 hebben een zeer laag gehalte aan citronellen, wat de reden kan zijn waarom hun remmende werking significant lager is dan die van M. officinalis EO 1.

3. Materialen en methoden

3.1. Reagentia

Dimethylsulfoxide (DMSO), paddestoeltyrosinase van Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tyrosine, kojiczuur, citral, citronellal, -myrceen, (plus)-limoneen, (-)-limoneen,(±)-limoneen, ( ±)- en pineen werden gekocht bij Merck Life Science Srl (Milaan, Italië). Litsea cubeba, Verbena officinalis en Cymbopogon schoenanthus EO's werden geleverd door Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Italië). Voor elk werden drie batches van verschillende jaren (dwz 2020,2019, 2018) getest. Drie monsters van Melissa officinalis EO's werden onderzocht; één werd geleverd door Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), één door ErboristeriaMagentina Srl, terwijl de laatste werd gekocht bij een plaatselijke winkel en van SpecchiasolS.rl (Bussolengo, Italië). In de tekst verwijzen de auteurs naar de verschillende EO's van Melissaofficinalis als respectievelijk M. officinalis EO's 1, 2 en 3. De verstrekte EO's werden verkregen volgens de procedures beschreven in de Europese Farmacopee [24]. Melissa officinalis en Verbena officinalis EO's werden geproduceerd door hydrodestillatie uit respectievelijk de bladeren en plantendelen; op dezelfde manier werden Litsea cubeba en Cymbopogon schoenanthus EO's verkregen door stoomdestillatie van respectievelijk het verse fruit en de verse bovengrondse delen. Elke EO werd afzonderlijk geanalyseerd door GC-MS zodra het werd gekocht/geleverd door de overeenkomstige fabrikant, elk opslagjaar en net voor de studie van de remmende activiteit van paddestoeltyrosinase.

3.2. In vitro tyrosinase-remmende test

Detyrosinaseremmende activiteiten van de EO's en geïsoleerde verbindingen werden in vitro onderzocht met behulp van een op colorimetrische uitlezing gebaseerde enzymtest geoptimaliseerd door Zengh et al. [25], met kleine aanpassingen. De tyrosinaseremmende activiteiten van EO's, evenals hun respectievelijke koolwaterstof- en zuurstoffracties en zuivere verbindingen werden in vitro onderzocht met behulp van een op colorimetrische uitlezing gebaseerde enzymtest die werd geoptimaliseerd door Zengh et al. [25], met kleine aanpassingen: de test werd uitgevoerd bij kamertemperatuur entyrosinaseremming werd gemeten rekening houdend met controle en monsterabsorptie na 6 minuten incubatie, in plaats van na 20 minuten, om te werken onder het lineaire gedeelte van de enzymatische reactie, wat nauwkeurigere remmingsresultaten oplevert [26,27]. Voor dit onderzoek werd paddenstoelentyrosinase van Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach geselecteerd. L-Tyrosine werd als substraat gebruikt, wat betekent dat de algehele tyrosinaseremmende activiteit werd onderzocht zonder onderscheid te maken tussen tyrosinasemonofenolase- en difenolase-activiteit. Fotometrische metingen bij 475 nm werden uitgevoerd op een Thermo spectronic Genesys6 en kojiczuur werd gebruikt als de positieve controleremmer. De oplossingen van de onderzochte potentiële remmers (EO's, geïsoleerde EO-fracties, individuele EO-verbindingen en kojicacid) werden bereid in DMSO. Tabel 7 vermeldt de geteste concentraties voor elke onderzochte potentiële remmer. De champignontyrosinaseoplossing 200 U/ml (27,9 µg/ml) werd bereid in natriumfosfaatbuffer (pH 6,8) en porties van 9 ml werden bewaard bij -18 ◦C en vlak voor de experimenten ontdooid. Tyrosine-oplossing 0,1 mg/ml werd bereid in natriumfosfaatbuffer (pH 6,8) en dagelijks vernieuwd. De componenten van het reactiemengsel werden in de volgende volgorde in het flesje gedaan: 1 ml paddenstoelentyrosinasenoplossing 200 U/ml; 1 ml natriumfosfaatbufferoplossing; 10 µL EO/single compound/kojinezuuroplossing; en ten slotte 1 ml tyrosine-oplossing van 0,1 mg/ml. Het uiteindelijke DMSO-percentage in het reactiemengsel was 0,3 procent. De test werd uitgevoerd in een afgesloten flesje van 4 ml om het verlies van EO-componenten in de omgeving te voorkomen en om hun afgifte in de kopruimte boven het reactiemengsel te minimaliseren. Het reactiemengsel werd gedurende 6 minuten bij 25°C in een thermostatisch waterbad geïncubeerd. Vervolgens werd de absorptie bij 475 nm geregistreerd, omdat deze golflengte de identificatie van dopamine mogelijk maakt. De absorptie die overeenkomt met 100 procent van de tyrosinase-activiteit werd gemeten door de EO's/individuele verbinding/kojinezuuroplossing te vervangen door 10 µL zuivere DMSO. Er werden lege oplossingen als volgt bereid: 2 ml natriumfosfaatbufferoplossing, 10 µL EO/individuele verbinding /kojic acid/DMSO-oplossing en 1 ml tyrosine-oplossing 0,1 mg/mL. Het percentage tyrosinaseremming werd gemeten volgens de onderstaande vergelijking: procent remming=∆A (controle) − ∆A (monster) / ∆A (controle) × 100,∆A (controle) of (monster) {{ 33}} A475 (controle) of (voorbeeld) − A475 (controle blanco) of (voorbeeld blanco).

