Contactpersoon:jerry.he@wecistanche.com

Yuto Mitsuhata1, Takaya Abe2, Kazuyo Misaki3, Yuna Nakajima1, Keita Kiriya1,

Miwa Kawasaki4, Hiroshi Kiyonari2, Masatoshi Takeichi4*, Mika Toya1,4,5,6*&

Masamitsu Sato1,6,7

Cistanche kan de nierfunctie verbeteren

Epitheelcellen organiseren een geordende reeks niet-centrosomale microtubuli, waarvan de min-uiteinden worden gereguleerd door CAMSAP3. De rol van deze microtubuli in epitheliale functies is echter slecht begrepen. Hier laten we zien dat denierenvan muizen waarin Camsap3 gemuteerd is, ontwikkelen zichcystenbij de proximale gekronkelde tubuli (PCT's). PCT's waren ernstig verwijd in de mutantnierenen ze vertoonden ook verbeterde celproliferatie. In deze PCT's werden epitheelcellen vetgemest samen met verstoring van microtubuli-arrays en van bepaalde subcellulaire structuren zoals interdigiterende basale processen. Bovendien werden YAP en PIEZO1, die bekend staan ​​als mechanosensitieve regulatoren voor celvorming en -proliferatie, geactiveerd in deze mutante PCT-cellen. Deze waarnemingen suggereren dat CAMSAP3-gemedieerde microtubuli-netwerken belangrijk zijn voor het behouden van de juiste mechanische eigenschappen van PCT-cellen, en het verlies ervan veroorzaakt celvervorming en proliferatie via activering van mechanosensoren, wat resulteert in de dilatatie van PCT's.

Epitheelcellen zijn belangrijke componenten van verschillende organen. Ze vertonen een apicale-naar-basale polariteit die verband houdt met hun functies, zoals absorptie en secretie. In gedifferentieerde epitheelcellen zijn de meeste microtubuli niet-centrosomaal en zijn uitgelijnd langs de apicaal-naar-basale as1-3. CAMSAP3 is een lid van de calmoduline-gereguleerde spectrine-geassocieerd eiwit (CAMSAP)/Nezha/Patronin-eiwitfamilie en is belangrijk voor de organisatie van epitheliale microtubuli4-8. CAMSAP3 bindt en stabiliseert de minus-uiteinden van microtubuli4,6,9. In cellen van de dunne darm bij muizen is CAMSAP3 geconcentreerd in apicale corticale gebieden, waardoor de min-uiteinden van niet-centrosomale microtubuli aan deze plaatsen worden verankerd10,11, wat resulteert in de vorming van microtubuli-arrays gericht in de apicobasale richting met de plus-uiteinden basaal gericht . Deze karakteristieke microtubuli-organisatie gaat echter verloren bij muizen die een mutant gen dragen dat codeert voor een afgeknotte Camsap3 (Camsap3dc/dc-muizen), waarin het C-terminale microtubule-bindende domein is verwijderd. Intestinale epitheelcellen in deze muizen hebben verschillende cytologische defecten, waaronder verminderde celhoogte en verkeerd geplaatste organellen zoals de kern en Golgi10. Ondanks zulke grote verstoringen in de intracellulaire architectuur, behouden de epitheelcellen normaal ogende tweedimensionale vellen , en de gemuteerde darmen hadden geen duidelijke fysiologische defecten.

tubuli (PCT's), de lus van Henle, distale ingewikkelde tubuli en verzamelbuis. Deze nefron-substructuren bestaan ​​uit een enkele laag epitheel, die dient voor filtratie, reabsorptie en secretie.

A nier cysteis een veel voorkomende pathologische laesie van denieren. De cystische laesie is variabel; ofwel focale of meerdere cysten vormen zich aan één kant of bilateraal in de nieren, met een verschillende mate van symptomen13-15. Verschillende aangeboren cystennierziekten, waaronder polycysteusnierziekten (PKD), glomerulocystische nierziekte (GCKD) en medullaire cysticnierziekte (MCKD), waarvan bekend is dat ze meerdereniercysten in bilaterale nieren. Bij PKD zijn cysten uniform verdeeld over het hele orgaan, inclusief PCT's, terwijl GCKD en MCKD cysten ontwikkelen in respectievelijk de kapsels van Bowman en de verzamelbuizen (voornamelijk in de medulla-regio),16-19 .

