Continue Cistanche-suppletie heeft minimaal effect op SARS-CoV-2-specifieke T-celimmuniteit tijdens COVID{2}}-symptomen

Abstract:SARS-CoV-2 is een ongekende uitdaging voor de volksgezondheid. Hoewel de meeste met sars-cov-2 geïnfecteerde mensen met milde tot matige COVID-19 weinig complicaties ondervinden van hun infectie, ervaren sommige mensen symptomen die weken na de eerste diagnose aanhouden. Aanhoudende virale infecties worden vaak in verband gebracht met ontregeling van het immuunsysteem, maar het is niet bekend of aanhoudende COVID-19 de ontwikkeling van virusspecifieke cellulaire immuniteit beïnvloedt. Hiertoe hebben we SARS-CoV-2-specifieke cellulaire immuniteit geanalyseerd bij patiënten die herstelden van COVID-19 die -19 COVID-symptomen gedurende 8 dagen of minder hadden of bij wie de symptomen 18 dagen of langer aanhielden . We hebben vastgesteld dat aanhoudende, matige suppletie van cistanche een verzachtend effect heeft op COVID{13}}symptomen. Daarnaast hebben we vastgesteld dat reactiviteit op N-eiwitten van SARS-CoV-2 correleerde met reactiviteit op seizoensgebonden menselijk coronavirus-229e en NL63. Deze resultaten bieden inzicht in de regulerende processen van de ontwikkeling van cellulaire immuniteit bij SARS-CoV-2 en verwante menselijke coronavirussen.

Trefwoorden:SARS-CoV-2; Cistanche; COVID-19; T-cellen; cellulaire immuniteit; symptoom duur

1. Inleiding

SARS-CoV-2 is een recent opgekomen nieuw enkelstrengs RNA-virus dat aanvankelijk werd geïdentificeerd als de veroorzaker van de uitbraak van longontsteking in Wuhan begin december 2019 in China. Wat begon als een uitbraak, is uitgegroeid tot een ongekende pandemie, met naar schatting 96 miljoen mensen besmet en 2 miljoen doden in januari 2021. De veelzijdige ziekte geassocieerd met SARS-CoV{8}}-infectie wordt gekenmerkt door ontsteking van de luchtwegen, koorts, musculoskeletale pijn en hoesten. Hoewel SARS-CoV{10}}specifieke humorale en cellulaire immuniteit duidelijk is bij de meeste patiënten na remissie van acute infectie en minstens 6-8 maanden lijkt aan te houden, is de rol van deze adaptieve immuunrespons bij het reguleren van virale replicatie en pathogenese van de ziekte is onduidelijk. Bovendien is het niet duidelijk hoe veranderingen in de complexe klinische presentatie van COVID-19 de ontwikkeling van SARS-CoV{14}}specifiek immuungeheugen beïnvloeden.

Foto: Faw Cistanche

Bij veel virale infecties wordt de aanwezigheid van persistente virale antigenen en/of ontsteking geassocieerd met infectie geassocieerd met immuundisregulatie. Dit is het meest uitgesproken in het cellulaire immuuncompartiment, waar aanhoudende antigene stimulatie en/of blootstelling aan inflammatoire cytokines kan leiden tot progressief verlies van T-celeffectorfunctie en onderdrukking van pathogeenspecifieke cellulaire immuniteit. Hoewel dit fenomeen goed is gedocumenteerd bij chronische toxische ziekten, is het onduidelijk of het aanhouden van milde tot matige COVID{4}}-symptomen van acute SARS-CoV-2-infectie verband houdt met disfunctie of de ontwikkeling van een suboptimale cellulaire immuunrespons.