3.3. Flash-kolomchromatografie

EO-fractionering werd uitgevoerd op een flash-kolomchromatografiesysteem PuriFlash450 door Sepachrom (Rho, Milaan, Italië), uitgerust met zowel UV- als ELSD-detectoren. De hoeveelheid gefractioneerd EO: 900,0 mg. Stationaire fase: sferische silicageldeeltjes, 50 µm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) was van Sepachrom; mobiele fase: petroleumether (A) en ethylacetaat (B); stroomsnelheid 25 ml/min. Lineaire gradiëntelutie werd geadopteerd van 100 procent van A tot 80 procent van A en 20 procent van B gedurende 20 minuten.

3.4. Analysevoorwaarden

De EOs-oplossingen en die van hun respectievelijke fracties werden bereid in cyclohexaan met een concentratie van 5.0 mg/ml en geanalyseerd met GC-MS. Citral, citronellal, -myrceen en limoneen werden gekwantificeerd in elke EO en de overeenkomstige geïsoleerde fracties met behulp van de externe standaardkalibratiemethode. Geschikte ijkniveaus werden bereid incyclohexaan en geanalyseerd met GC-MS. Tridecaan (C13) 1.0 mg/mL werd gebruikt als de interne standaard om de analytsignalen te normaliseren. Tabel 2 vat het beschouwde concentratiebereik voor elke gekwantificeerde verbinding samen.

GC-MS-analyses werden uitgevoerd met behulp van een Gerstel MPS-2 multifunctionele sampler (Mülheim an der Ruhr, Duitsland) geïnstalleerd op een Agilent 6890 N GC gekoppeld aan een 5975 MSD en uitgerust met een ChemStation versie E. 02.02.1431 gegevensverwerkingssysteem (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, VS). GC-condities: injectortemperatuur: 250 ◦C; injectiemodus: splitsen; verhouding: 1/20; draaggas: helium; constante stroomsnelheid: 1 ml/min; kolommen: Mega5 (95 procent polydimethylsiloxaan, 5 procent fenyl) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, lengte 25 m, van MEGA (Legnano, Italië). Temperatuurprogramma: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C (5 min). MSD-omstandigheden: MS bediend in EI-modus (70 eV); scanbereik: 35 tot 350 amu; verblijftijd 40 ms; ionenbron temperatuur: 230 ◦C; quadrupool temperatuur: 150 ◦C; temperatuur transferlijn: 280 ◦C. EO-markers werden geïdentificeerd door zowel hun lineaire retentie-indices (IT's), berekend met een C9-C25-koolwaterstofmengsel, als hun massaspectra te vergelijken met die van authentieke monsters of van commercieel beschikbare massaspectrale bibliotheken (Adams, 2007). EO-chirale analyses werden uitgevoerd door dezelfde analyse-omstandigheden toe te passen op een 2,3-di-O-methyl-6-Ot-butyldimethylsilyl- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, lengte 25 m vanaf MEGA. Temperatuurprogramma's: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