Wat PKD betreft, zijn er twee hoofdoorzaken bekend: 1) mutaties in het gen Pkd1 of Pkd2 en 2) mutaties in genen die nodig zijn voor primaire ciliumbiogenese. Pkd1 en Pkd2 coderen respectievelijk voor polycystin1 en polycystin2, die niet-selectieve kationkanalen zijn die zich op verschillende cellulaire compartimenten bevinden, waaronder de primaire cilia21,22. Bij muizen die een mutante vorm van PKD1 of PKD2 dragen, lokaliseren polycystine-eiwitten niet naar cilia23. Genen die nodig zijn voor de biogenese van primaire trilharen omvatten If88 en Kif3a, die betrokken zijn bij intrafagellair transport24-26. Mutaties in deze genen resulteren ook inniercystische ziekten24–27 . Hoewel de relatie tussen deze twee causale routes gecompliceerd is23, is één route waarvan is aangetoond dat deze PKD induceert, de Hippo-signaleringseffector Yap28. In Pkd1-mutante muizen worden de transcriptie-co-activator YAP/TAZ en zijn effector c-Myc geactiveerd en bevorderen cystogenese28. Niettemin zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van polycysteusnierengrotendeels onbekend blijven.

In de huidige studie hebben we de rollen van CAMSAP3 innierstructuur en functie. Onze waarnemingen tonen aan dat apicaal gelokaliseerd CAMSAP3 bijdraagt ​​aan de juiste oriëntatie van niet-centrosomale microtubuli en aan de oprichting van de intracellulaire architectuur van epitheelcellen in PCT's, zoals waargenomen in de dunne darm. In tegenstelling tot het darmepitheel, echter, CAMSAP3disfunctieveroorzaakte afwijkingen op orgaanniveau in bilaterale nieren, dat wil zeggen cystevorming in PCT's. Verlies van CAMSAP3-functie resulteerde in activering van mechanosensitieve regulatoren die normaal gesproken helpen de weefselintegriteit te behouden. Onze studie suggereert dat CAMSAP3-gemedieerde niet-centrosomale microtubuli-organisatie belangrijk is voor het behoud van de mechanosensitieve eigenschappen van PCT's, en verlies van dit systeem veroorzaakt regionale cystevorming in de nier.

Resultaten

cystevorming innierenvan Camsap3 gemuteerde muizen. Fenotypische analyse van Camsap3dc/dc mutante muizen onthulde dat:nierenbij oudere (~ 2 jaar oud) Camsap3dc / dc-muizen waren hypertrofisch en verkleurd (figuur 1a). Om afwijkingen in Camsap3dc/dc . verder te analyserennieren, onderzochten we jongere muizen. Op postnatale dag 21 (P21) zagen de Camsap3dc/dc-nieren er normaal uit. Het doorsnijden van de nier onthulde echter cystische structuren in de corticale gebieden (Fig. 1b en Aanvullende Fig. S1a), zoals bevestigd door het berekenen van de cystische index, wat de verhouding is van de cyste-bevattende gebieden tot het totale niergebied (Fig. 1c). We onderzochten mutante embryo's om te bepalen wanneer zich tijdens de ontwikkeling cysten beginnen te vormen, wat een teken van verhoogde cystevorming onthulde op ongeveer embryonale dag 17.5 (E17.5) (aanvullende figuur S1a, pijlen). Op P 0 werden corticale cysten gemakkelijk waarneembaar (aanvullende figuur S1a, pijlen), en hun grootte en aantal waren toegenomen met P21 (figuur 1b, aanvullende figuur S1a, pijlen). Naarmate muizen ouder werden, werden cystische fenotypes duidelijker, hoewel de mate van cystevorming tussen de individuen varieerde (Fig. 1c en Aanvullende Fig. S1b). Bovendien was de nier-tot-lichaamsgewichtverhouding hoger voor Camsap3dc / dc-muizen dan wildtype (WT) muizen gedurende hun leven (Fig. 1d en Aanvullende Fig. S1c, d). Tus, Camsap3dc/dc-nieren vertoonden cystevorming, die in de loop van de tijd werd versterkt, wat resulteerde in hypertrofie van verouderde nieren.

Camsap3dc/dc-muizen brengen een C-terminaal domein-afgeknot CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10 tot expressie, dat betrokken zou kunnen zijn bij het waargenomen cystische fenotype van de muizennieren. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, hebben we een Camsap3–/– (Camsap 3-null) muis (aanvullend Fig. S2a,b) gegenereerd (zie ook Methoden in detail). Deze muizen hadden ooknierenmet meerdere cysten, en hun fenotype was niet te onderscheiden van dat waargenomen bij Camsap3dc/dc-muizen; met name vertoonden heterozygote (Camsap3 plus /-) muizen geen tekenen van polycysteuze nieren (aanvullende figuur S2c).

