Samenstellingsanalyse en immunologische activiteiten van de oligosachariden geïsoleerd uit Cistanche Deserticola

Hoe het geheugen te verbeteren zonder medicijnen?

Neem voor meer informatie contact op metali.ma@wecistanche.com

Ying Bai1, Hai-yan Li1, Shi-xian Chen1 1College of Food Science And Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China

Abstract:Een oligosacharide (CDOS) werd verkregen uitCistanche deserticoladoor alkalische (pH{{0}}) extractie, ethanolprecipitatie en gefractioneerd in twee gezuiverde fracties (dwz CDOS-1 en CDOS-2) door Sephadex G-100 en Sephadex G-25 kolomfiltratiechromatografie. De monosacharidesamenstelling van de CDOS werd bepaald door middel van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). Het bleek dat CDOS-1 alleen uit sucrose bestond en dat CDOS-2 voornamelijk uit sucrose, rhamnose en mannitol bestond, met een molverhouding van 1:0,73:3,61. Immunologische tests gaven aan dat CDOS een significant effect had op de muismiltindex, waardoor de fagocytose-activiteit van macrofagen werd verhoogd en antilichaamproducerende celproliferatie werd gestimuleerd. Gehoopt wordt dat de CDOS zal worden ontwikkeld tot functionele voeding of medicijnen.

trefwoorden:Cistanche deserticola, oligosacharide, zuivering, samenstelling, immunologische activiteiten.

Klik om cistanche extract voordelen producten

1. Inleiding

Cistanche deserticolaYCMa.(FamilieOrobanchaceae) is een korte parasitaire plant afkomstig uit het noordwesten van China. De hele gedroogde plant (zonder bloemen) staat bekend als een tonic en heet "Rou Congo".In de oosterse geneeskunde wordt het geclassificeerd als zoet en zout van smaak, warm van aard en toegeschreven aan nier- en dikke darmkanalen, met de functie de nieren te stimuleren en de essentie aan te vullen, de darm te hydrateren en de darmen te ontspannen [1] - [3] Het moderne farmacologische onderzoek toonde aan dat het de DNA-synthese kan stimuleren en het proces van seniliteit kan vertragen, het antioxidatief [4] kan verhogen, hart- en vaatziekten kan voorkomen en behandelen [3]. -inflammatoire effecten [5], verbeteren het leervermogen en het geheugen door zenuwgroeifactoren te induceren.Sommige onderzoeken hebben aangetoond datC. deserticola extracten kunnen de fagocytische functie van intra-abdominale macrofaag bij muizen activeren [7]-[9] en de immuniteit van het lichaam versterken. Volgens eerdere studies bevat deze plant meerdere actieve bestanddelen, waaronder fenylethanoïde glycosiden, iridoïden, lignanen, sacchariden, alkaloïden, enz. [11] Als deC. deserticola fenylethanoïde glycosiden en polysaccharide worden erkend als de belangrijkste actieve componenten, talrijke studies hebben zich de afgelopen decennia gericht op hun structuren en biologische activiteiten [12]-[17]. Wat betreft de waardevolle oligosachariden inC. deserticola, de rapporten zijn vrij beperkt. Oligosachariden, een sacharide met een korte keten die homo- of heterosuikers bevat, staan ​​bekend om hun gunstige effecten op het menselijk leven en worden al heel lang op grote schaal gebruikt [18]. Functionele oligosachariden, die een fysiologische functie hebben zoals lage cariogeniciteit en bifidobacteriën groeifactor [19], verbeteren de gezondheid van mens en dier. Ze zijn gebruikt als voedselingrediënt. Onlangs zijn nieuwe functies van oligosachariden, die het vermogen hebben om het immuunsysteem bij mensen, dieren en vissen te moduleren, gerapporteerd [20]. In dit artikel rapporteren we het eerste deel van de resultaten van het onderzoeksprogramma, de fractionering van de totale oligosachariden verkregen uit het alkalische extract vanC. deserticoladoor een combinatie van ultrafiltratie en gelpermeatiechromatografie, en de samenstellingsanalyse ervan door middel van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). Daarnaast presenteren we ook de immunologische activiteiten van deC. deserticolaoligosachariden. Voor zover wij weten, zijn er weinig rapporten gepubliceerd over de immunostimulerende activiteitsstudies vanC. deserticola oligosachariden.