Op hetzelfde instrument werden GC-FID-analyses uitgevoerd. GC-condities: injectortemperatuur: 250 ◦C; injectiemodus: splitsen; verhouding: 1/20; draaggas: waterstof; stroomsnelheid: 1 ml/min. Temperatuurprogramma's: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

4. Conclusies

Het doel van dit onderzoek was (1) om de in vitro paddestoel uitgebreid te onderzoekentyrosinaseremmende activiteiten van de Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis en Verbena officinalis EO's en (2) om te bepalen of hun biologische activiteit alleen wordt toegeschreven aan hun citral-gehalte of dat er aanvullende bioactieve monoterpenen zijn die bijdragen aan de onderzochte biologische activiteit door gebruik te maken van een bioassay-geleide fractioneringsbenadering. Deze studie heeft aangetoond dat in L. cubeba en V. officinalis EO's, het -myrceen ondanks de geringe hoeveelheid bijdraagt ​​aan de EO's remmende activiteiten, en er is aangetoond dat het een grotere remmende werking op citral heeft. De tweede belangrijke bevinding was dat (plus)-citronellal versterkte citral-paddenstoeltyrosinaseremmende kracht, mogelijk via synergetische interactie omdat het op zichzelf geen activiteit vertoonde. De laatste bevinding verklaarde waarom in M. officinalis EO's die verwaarloosbare (plus)-citronellale hoeveelheden bevatten, de remmende activiteiten in overeenstemming waren met hun citralgehalte, terwijl het tegendeel waar was voor de M. officinalis EO met relatief hoge (plus)-citronellale overvloed. hoewel er nog steeds verdere studies nodig zijn om het type interacties dat optreedt tussen -myrceen en citral en tussen citronellal en citral nauwkeurig te definiëren, en om de remmende activiteiten van deze EO's en individuele verbindingen op de mens te beoordelentyrosinase, kunnen de resultaten van deze studie helpen bij het rationeel ontwerpen van mengsels van EO's of verrijkte EO's die hun biologische werkzaamheid verbeteren en hun potentieel als adjuvantia bij de behandeling van hyperpigmentatie vergroten.

Referenties

1. Pillaiyar, T.; Manickam, M.; Namasivayam, V. Huidbleekmiddelen: medicinaal chemisch perspectief van tyrosinaseremmers.J. Enzym. inhiberen. Med. Chem. 2017, 32, 403-425. [Kruisref]

2. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogiers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Overzicht van huidbleekmiddelen met inzicht in de illegale cosmeticamarkt in Europa. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943-950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Karakterisering van vermoedelijk illegale cosmetica voor het bleken van de huid. J. Farm. biomed. Anaal. 2014, 90, 85-91. [CrossRef] [PubMed]

4. Kubo, I.; Ikuyo, KH Flavonolen van saffraanbloem: Tyrosinase remmende activiteit en remmingsmechanisme. J. Agric. Food Chem.1999, 47, 4121-4125. [Kruisref]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Chemische samenstelling en tyrosinase-remmende activiteit van essentiële olie van Cinnamomum cassia. Bot. Stud. 2013, 54, 2-8. [Kruisref]

6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; Garcia-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. Actie van tyrosinase op ortho-gesubstitueerde fenolen: mogelijke invloed op bruin worden en melanogenese. J. Agric. Voedsel Chem. 2012, 60, 6447-6453. [Kruisref]

7. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Tyrosinase-remmers van komijn. J. Agric. Voedsel Chem. 1998, 46, 5338-5341. [Kruisref]

8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Tyrosinase remmende activiteit van essentiële citrusoliën. J. Agric. Voedsel Chem. 2006,54, 2309-2313. [Kruisref]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. In vitro bio-activiteiten van essentiële oliën die worden gebruikt voor acnecontrole. Int. J. Aromater. 2006, 16, 43-49. [Kruisref]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Biologische eigenschappen van citral en zijn potentiële beschermende effecten tegen cytotoxiciteit veroorzaakt door aspirine in de IEC-6-cellen. biomed. apotheker. 2017, 87, 653-660. [Kruisref]