Cystevorming in PCT's van Camsap3dc/dcnieren. Om te bepalen welke structuren cystisch werden in de mutantnieren, we voerden immunokleuring uit van drie nefronsegmenten voor drie eiwitten, namelijk Megalin (lokaliseert naar PCT's), een Na plus / Cl-cotransporter (distale ingewikkelde tubuli) en aquaporine -2 (verzamelkanalen). De resultaten toonden aan dat dilatatie uitsluitend optrad bij Megalin-positieve tubuli op P21 (Fig. 1e en Aanvullende Fig. S1e), wat aangeeft dat cystogenese beperkt was tot PCT's. PCT's zijn onderverdeeld in drie segmenten, namelijk S1, S2 en S3, en we hebben ze onderscheiden door middel van immunokleuring voor de glucosetransporters SGLT1 en SGLT2, die respectievelijk lokaliseren op S3- en S1/S2-segmenten29,30 . De verwijde tubuli werden uitsluitend gemarkeerd door SGLT2 (Fig. 1f), wat aangeeft dat cystogenese optreedt bij de S1 / S2-segmenten. Bij oudere mutante muizen breidde de cystevorming zich echter ook uit tot het kapsel van Bowman (figuur 1g).

Gedesorganiseerde cellulaire architectuur in cystische PCT's. Om defecten op celniveau in cystische PCT's te onderzoeken, hebben we ze eerst onderzocht door middel van scanning-elektronenmicroscopie, waarbij we vonden dat een populatie vanniertubuli zwollen duidelijk op in Camsap3dc / dc-nieren (Fig. 2a), hoewel de mate van zwelling varieerde van positie tot positie van de tubulus. Dwarsdoorsneden onthulden dat, bij gezwollen delen van een tubulus, het lumen ervan werd vergroot samen met het dunner worden van de epitheellaag die de tubuli vormt (figuur 2a). Kwantificering met behulp van hematoxyline en met eosine gekleurde monsters bevestigde dat de celhoogte in de verwijde tubuli was verminderd (figuur 2b), terwijl de apicale omtrek van elke cel was vergroot (figuur 2c), wat aangeeft dat de mutante cellen dikker waren dan die in WTnieren.

We onderzochten vervolgens of celarchitectuur en / of subcellulaire structuren van PCT's werden beïnvloed door Camsap3-mutatie. Immunokleuring voor DPP IV, een apicale membraanmarker, en voor Na plus /K plus -ATPase, een basolaterale membraanmarker, gaf aan dat de algehele celpolariteit normaal was in elkeniertubuluscel van Camsap3dc/dc

Figuur 1. Cystevorming in proximale gekronkelde tubuli van Camsap3dc/dcnieren. (a) Morfologie van nieren van WT (plus / plus) en Camsap3-mutante (Camsap3dc/dc) muizen op P666. (b) H&E-kleuring van WT- en Camsap3dc/dc-nieren op P21. Meerdere cysten gevormd in de cortex van Camsap3dc/dc nieren. (c) Verandering van cystische index van WT- en Camsap3dc/dc-muizen in de loop van de tijd. 9 muizen werden onderzocht op WT of Camsap3dc/dc. Zie de MATERIALEN EN METHODEN voor de definitie van cystische index. (d) Verhouding van nier tot lichaamsgewicht. 11 muizen werden onderzocht op WT of Camsap3dc/dc. (e) Immunokleuring voor markers van proximale ingewikkelde tubuli (PCT) (Megalin), distale ingewikkelde tubuli (DCT), NaCl-cotransporter en verzamelbuizen (CD) (aquaporine-2; AQP2) in WT en Camsap3dc/ dcnierenop P21. Afbeeldingen van de vergrote weergave van Megalin tonen gedelokaliseerde Megalin in cystische cellen in Camsap3dc/dc-nieren, zoals aangegeven door de pijlpunt. Gebroken en ononderbroken lijnen geven respectievelijk de apicale en basale marge van de cel aan. (f) Immunokleuring voor markers van de S1/S2-segmenten (SGLT2, groen) en S3-segment (SGLT1, rood) in WT- en Camsap3dc/dc-nieren op P21. Afbeeldingen van de vergrote weergave van SGLT2 tonen verminderde SGLT2-signaalintensiteit in cystische cellen in Camsap3dc/dc-nieren, zoals aangegeven door pijlpunten. (g) Morfologie van de glomerulus op P21 en P487. Pijlpunten geven de verwijde glomerulus aan. Zie ook figuren S1 en S2.