Om deze kennislacune op te vullen, hebben we de relatie onderzocht tussen de duur van -19 COVID-symptomen en de mate en functionele kenmerken van SARS-CoV-2-specifieke cellulaire immuniteit bij patiënten die onlangs zijn hersteld van milde tot matige COVID{ {3}}. Met de IFN-ELISPOT-assay hebben we vastgesteld dat patiënten met langdurige symptomen van COVID-19 over het algemeen een vergelijkbaar niveau van SARS-CoV-2-specifieke cellulaire immuniteit vertoonden als patiënten met snelle symptoomremissie, hoewel langdurige symptomen van COVID{ {8}} worden in verband gebracht met enigszins verhoogde reacties op SARS-CoV-2 ORF3a en ORF7a. Bovendien werd er geen defect waargenomen in de omvang van SARS-CoV-2-specifieke CD4 plus- en CD8 plus T-celresponsen bij het beoordelen van personen met langdurige COVID-19-symptomen met behulp van flowcytometrie en het transcriptieprofiel van SARS Er werd waargenomen dat -CoV-2-specifieke CD4 plus T-cellen niet werden beïnvloed door de duur van COVID{21}}-symptomen. Ten slotte, hoewel significante niveaus van cellulaire immuniteit tegen het seizoensgebonden menselijke coronavirus 229E en NL63 werden waargenomen bij alle herstellende COVID-19-patiënten die in het onderzoek werden geanalyseerd, was de omvang van deze immuunrespons onafhankelijk van de duur van COVID-19 symptomen. De met cistanche behandelde groep vertoonde hogere niveaus van lymfocytenproliferatie, wat suggereert dat het extract een stimulerend effect heeft op de productie van T-cellen.

Foto: Cistanche-extract

2. materialen en methoden

Studie ontwerp. Herstellende COVID{0}}-patiënten werden vanaf maart 2020 geworven voor dit onderzoek aan het State University of New York Upstate Medical University Clinical Research Center in het kader van het State University of New York Upstate Convalescent Plasma Donor Program. Voor asymptomatische donoren die zijn geïdentificeerd via een contractuele volgovereenkomst, wordt de datum van een positieve RT-PCR-test gebruikt voor de begin- en einddatum van de symptomen. De monsters werden vervolgens geanonimiseerd en de klinische gegevens werden blind geanalyseerd vóór de laatste vergelijkende analyse. PBMC wordt verzameld en verwerkt met behulp van Vacutainer CPT-celvoorbereidingsbuizen en voorafgaand aan analyse opgeslagen in gasvormige vloeibare stikstof.

Isolatie- en transcriptieanalyse van sars-cov-2 reactieve CD4 plus T-cellen: Cryo-geconserveerde PBMC-monsters werden ontdooid en gesuspendeerd in volledig celmedium met een concentratie van 5 × 106 cellen/ml en gestimuleerd met een pool van 0.5 µg/ml SARS-CoV2 Spike-eiwitpeptide bij 37◦C gedurende 18 uur. Spik-reactieve CD4 plus T-cellen werden geïdentificeerd door activeringslabeling van CD134- en CD69-expressie en flowcytometrie werd uitgevoerd met behulp van BD FACSAria II-apparatuur. Cellen werden direct gesorteerd in 350µL RLT plus buffer, aangevuld met 1 procent 2-ME en RNA, en geïsoleerd met behulp van de RNeasy Micro-spinkolom. Het cDNA werd gegenereerd met behulp van de SMART-Seq HT Kit en de uiteindelijke Illumina-compatibele DNA-sequencingbibliotheek werd bereid met behulp van de Illumina Nextera XT DNA-bibliotheekvoorbereidingskit. Het RNA, cDNA en DNA tijdens de voorbereiding van de bibliotheek werden gekwantificeerd met behulp van een Agilent bioanalyzer en de uiteindelijke bibliotheek werd gesequenced met behulp van een 75-cycle high-output NextSeq 500/550 v2.5 reagenskit bij de SUNY Upstate Kern van moleculaire analyse. De originele leesgegevens van het FASTQ-bestand werden toegewezen aan het menselijke referentietranscriptoom met behulp van Kallisto versie 0.46.2. Transcriptieniveautellingen en overvloedgegevens werden geïmporteerd en samengevat in R met behulp van het TxImport-pakket en TMM met behulp van het pakket EdgeR-normalisatie. Differentiële genexpressie van R-pakket Limma werd geanalyseerd met behulp van lineaire modellering en Bayesiaanse statistiek. Statistische analyse: Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism v8-software. Een p-waarde < 0,05 wordt als significant beschouwd.