11. Lee, HJ; Jeong, HS; Kim, DJ; Nee, YH; Yuk, DY; Hong, JT Remmend effect van citral op NO-productie door onderdrukking van iNOS-expressie en NF-KB-activering in RAW264.7-cellen. Boog. apotheek Onderzoek 2008, 31, 342-349. [Kruisref]

12. Carvalho, PMM; Macedo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Barbosa, R. Effect van de Lippia alba (Mill.) NE Bruine etherische olie en de belangrijkste bestanddelen, citral en limoneen, op de tracheale gladde spier van ratten. Biotechnologie. Rep. 2018, 17, 31-34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Costa, RHSd; Monteiro, ÁB; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, R. Tocolytische activiteit van de essentiële olie van Lippia alba en de belangrijkste bestanddelen ervan, citral en limoneen, op de geïsoleerde baarmoeder van ratten. Chem. Biol. Interactie. 2019, 297, 155-159. [Kruisref]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, .; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal Cardoso, JH; Barbosa, R. Vasorelaxerend effect van de essentiële olie van Lippia alba en het belangrijkste bestanddeel ervan, citral, op de samentrekbaarheid van geïsoleerde rattenaorta. biomed. apotheker. 2018, 108, 792-798. [CrossRef] [PubMed]

15. Sousa, DG; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal Cardoso, JH; Barbosa, R. Essentiële olie van Lippia alba en het belangrijkste bestanddeel citral blokkeren de prikkelbaarheid van de heupzenuwen van ratten. braz. J. Med. Biol. Onderzoek 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Potentiële cosmetische toepassing van etherische olie gewonnen uit Litsea cubeba fruits uit China. J. Essent. Olie res. 2013, 25, 112-119. [Kruisref]

17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Hassan Khan, MT; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Een uitgebreide beoordeling van tyrosinaseremmers. J. Enzym. inhiberen. Med. Chem. 2019, 34, 279-309. [Kruisref]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Co-ster.; Rubiolo, P. Kwantitatieve analyse van etherische oliën: een complexe taak. Smaak Frag. J. 2008, 23, 382-391. [Kruisref]

19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Essentiële oliën en vluchtige stoffen: monstervoorbereiding en analyse. Een recensie.Smaak Fragr. J. 2010, 25, 282-290. [Kruisref]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. De evaluatie van de variabiliteit van morfologische en chemische eigenschappen van de geselecteerde genotypen van citroenmelisse (Melissa officinalis L.). Ind. Gewassen Prod. 2013, 49, 515-520. [Kruisref]

21. Kubo, ik.; Kinst-Hori, I. Tyrosinase-remmende activiteit van de olijfoliesmaakstoffen. J. Agric. Voedsel Chem. 1999, 47, 4574-4578. [CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D.; Arciuli, M.; Arena, parlementslid; Benvenuti, S.; Gallone, A. Chemische samenstelling en het anti-melanogene potentieel van verschillende essentiële oliën. Smaak Frag. J. 2016, 31, 255-261. [Kruisref]

23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Remmend effect van essentiële citroenolie op paddestoeltyrosinase-activiteit in vitro. Mod. VoedselSc. technologie. 2015, 31, 97-105. [Kruisref]

24. Raad van Europa. Europese Farmacopee, 10e druk; Raad van Europa: Straatsburg, Frankrijk, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; Bruin, HY; Chen, J.; Wang, M. Karakterisering van tyrosinaseremmers in de twijgen van Cudrania tricuspidata en hun studie naar structuur-activiteitsrelaties. Fitoterapia 2013, 84, 242-247. [CrossRef] [PubMed]

26. Williams, KP; Scott, JE Enzyme Assay Design voor screening met hoge doorvoer. Bij screening met hoge doorvoer. Methoden in moleculaire biologie (methoden en protocollen); Janzen, WP, Paul, B., red.; Humana Press: Clifton, NJ, VS, 2009; Jaargang 565, blz. 107-126.

27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC; Weidner, JR Basisprincipes van enzymatische testen voor HTS. In Assay Guidance Manual; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds.; Eli Lilly & Company en het NationalCenter for Advancing Translational Sciences: Bethesda, MD, VS, 2004