Figuur 2. Ongeorganiseerde cellulaire architectuur in cystische PCT-cellen. (a) Scanning-elektronenmicroscopiebeelden ▸

Cistanche kan de nierfunctie verbeteren

van WT en Camsap3dc/dcnierenop P21. De niertubuli in Camsap3dc/dcnierengedeeltelijk gezwollen is. (b) Kwantificering van celhoogte in de cortex [plus / plus, n=121 cellen; dc/dc (verwijd), n=128 cellen; dc/dc (niet verwijd), n=66 cellen]. Foutbalken geven SD ***p . aan<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">nieren. (i) Aantal primaire trilhaartjes bij PCT's. Het aantal primaire trilhaartjes werd berekend met behulp van de apicale omtreklengte van dwarsdoorsneden van PCT, samen met het aantal primaire trilhaartjes en kernen. [ plus / plus , N=340 cellen, 63 dwarsdoorsneden van PCT, aantal primaire cilia=268; dc/dc, N=221 cellen, 29 dwarsdoorsneden van PCT, aantal primaire cilia=133].

muizen (Fig. 2d). Daarentegen, hoewel Megalin zich ophoopte in de apicale gebieden in WT-cellen, diffundeerde het in het cytoplasma in sommige van de cystische Camsap3dc / dc-cellen (Fig. 1e vergrote weergave en Fig. 2d). Fluorescentiekleuring voor F-actine, dat zich met hoge dichtheid ophoopt in apicale microvilli, suggereerde dat de microvilli af en toe ontwricht waren in de gemeste cellen van mutantenieren(Fig. 2e pijlpunt), zoals bevestigd door transmissie-elektronenmicroscopie (Fig. 2f). Ezrin, een onderdeel van het ERM-complex dat associeert met het apicale plasmamembraan31, was afgenomen of ging verloren in cystische cellen van Camsap3dc/dcnieren(Fig. 2e), wat suggereert dat cytoarchitectuur abnormaal was in mutante cellen. Bovendien, terwijl het Giantin-positieve Golgi-apparaat over het algemeen wordt verdeeld als dunne strengen naast de kern in WT-cellen, werd het Golgi af en toe gecondenseerd in Camsap3dc / dc-cellen (figuur 2e). Transmissie-elektronenmicroscopie onthulde aanvullende subcellulaire defecten in verwijde PCT's van Camsap3dc / dcnieren. In WT PCT-cellen waren mitochondriën langwerpig en vertoonden ze een geordende oriëntatie langs de apico-basale as van de cel, terwijl in cystische PCT-cellen mitochondriën de neiging hadden rond te zijn - en geen geordende oriëntatie meer vertoonden (figuur 2f). In deze cellen waren de basale strepen ook gedesorganiseerd, waarbij ze hun parallelle en diepe invaginaties verloren die gebruikelijk zijn in WT-cellen (Fig. 2f pijlpunten en getraceerde tekening), zoals ook getoond door immunokleuring voor Na plus / K plus -ATPase (Fig. 2d pijlpunten). Bovendien werden kernen vetgemest in de cystische cellen, vergeleken met hun ronde vorm in WT-cellen (Fig. 2f, g). Primaire cilia waren detecteerbaar aan de luminale zijde van PCT-cellen in zowel WT- als mutante nieren (Fig. 2h,i), in tegenstelling tot het geval voor mutante muizen die defect zijn voor ciliogenese, wat polycysteuze nieren veroorzaakt24-27, wat suggereert dat verslechtering van ciliogenese is niet de waarschijnlijke reden voor de

waargenomen polycysteuze fenotypes in Camsap3dc/dc-muizen. Gezamenlijk gaven deze observaties aan dat:disfunctievan CAMSAP3 verstoort de subcellulaire architectuur van PCT-cystische cellen.

Camsap3dc/dc-muizen vertonen enkele fysiologische defecten. Vervolgens hebben we onderzocht of de nieren van Camsap3dc/dc fysiologische defecten vertoonden. De bovengenoemde immunocytologische onderzoeken toonden aan dat Megalin, dat functioneert als een multiligand-endocytische receptor32,33, de neiging had zich te verspreiden in het cytoplasma van Camsap3dc/dc PCT-cellen (Fig. 1e pijlpunt en Fig. 2d), in tegenstelling tot zijn duidelijke apicale lokalisatie in WT PCT-cellen. Bovendien, hoewel de glucosetransporter SGLT2, die verantwoordelijk is voor 90 procent van de glucosereabsorptie29, voornamelijk gelokaliseerd in apicale regio's van Camsap3dc/dc-cellen (zoals ook te zien is in WT-cellen), nam de signaalintensiteit af in bepaalde regio's van cystische tubuli ( Fig. 1f pijlpunten), wat suggereert dat de fysiologie van de gemuteerde tubuli negatief zou kunnen zijn beïnvloed. Daarom hebben we urine- en bloedonderzoek gedaan met P396- op P424-oude muizen. Urinetests onthulden een neiging tot overmatige uitstroom van K plus, Mg2 plus en ureumstikstof in Camsap3dc / dc-muizen (aanvullende figuur S3a). Bloedonderzoek toonde overtuigender aan dat de Camsap3dc / dc-muizen significant lagere niveaus van K plus en Mg2 plus hadden in vergelijking met WT- of Camsap3 plus / dc-muizen, hoewel er geen verandering werd gedetecteerd in de niveaus van ureumstikstof en glucose (aanvullende figuur S3b) . Urine- en bloedcreatinineniveaus verschilden niet tussen WT en mutante muizen (aanvullende figuur S3c). Zo hebben we slechts gedeeltelijke fysiologische defecten waargenomen in Camsap3dc/dc-muizen.