2. Experimenteel

2.1. Materialen

DeC. deserticola werd gekweekt en verzameld uit Alexa League (Binnen-Mongolië, China). Kunming-muizen (Grade II, zes weken oud) werden gekocht bij het Pharmacology Experimental Centre van de Universiteit van Binnen-Mongolië. Sephadex G-100, Sephadex G-25, trifluorazijnzuur (TFA), 1-fenyl-3-methyl-5- pyrazolon (PMP), D-glucose, D- galactose, D-fructose, D-xylose, D-mannose, D-galacturonzuur, D-glucuronzuur, sucrose, rhamnose, mannitol, fucose, rhamnose, werden gekocht bij Sigma (St. Louis, MO, VS). Medium RPMI -1640 werd gekocht bij Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, VS). Alle andere chemicaliën waren van analytische kwaliteit.

2.2. Extractie van oligosachariden

De gedroogde lichamen vanC. deserticola werden in kleinere stukjes gesneden en verder vermalen tot poeder door een molen werden 3 uur geëxtraheerd met watervrije ethanol (3 x 5000 ml) bij 70 graden onder atmosferische druk. Een refluxcondensor werd bevestigd om lipiden te verwijderen. Het overgebleven residu werd vervolgens 3 keer (telkens 2 uur) geëxtraheerd met alkali (pH=10) bij 60°C. Na centrifugatie (2000 g gedurende 15 min, bij 20 graden) werd het supernatant geconcentreerd tot een tiende van het volume in een roterende verdamper onder verminderde druk bij 50 graden en gefiltreerd. Vervolgens werd het filtraat onteiwit met behulp van het Sevag-reagens [21] en ontkleurd met actieve kool.

2.3. Isolatie en zuivering van oligosachariden

De gevriesdroogde ruwe oligosachariden werden opgelost in gedestilleerd water, gecentrifugeerd en vervolgens werd het supernatant gezuiverd door een Sephadex G-100-kolom (1 x 50 cm), geëquilibreerd met ultrapuur water. Na belading met het monster werd de kolom geëlueerd met ultrapuur water met een stroomsnelheid van 5 ml/min. Verschillende fracties werden verzameld met behulp van reageerbuizen. Het totale koolhydraatgehalte van elke buis werd gemeten bij 490 nm door de fenol-H₂DUS₄methode [22]. De met water geëlueerde oplossing werd gescheiden in twee fracties CDOS-1 en CDO's-2. Twee fracties werden respectievelijk verder gezuiverd op een Sephadex G-25 kolom (2,7 x 85 cm) met behulp van ultrapuur water (met een stroomsnelheid van 1 ml/min). Na het verzamelen van de gezuiverde fractie werd deze gevriesdroogd.

2.4. Analyse van monosacharide samenstelling

De monosacharidesamenstelling van de CDO's werd bereikt door HPLC-analyse. De CDO's (2 mg) werden eerst 16 uur onder een stikstofatmosfeer gehydrolyseerd met watervrije methanol die 2 M HC1 bevatte bij 8 0 graden en vervolgens 1 uur met 2 M TFA bij 120 graden. Nadat TFA was verwijderd door verdamping, werden de hydrolysaten vervolgens gederivatiseerd met PMP volgens de gerapporteerde methode [23] en geanalyseerd met HPLC. HPLC-scheiding werd uitgevoerd op het EF-2002 HPLC-systeem (KNAUER-bedrijf, Duitsland). De PMP-derivaten werden gechromatografeerd met behulp van Sugar-PAK-volume (6,5 x 300 mm, glazen waterbedrijf, Amerika) en de absorptie werd gemeten bij 245 nm. Het injectievolume was 20 µl en de mobiele fase, bestaande uit PBS (oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B), werd gebruikt voor isocratische elutie met een volumeverhouding van 82 procent (A) tot 18 procent (B). De totale HPLC-looptijd was 40 min en de stroomsnelheid was 0,5 ml/min.

2.5. Immunobiologisch Activiteiten

2.5.1. Fagocytische functie van monocyt-macrofaag

Zestig Kunming-muizen (Grade II, zes weken oud) werden gekocht bij het Pharmacology Experimental Centre van de Universiteit van Binnen-Mongolië en werden voor gebruik 1 week geacclimatiseerd. Alle muizen werden willekeurig verdeeld in vier groepen, bestaande uit een zoutoplossingcontrolegroep, een hoge CDO-doseringsgroep, een matige doseringsgroep en een lage CDO-doseringsgroep. De muizen werden gedurende 5 dagen eenmaal per dag intraperitoneaal geïnjecteerd met 0,5 ml oligosacharidenoplossing. De doseringsgroep met hoge, matige of lage CDO's ontving respectievelijk 10{{10}}, 50 of 25 mg/kg/LG CDO's; en 0,5 ml zoutoplossing werd in de controlegroep geïnjecteerd. Op de zevende dag werd volgens Hou [24] een experiment met koolstofdeeltjesopruiming uitgevoerd en werden de miltindex en de thymusindex gemeten. In het kort werd 0,05 ml/10 g/bw Oost-Indische inkt in elke muis geïnjecteerd via de vena caudalis, vervolgens werd 20 L bloed verkregen uit de vena orbitalis posterior 3 en 7 minuten na de injectie. De bloedmonsters werden in buisjes geplaatst met 2 ml 0,1 procent Na₂CO₃en OD-waarden werden gemeten bij 600 nm. De klaringsindex (K), fagocytische index ( ) en immuunorgaanindex werden als volgt berekend (1), t₂en t₁betekent respectievelijk 7 minuten en 3 minuten.