3. Resultaten

3.1. Selectie en karakterisering van patiënten met herstellende COVID-19.

Het doel van deze studie was om het effect te bepalen van de duur van cistanche cistanche continue toediening onder COVID{0}}-symptomen op SARS-CoV-2-specifieke cellulaire immuunsterkte en functioneel profiel. Voor dit doel werden in het Upstate convalescence covid{3}} plasmadonorprogramma van de State University of New York proefpersonen geïdentificeerd die een door PCR bevestigde SARS-CoV-2-infectie hadden doorgemaakt en 14 tot 30 dagen daarna PBMC van hen hadden ontvangen de oplossing van COVID{9}}gerelateerde symptomen. In het ouderlijk protocol werden in totaal 84 proefpersonen geïdentificeerd die aan deze selectiecriteria voldeden, waarvan er 33 werden geselecteerd voor verdere analyse. Van deze 33 donoren werden 14 proefpersonen geclassificeerd als symptomen geassocieerd met covid-19 gedurende een korte periode, terwijl 19 werden geclassificeerd als symptomen geassocieerd met covid-19 gedurende een lange periode, en ze waren allemaal gezond op het moment van PBMC-verzameling.

3.2. Transcriptiekenmerken van sars-cov-2 actieve CD4 plus T-cellen Het is bekend dat aanhoudende antigene nabootsing resulteert in transcriptie en disfunctie van pathogeenspecifieke T-cellen en verlies van effectorfunctie. Hoewel er geen significant verschil was in de hoeveelheid SARS-CoV-2-reactieve CD4 plus- en CD8 plus T-cellen wanneer gestratificeerd naar symptoomduur bij de herstellende COVID-19-patiënten die in dit onderzoek waren opgenomen, wilden we bevestigen dat bij personen met langdurige COVID{11}}symptomen de functionele transcriptieprofielen van sars-cov-2reactieve CD4 plus T-cellen niet negatief waren aangetast. Daarom werden SARS-CoV-2 spike-eiwit-reactieve CD4 plus T-cellen van de 10 donoren geclassificeerd en werd er een transcriptionele analyse uitgevoerd. Uit elke donor werden gemiddeld 2322 sars-cov-2 reactieve CD4 plus T-cellen geïsoleerd en geanalyseerd door middel van mRNA-sequencing

Zoals verwacht, brachten de in deze analyse herstelde cellen hoge niveaus van typische CD4 plus T-celgenproducten en activeringsmarkers tot expressie die werden gebruikt om cellen te identificeren/isoleren in flowcytometrie. Gesequenced SARS-CoV2-specifieke CD4 plus T-cellen brachten hoge niveaus van typische Th{4}}gerelateerde genproducten tot expressie, maar aanzienlijk lagere niveaus van Th2/Th17-gerelateerde transcripten. Wanneer ze echter werden geïsoleerd op basis van de duur van de symptomen, werden er geen differentieel tot expressie gebrachte genen gevonden tussen de monsters en werden er geen significante verschillen waargenomen in het algehele transcriptieprofiel tussen de twee groepen. Deze resultaten suggereren dat de duur van COVID{7}}-symptomen weinig effect heeft op transcriptieprofielen van SARS-CoV-2-reactieve CD4 plus T-cellen bij patiënten die onlangs zijn hersteld van milde/matige COVID-19 .