Microtubuli-organisatie inniertubulus epitheelcellen. Omdat Camsap3-mutatie leidt tot desoriëntatie van microtubuli in epitheelcellen van de dunne darm10,12, hebben we onderzocht of dit ook voorkomt innierepitheelcellen. We hebben eerst -tubuline immunologisch gekleurd, samen met Megalin. Met name zowel in WT- als Camsap3dc / dc-nieren vertoonden Megalin-negatieve tubuli, dat wil zeggen ofwel distale ingewikkelde tubuli of verzamelkanalen, een sterkere -tubuline-immunokleuringsintensiteit dan waargenomen voor -tubuline in Megalin-positieve PCT's (Fig. 3a, b) . Zoals gevonden in de dunne darm10, was CAMSAP3 apicaal gelokaliseerd in alle epitheelcellen van WTnieren, overlapt het apicale uiteinde van microtubuli die zijn uitgelijnd langs de apico-basale as (Fig. 3c lef). Camsap3dc / dc nierepitheelcellen waren ook enigszins immunopositief voor CAMSAP3 maar op onregelmatige posities (Fig. 3c rechts, pijlpunten), wat suggereert dat gemuteerd CAMSAP3 in de cellen wordt vastgehouden, verankerd aan enkele niet-geïdentificeerde structuren. In cystische cellen van de mutante nieren was de reeks microtubuli verward en ongeorganiseerd (Fig. 3c rechts), zoals waargenomen in darmcellen van Camsap3dc / dc-muizen . In niet-cystische cellen werd de organisatie van de microtubuli echter niet beïnvloed

Figuur 3. Microtubuli in epitheelcellen van de niertubuli. (a) Immunokleuring voor -tubuline, Megalin en kernen in WT- en Camsap3dc / dc-nieren op P21. (b) Kwantificering van -tubuline-intensiteit in PCT en DCT/CD van WT-nieren (PCT, n=28 tubuli; DCT/CD, n=18 tubuli) en Camsap3dc/dc-nieren (PCT, n { {8}} tubuli; DCT/CD, n=9 tubuli). Foutbalken geven SD ***p . aan<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

veel zelfs in de afwezigheid van functioneel CAMSAP3, wat zou kunnen verklaren waarom deze cellen geen cytologische afwijkingen vertoonden. Bovendien vertoonden Camsap 3-null-nierepitheelcellen ook vergelijkbare microtubuli-defecten, maar alleen in cystische cellen (aanvullende figuur S2d). Gezamenlijk gaven deze resultaten aan dat CAMSAP3 een rol speelt bij het handhaven van de apico-basale organisatie van microtubuli, alleen voor een subpopulatie van nierepitheelcellen.

Verbeterde celproliferatie in Camsap3dc/dc PCT's. Cystevorming in de nieren hangt nauw samen met een verhoogde proliferatie van niercellen34. Om te testen of celproliferatie was veranderd in Camsap3dc/dc-nieren, vergeleken we de proliferatie van PCT-cellen tussen WT en gemuteerde nieren door co-immunokleuring voor Megalin en Ki-67, een marker voor celproliferatie. Ki-67-positieve cellen werden zelden waargenomen in PCT's van WT-nieren, terwijl ze gemakkelijk zichtbaar waren in PCT-cellen van Camsap3dc/dc-nieren. Ki-67 werd echter gedetecteerd in zowel niet-verwijde als verwijde tubuli (Fig. 4a, b), en vertoonde geen correlatie tussen celproliferatie en cystevorming. Tus, CAMSAP3disfunctiebevorderde wel de celproliferatie, maar dit proces ging niet altijd gepaard met cystevorming.

Veranderingen in de lokalisatie van YAP en niet-spiermyosine gekoppeld aan celvervorming. YAP is een transcriptionele activator die celproliferatie reguleert, evenals mechanische spanningsafhankelijke celvorming . YAP wordt geactiveerd samen met zijn nucleaire lokalisatie in de nieren van Pkd1-deficiënte muizen, een model van PKD37, en Yap-activering bevordert celproliferatie en tubulaire dilatatie in de nieren28. We hebben daarom getest of YAP ook werd geactiveerd in PCT's van Camsap3dc/dc-nieren. Immunokleuring voor YAP onthulde de cytoplasmatische lokalisatie ervan in PCT's van WT-nieren. Opmerkelijk genoeg werd YAP geconcentreerd in de kernen van Camsap3dc / dc PCT's, maar alleen in hun verwijde delen (Fig. 5a), zoals bevestigd door kwantificering (Fig. 5b), wat suggereert dat de waargenomen YAP-herverdeling plaatsvond als reactie op een verandering in cel morfologie in plaats van CAMSAP3disfunctieper se.