2.5.2. De antilichaam-producerende cel proliferatie

Groepen Kunming-muizen (vijf per groep) werden geïmmuniseerd door intraperitoneale injectie van 2 x 10⁷SRBC in 1.0 ml PBS toegevoegd met 50 ug testmateriaal (geen in de controle). Een week later, splenocyten (10⁶cellen per 2 ml per putje) van Kunming-muizen werden 72 uur gekweekt met of zonder testmateriaal in 10 procent RPMI 1640-medium onder 5 procent CO₂in de lucht, in drievoud voor elke cultuur. Het aantal PFC tegen SRBC per 10⁶splenocyten bepaald.

2.6. Statistisch analyse

De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde waarden ± SD. Het verschil tussen geteste groepen en controle werd geanalyseerd door Student's t-test. P < 0.05="" werd="" als="" significant="">

3. Resultaten en Discussie

3.1. Isolatie en zuivering van oligosachariden

CDO's werden geïsoleerd uit het alkalische extract van de gedroogde lichamen vanC. deserticola met een rendement van 3.07 procent. Twee fracties van CDOS-1 en CDOS-2 werden geïsoleerd uit gedistilleerd waterelutie door respectievelijk de Sephadex G-100-kolom (Fig.1). De gezuiverde fracties van CDOS-1 en CDOS-2 vertoonden een enkele piek op de Sephadex G-25-kolom, wat aangeeft dat er geen andere oligosachariden in het monster aanwezig waren. De resultaten van monosacharidesamenstellingen toonden aan dat CDOS-1 alleen bestond uit sucrose (Fig.2) en dat CDOS-2 voornamelijk bestond uit sucrose, rhamnose en mannitol (Fig.3), met een molverhouding van 1:0,73:3,61.

3.2. Immunobiologische activiteiten van CDO's

Veel in vivo en in vitro bewijs heeft aangetoond dat natuurlijke oligosachariden een immunomodulerende functie vertoonden door zowel cellulaire als humorale immuunresponsen te stimuleren [27], [28]. In dit artikel verhoogde 100 mg/kg/bw CDO's de muismiltindex, maar er waren geen significante verschillen in de thymusindex tussen de behandelde groepen en controlegroepen (Tabel 1). Macrofagen zijn een belangrijk onderdeel van de afweer van de gastheer tegen virale infectie door de intracellulaire replicatie van virussen te remmen en door met virus geïnfecteerde cellen te doden [29]. Wanneer geactiveerd, wordt een verscheidenheid aan zuurstof- of stikstoftussenproducten en cytokinen vrijgemaakt uit macrofagen en nemen ze deel aan verschillende belangrijke biologische functies, zoals ontstekingsremmende en antitumoractiviteiten [30]-[32]. Daarom is de fagocytische activiteit van macrofagen een belangrijke indicator van de immuunfuncties van het organisme. In deze studie verhoogden de matige en hoge doses CDO's de fagocytose-activiteit van macrofagen (tabel 1). Door CDO's geïnduceerde antilichaamproducerende celproliferatie werd bestudeerd door onderzoek van de toename in hemolytische PFC in de milten van Kunming-muizen die waren geïmmuniseerd met SRBC plus het testmonster. De resultaten gaven aan dat matige en hoge doses CDO's de proliferatie van antilichaamproducerende cellen significant verhogen (Tabel 2). Hoge doses CDO's veroorzaakten een zeer significante toename van het aantal PFC's (P <>