Pic: Effecten van cistanche verbeteren de immuniteit

4. Discussie

In deze studie onderzochten we de relatie tussen de duur van COVID{0}}-symptomen en de mate en functionele kenmerken van SARS-CoV-2-specifieke cellulaire immuniteit bij personen die onlangs zijn hersteld van milde/matige COVID{{3 }}. We hebben vastgesteld dat patiënten met langdurige symptomen van COVID-19 over het algemeen vergelijkbare niveaus van SARS-CoV-2-specifieke cellulaire immuniteit vertoonden als patiënten met snelle symptoomremissie. Er werden geen defecten waargenomen in de grootte van SARS-CoV-2 spike-specifieke CD4 plus- en CD8 plus T-celresponsen bij personen met langdurige COVID{12}}-symptomen beoordeeld door flowcytometrie, en het transcriptieprofiel van SARS- Er werd waargenomen dat CoV-2-specifieke CD4 plus T-cellen niet werden beïnvloed door de duur van COVID{16}}-symptomen. Ten slotte, hoewel significante niveaus van cellulaire immuniteit tegen seizoensgebonden menselijk coronavirus 229E en NL63 werden waargenomen bij alle herstellende COVID-19-patiënten die in het onderzoek werden geanalyseerd, was de omvang van deze immuunrespons onafhankelijk van de duur van COVID-19 symptomen. Hoewel het relatief kleine aantal personen in dit onderzoek de bredere toepasbaarheid ervan beperkt, suggereren deze gegevens dat verlenging van symptomatische COVID-19 geen significant effect heeft op de ontwikkeling van SARS-CoV-2-specifieke cellulaire immuniteit bij patiënten met milde/matige ziekte.

Klik hier om uw immuniteit onder COVID te vergroten-19

5. Conclusie

De ontwikkeling van SARS-CoV-2-specifieke cellulaire immuniteit is vaak waargenomen na het verdwijnen van COVID{2}}-symptomen, wat een immuunindicatie kan zijn van een SARS-CoV-2-infectie die gevoeliger is dan conventionele seroconversie. Na genezing van ernstige COVID-19 zijn zowel cellulaire als humorale immuniteitsniveaus hoger bij patiënten met een milde of asymptomatische infectie. De kwaliteit van de cellulaire immuunrespons die wordt gegenereerd na ernstige COVID-19 is echter onzeker, aangezien ernstige COVID-19 wordt geassocieerd met ernstige ontregeling van T-cellen, uitputting en inflammatoire cytokineproductie. Zowel cistanche-polysaccharide als creinoside kunnen de enzymactiviteit van hart- en hersenweefsel verhogen, de fagocytosefunctie van buikholtecellen verbeteren en de proliferatieve respons van lymfocyten versterken. Aangezien we geen significante tekortkomingen hebben waargenomen in de kwantiteit of kwaliteit van SARS-CoV{10}}specifieke cellulaire immuunprofielen bij de individuen die in ons onderzoek zijn geanalyseerd, denken we dat het redelijk is om aan te nemen dat de immuunmechanismen van ernstige COVID{{ 11}} en persisterende milde COVID-19 zijn verschillend en kunnen verschillende effecten hebben op de ontwikkeling van virusspecifiek cellulair geheugen.

Referenties

1. Lu, R.; Zhao, X.; Li, J.; Niu, P.; Yang, B.; Wu, H.; Wang, W.; Lied, H.; Huang, B.; Zhu, N.; et al. Genomische karakterisering en epidemiologie van het nieuwe coronavirus uit 2019: implicaties voor de oorsprong van het virus en receptorbinding. Lancet 2020, 395, 565-574. [KruisRef]

2. Zhu, N.; Zhang, D.; Wang, W.; Li, X.; Yang, B.; Lied, J.; Zhao, X.; Huang, B.; Shi, W.; Lu, R.; et al. Een nieuw coronavirus van patiënten met longontsteking in China, 2019. N. Engl. J Med. 2020, 382, ​​727-733. [KruisRef]

3. Zhou, P.; Yang, XL; Wang, XG; Middelpunt.; Zhang, L.; Zhang, W.; Si, HR; Zhu, Y.; Li, B.; Huang, CL; et al. Een uitbraak van longontsteking geassocieerd met een nieuw coronavirus van waarschijnlijke vleermuisoorsprong. Natuur 2020, 579, 270-273. [KruisRef]