YAP is een stroomafwaartse efector van de Hippo-route, die wordt gereguleerd door mechanische signalen38. In feite leken cystische cellen in de Camsap3dc / dc-nier uitgerekt, wat suggereert dat ze mogelijk zijn blootgesteld aan verhoogde spanning.

Figuur 4. Celproliferatie in Camsap3dc/dc PCT's. (a) Immunokleuring voor Ki-67, Megalin en DAPI in WT- en Camsap3dc/dc-nieren op P22. Pijlpunten geven Ki-67-positieve cellen in cystische tubuli aan. (b) Percentage Ki-67-positieve cellen in PCT-epitheelcellen [plus/plus, n=700 cellen; dc/dc (verwijd), n=224 cellen; dc/dc (niet-verwijd), n=396 cellen]. Foutbalken geven SD *p . aan<0.05,>

We hebben daarom onderzocht of er mechanische veranderingen optraden in samenhang met cystevorming. Omdat niet-spier myosine II-activering een spanningsgevoelig proces is39, hebben we de distributie van myosine lichte keten 2 (MLC2), die betrokken is bij myosine II-activering, in de nieren beoordeeld. Hoewel MLC2 in het cytoplasma in WT-tubuluscellen diffundeerde, werd het geconcentreerd nabij de apicale delen van cystische cellen in Camsap3dc / dc-nieren (Fig. 5c pijlpunt), wat suggereert dat deze cellen werden onderworpen aan trekkracht. Cellen in niet-verwijde PCT's vertoonden een dergelijke MCL2-concentratie niet. Deze bevindingen waren in overeenstemming met het idee dat YAP de kern binnendringt wanneer cellen mechanisch worden uitgerekt40,41.

Veranderingen in PIEZO1-distributie in Camsap3dc/dc PCT's. Om verder te testen of cystische cellen worden blootgesteld aan rekkracht, onderzochten we de subcellulaire distributie van PIEZO1, een mechanisch gevoelig ionkanaal42-45, omdat dit een typische marker is voor mechanische rek; PIEZO1-lokalisatie verschuift van het plasmamembraan / cytoplasma naar de nucleaire envelop wanneer het reksignalen detecteert46. Immunokleuring voor PIEZO1 toonde aan dat PIEZO1 meestal gelokaliseerd was in het cytoplasma van WT PCT-cellen, terwijl de lokalisatie ervan overlapte met de kern in cystische cellen van Camsap3dc / dc PCT's (figuur 6a). Immunokleuring voor YAP en PIEZO1 in opeenvolgende secties suggereerde ook dat hun nucleaire lokalisatie samenviel bij verwijde PCT's (aanvullende figuur S4, pijlpunten). Aan de andere kant, in niet-verwijde Camsap3dc / dc PCT's, zag de PIEZO1-verdeling er cytoplasmatisch uit (figuur 6a). Nauwkeurige observaties van de immunofuorescentiebeelden en kwantificering gaven echter aan dat de nucleaire lokalisatie ervan tot op zekere hoogte de neiging had toe te nemen, vergeleken met WT-cellen (Fig. 6a, b). Het lijkt er dus op dat, in tegenstelling tot YAP, PIEZO1 begint te worden geactiveerd voorafgaand aan de detecteerbare vervorming van cellen in Camsap3dc/dc PCT's.

Discussie

In deze studie ontdekten we dat CAMSAP3-mutatie of het verlies ervan resulteerde in dilatatie van PCT-cellen, waardoor de dwarsdoorsneden van tubuli een cystisch uiterlijk kregen. Al in E17.5 werd een teken van cystogenese waargenomen, met een geleidelijke toename van de dilatatie tijdens het ouder worden en de uiteindelijke uitbreiding naar het kapsel van Bowman. Epitheelcellen in de verwijde gebieden werden dunner en vertoonden verschillende cytologische defecten, zoals waargenomen in cellen van de dunne darm van Camsap3dc/dc-muizen10,12. Er werden ook enkele nierspecifieke defecten waargenomen, waaronder de verstoring van de uitlijning van de mitochondriën en de basale plasmamembraanpatroonvorming. Deze veranderingen vielen samen met verstoring van de rangschikking van microtubuli, wat suggereert dat CAMSAP3-gemedieerde microtubuli-netwerken verantwoordelijk zijn voor de normale organisatie van deze subcellulaire structuren in PCT-cellen, zoals gevonden in andere celtypen. Aan de andere kant, hoewel CAMSAP3 tot expressie leek te komen in alle epitheelcellen van de niertubuli, werden afwijkende structurele fenotypes alleen waargenomen in PCT's, wat suggereert dat er een of meer redundante mechanismen zijn om microtubuli-netwerken te behouden in afwezigheid van CAMSAP3. Het is mogelijk dat andere moleculen dan CAMSAP3, zoals andere CAMSAP's, kunnen deelnemen aan het handhaven van de integriteit van microtubuli-netwerken in deze cellen. PCT-cellen hadden een relatief lagere dichtheid van microtubuli dan andere tubuluscellen. Dit vergemakkelijkte waarschijnlijk celvervorming, omdat de microtubuli-netwerken die zouden blijven na CAMSAP3-verlies mogelijk onvoldoende waren om te behouden