Referenties

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Herkenning van gemengd biologisch signaal op basis van wavelet-analyse. In: Y. Jiang, et al (eds).Proc. van UK-China Sports Engineering Workshop. Liverpool: Wereld Academische Unie. 2007, blz. 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao, et al. Effecten van zeldzame aardelementen op de groei vanCistanche deserticolacellen en de productie van fenylethanoïde glycosiden.JB io-technologie, 2003, 102 (2) : 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian, et al. Een nieuw natuurproduct vanCistanche deserticolaYCMA. Tijdschrift voor Chinese Farmaceutische Wetenschappen,1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Anti-oxidatieve werking van de glycosiden vanCistanchein het weefsel van muizen.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRANti-nociceptieve en ontstekingsremmende activiteit veroorzaakt doorCistanche deserticolabij knaagdieren.J Etnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, JG; Maan, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kim, SY; Oh, MSCistanches Herbaverbetert leren en geheugen door zenuwgroeifactor te induceren.Gedragshersenonderzoek. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Vergelijking tussenCistanche deserticolaYC Ma en C,tubulosa(Shenk) Wight over enkele farmacologische acties.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ, et al. Studie van het verbeteren van de seksuele potentie vanC. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL, et al. vergelijkingen tussenCistanche deserticolaYC Ma en C.tubulosa wegen op sommige farmacologische acties.J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Immunomodulerende effecten van polysacharide vanCistanche deserticolaYC Ma.J Zhejiang Univ, Med Sci.2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Vooruitgang in onderzoek naar chemische bestanddelen en medicinale activiteit van cistanche.Chinese bronnen van wilde planten, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Isolatie en identificatie van fenylethanoïde glycosiden uitCistanche deserticola.

Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Bepaling van fenylethanoïde glycosiden inCistanche deserticoladoor macrovesiculaire hars-spectrofotometrie.Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T, et al. Remming van stikstofmonoxide door fenylethanoïden in geactiveerde macrofagen.

Europees tijdschrift voor farmacologie, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan, et al. Structurele analyse van in water oplosbare polysacharide SPA geïsoleerd uit de stengel van de Cistanche Deserticola Ma.Chemisch tijdschrift van Chinese universiteiten, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Onderzoek naar de immuunfarmacologie en het absorptiekarakter van polysachariden vanCistanche deserticola. 2011, nr. S1,Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotectieve activiteit van fenylethanoïden vanCistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Handbook of Amylases and Related Enzymes (red. door The Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (red.) Proceedings van de 5^eConferentie over tandcariës en koppelingssuiker (in het Japans), National Institute of Health, Tokyo (1980)

[20] Kodo Otaka. Functionele oligosaccharide en zijn nieuwe aspect als immuunmodulatie.J. Biol. Macromol. 2006, 6

(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polysacchariden uit heetwaterextracten van geroosterde Coffea arabica-bonen: isolatie en karakterisering. Koolhydraat.Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetrische methode voor de bepaling van suikers en verwante stoffen.Anaal. Chemo. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analyse van de monosaccharidecomponenten in Angelica-polysacchariden door krachtige vloeistofchromatografie.anale wetenschap. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan, et al. Extractie en zuivering van een lectine uit rode nierboon en voorlopige immuunfunctiestudies van de lectine en vier Chinese kruidenpolysacchariden.Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010:1-9.

[25] Cunningham, AJ, en A. Szenberg. Verdere verbeteringen in de plaquetechniek voor het detecteren van afzonderlijke antilichaamvormende cellen.Immunologie.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura, et al. Immunobiologische activiteiten van een Porin-fractie geïsoleerd uit Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Infectie en immuniteit. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Immunomodulerende activiteit van CVT-E002: een gepatenteerd extract van Noord-Amerikaanse ginseng (Panax quinque folium).J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Structuren en structuur-activiteitsrelaties van drie mitogene en complement-fixerende pectische arabinogalactans van de Malinese anti-ulcusplantenCochlospermum tinctoriumA. Rijk enVernonia kotschyanaSch Bip. ex Walp.Biomacromoleculen. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim, en J.-K. Hwang, Immunomodulerende activiteit van Arabinogalactan en Fucoidan in vitro.Journal of Medicinal Food. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian, et al. Beoordeling en vergelijking van de immunoregulerende activiteit van vier in water oplosbare fracties van Angelica Sinensis in vitro op de peritoneale macrofagen in ICR-muizen.Internationale immunofarmacologie. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park, et al. Pro-inflammatoire cytokine-genexpressie en stikstofmonoxide-regulatie van waterig geëxtraheerde Astragali-radix in RAW 264.7-macrofaagcellen.Tijdschrift voor etnofarmacologie. 2005, 100(3): 289–294.

[32] KY Lee en YJ Jeon. Polysaccharide geïsoleerd uit Poria cocos sclerotium induceert NF-KB / Rel-activering en iNOS-expressie in muizenmacrofagen.Internationale immunofarmacologie. 2003, 3(10-11):1353–1362.