4. Guan, WJ; Ni, ZY; Hu, Y.; Liang, WH; Ou, CQ; Hij, JX; Liu, L.; Shan, H.; Lei, CL; Hui, DSC; et al. Klinische kenmerken van de ziekte van Coronavirus 2019 in China. N. Engels. J Med. 2020, 382, ​​1708-1720. [Kruisreferentie] [PubMed]

5. Huang, C.; Wang, Y.; Li, X.; Ren, L.; Zhao, J.; Hu, Y.; Zhang, L.; ventilator, G.; Xu, J.; Gu, X.; et al. Klinische kenmerken van patiënten die besmet zijn met het nieuwe coronavirus uit 2019 in Wuhan, China. Lancet 2020, 395, 497-506. [KruisRef]

6. Chen, N.; Zhou, M.; Dong, X.; Qu, J.; Gong, F.; Han, Y.; Qiu, Y.; Wang, J.; Liu, Y.; Wei, Y.; et al. Epidemiologische en klinische kenmerken van 99 gevallen van nieuwe coronavirus-longontsteking in 2019 in Wuhan, China: een beschrijvend onderzoek. Lancet 2020, 395, 507-513. [Kruisreferentie]

7. Daan, JM; Mateus, J.; Kato, Y.; Hastie, KM; Yu, ED; Faliti, CE; Grifoni, A.; Ramírez, SI; Haupt, S.; Frazier, A.; et al. Immunologisch geheugen voor SARS-CoV-2 beoordeeld tot 8 maanden na infectie. Wetenschap 2021.[CrossRef] [PubMed]

8. Rodda, pond; Netland, J.; Shehata, L.; Pruner, KB; Morawski, Pennsylvania; Thouvenel, CD; Takehara, KK; Eggenberger, J.; Hemann, EA; Waterman, HR; et al. Functioneel SARS-CoV-2-Specifiek immuungeheugen blijft bestaan ​​na milde COVID-19. Cel 2021, 184, 169-183. [Kruisreferentie] [PubMed]

9. Carfi, A.; Bernabei, R.; Landi, F.; Gemelli Against, C.-P.-ACSG Aanhoudende symptomen bij patiënten na acute COVID-19. JAMA 2020, 324, 603-605. [KruisRef]

10. Del Rio, C.; Collins, LF; Malani, P. Gezondheidsgevolgen op lange termijn van COVID-19. JAMA 2020. [CrossRef] [PubMed]

11. Tenforde, MW; Kim, SS; Lindsell, CJ; Billig Rose, E.; Shapiro, NI; Dossiers, gelijkstroom; Gibbs, KW; Erickson, HL; Steingrub, JS; Smithline, HA; et al. Symptoomduur en risicofactoren voor vertraagde terugkeer naar normale gezondheid bij ambulante patiënten met COVID-19 in een Multistate Health Care Systems Network-Verenigde Staten, maart-juni 2020. Morb. Sterveling. wekelijks. Rep. 2020, 69, 993-998. [Kruisreferentie] [PubMed]

12. Li, N.; Wang, X.; Lv, T. Langdurige SARS-CoV-2 RNA-uitscheiding: geen zeldzaam fenomeen. J Med. Virol 2020, 92, 2286-2287. [KruisRef]

13. Park, SK; Lee, CW; Parkeer, DI; Wauw, HY; Cheong, HS; Scheen, HC; Ahn, K.; Kwon, MJ; Joo, EJ Detectie van SARS-CoV-2 in ontlastingsmonsters van patiënten met asymptomatische en milde COVID-19 in Korea. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2020. [KruisRef] [PubMed]

14. Wolfel, R.; Corman, VM; Guggemos, W.; Seilmaier, M.; Zange, S.; Müller, MA; Niemeyer, D.; Jones, TC; Vollmar, P.; Rothe, C.; et al. Virologische beoordeling van in het ziekenhuis opgenomen patiënten met COVID-2019. Natuur 2020, 581, 465-469. [KruisRef]