de juiste celarchitectuur. Zelfs in PCT-cellen lijken er echter mechanismen te bestaan ​​die het verlies van CAMSAP3 compenseren, aangezien de dilatatie van PCT's niet uniform optrad.

Figuur 5. Lokalisatie van YAP en niet-spier myosine geassocieerd met celvervorming. (a) Immunokleuring voor YAP, Megalin en DAPI in WT- en Camsap3dc/dc-nieren op P22. Fluorescentiesignalen van DAPI en YAP werden gescand langs de lijn die in de vergrote afbeeldingen is getekend, en de ruimtelijke veranderingen in fluorescentie-intensiteit worden weergegeven in blauw voor DAPI en groen voor YAP. Stippellijnen geven het geschatte gebied van de kern aan. Pijlpunten geven de positie van de kern in representatieve cellen aan. (b) Verhouding van nucleaire YAP-intensiteit tot cytoplasmatische YAP-intensiteit [plus/plus, n=81 cellen; dc/dc (verwijd), n =43 cellen; dc/dc (niet verwijd), n=53 cellen]. Boxplots geven de waarden van het eerste kwartiel, mediaan en derde kwartiel aan. ***p<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

Figuur 6. Verandering in PIEZO1-distributie in Camsap3dc/dc PCT's. (a) Immunokleuring voor PIEZO1, Megalin en DAPI in WT- en Camsap3dc/dc-nieren op P22. Fluorescentiesignalen van DAPI en PIEZO1 werden gescand langs de lijn die in de vergrote afbeeldingen is getekend, en de ruimtelijke veranderingen in fluorescentie-intensiteit worden weergegeven in blauw voor DAPI en groen voor PIEZO1. Stippellijnen geven het geschatte gebied van de kern aan. Pijlpunten geven de positie van de kern in representatieve cellen aan. (b) Verhouding van nucleaire piëzo1-intensiteit tot cytoplasmatische piëzo1-intensiteit [plus/plus, n=66 cellen; dc/dc (verwijd), n =44 cellen; dc/dc (niet verwijd), n=81 cellen]. Boxplots geven de waarden van het eerste kwartiel, mediaan en derde kwartiel aan. ***p<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

Hoe werden PCT's dan op regionale wijze verwijd, vergezeld van epitheelcelvetten? Met name cystevorming werd detecteerbaar op E17.5, en deze timing correleert met het begin van primitieve urineproductie bij muizen47. Daarom kunnen we veronderstellen dat 'urinestroom' een potentiële mechanische factor is die verwijding van niertubuli induceert. Het is waarschijnlijk dat PCT-cellen die het CAMSAP3-gemedieerde microtubuli-cytoskelet verloren hadden mechanisch gevoeliger waren voor externe krachten, dat wil zeggen meer vervormbaar, vergeleken met WT PCT-cellen. Zo kunnen krachten die worden geproduceerd door urinestroom in de niertubuli, tubulusverwijding veroorzaken, waardoor ze dik worden. Dergelijke krachten zijn mogelijk niet uniform, wat resulteert in variabele mate van dilatatie langs PCT's. Dit idee sluit uiteraard andere mogelijke mechanismen voor PCT-dilatatie niet uit.

Onze waarnemingen toonden aan dat PIEZO1 geherlokaliseerd is van het cytoplasma naar het nucleaire gebied in verwijde PCT-cellen van Camsap3dc / dc-nieren, wat suggereert dat deze mechanosensor werd geactiveerd als reactie op celvervorming, hoogstwaarschijnlijk het 'uitrekken' van cellen zoals eerder gerapporteerd . De uitgerekte toestand van gedilateerde PCT-cellen werd bevestigd door de waarneming dat MLC2 was verhoogd in hun corticale gebieden. Onze analyse gaf verder aan dat PIEZO1 al tot op zekere hoogte was geactiveerd in niet-verwijde PCT-cellen, wat suggereert dat zelfs deze cellen mechanische veranderingen ondergingen ondanks hun normaal ogende uiterlijk. Een andere mechanosensor, YAP, werd ook geactiveerd in PCT-cellen, maar de activering ervan leek alleen op te treden in uitgerekte cellen.

Hoe dragen deze mechanisch gevoelige regulatoren dan bij aan celvervorming, evenals celproliferatie die werd bevorderd in afwezigheid van CAMSAP3? Er is aangetoond dat de door rekking geïnduceerde activering van PIEZO1 celproliferatie in epitheelcellen bevordert46, wat suggereert dat dit mechanisme ook werkt in PCT-cellen van Camsap3dc/dc-nieren. Dit idee is consistent met onze waarneming dat verhoogde celproliferatie en gedeeltelijke PIEZO1-activering samen optraden, zelfs in niet-verwijde cellen van Camsap3dc/dc PCT's. Wat betreft YAP, de activering ervan was vertraagd en vertoonde geen duidelijke correlatie met het begin van celproliferatieverbetering. YAP staat niet alleen bekend als een celgroeifactor, maar ook als een regulator van mechanische homeostase, zoals eerder aangetoond36,48. Het is daarom mogelijk dat YAP, dat samen met de vervorming van PCT-cellen naar de kern werd verplaatst, zou kunnen functioneren om hun vorm te reguleren, dat wil zeggen om de beschadigde vorm van deze cellen te herstellen. Anders zou YAP kunnen samenwerken met PIEZO1 bij het verbeteren van de proliferatie van verwijde cellen, aangezien bekend is dat YAP betrokken is bij de vorming van polycysteuze nieren via versterking van celproliferatie28.

We ontdekten dat Camsap3dc/dc-muizen significant lagere bloedspiegels van K plus en Mg2 plus hadden, wat suggereert dat hun nieren mogelijk last hadden van een abnormale werking. Ernstige cytologische defecten die we hebben waargenomen in de apicale en basale plasmamembranen van PCT-cellen, waar de actieve transportmachinerie zich bevindt, kunnen verband houden met deze afwijking. We kunnen echter de mogelijkheid niet uitsluiten dat andere delen van niertubuli of andere organen ook functioneel defect zouden kunnen zijn, waardoor dit fenotype wordt geïnduceerd. Bovendien hebben we geen bewijs verkregen dat de fladderende functies van de glomerulus waren beschadigd, aangezien de bloedspiegels van creatinine en ureumstikstof, die via de glomerulus worden uitgescheiden, normaal waren.

Verstoring van de primaire ciliumbiogenese leidt tot PKD24-27. In het geval van Camsap3-mutatie leek de vorming van primaire trilharen onaangetast te zijn. Een recente studie toonde aan dat verlies van CAMSAP3 in nasale multi-cilia-epitheelcellen de vorming van de centrale paren microtubuli in het axoneme beïnvloedde, wat een afwijkende motiliteit in beweeglijke trilhaartjes veroorzaakte. Hoewel de primaire cilia op epitheelcellen niet-beweeglijk zijn en de centrale paren microtubuli missen , blijft het onzeker of de primaire cilium in de Camsap3-mutante muizen nog steeds functioneel is. Ondanks deze onzekerheid zijn de afwijkingen in PKD- en Camsap3-mutanten behoorlijk verschillend, aangezien cystevorming uniform plaatsvindt over de hele nier in de eerste, terwijl het een lokale gebeurtenis is in de laatste. Dit verschil is hoogstwaarschijnlijk toe te schrijven aan de verschillende moleculaire achtergronden van de cystevorming daartussen.

Samenvattend laat onze studie zien dat CAMSAP3 belangrijk is voor het behoud van de structuur en functie van niertubuli in proximale regio's, waarschijnlijk door regulatie van niet-centrosomale microtubuli-assemblage. Verdere studies zullen echter nodig zijn voor een grondig begrip van hoe het verlies van dit microtubuli-organisatiesysteem de fysiologische functies van de nier verstoort.

materialen en methodes

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen, voorschriften en goedgekeurd door het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research en/of de Institutional Biosafety Committee van Waseda University.

muizen. Camsap3-mutant (Camsap3dc/dc) muizen die in dit onderzoek werden gebruikt, werden gegenereerd in ons vorige onderzoek10 (toegangsnummer CDB0716K; //www2.clst.riken.jp/arg/mutant procent 20 muizen procent 20list.html). Bij die muizen werd het C-terminale gebied van Camsap3, namelijk exons 14–17, verwijderd, en we hebben eerder bevestigd dat muiscellen een niet-functioneel C-terminaal afgeknot CAMSAP3 (CAMSAP3-}dc)10 tot expressie brengen. In de huidige studie werden muizen van de N4- en 5-generatie gebruikt in experimenten.

Camsap3 knock-out (Camsap3–/–) muizen (toegangsnummer CDB0033E), die het volledige 22-kb Camsap3 coderingsgebied missen, werden gegenereerd met CRISPR/Cas9-gemedieerde genoombewerking via zygote elektroporatie . Kort gezegd, twee gids-RNA's en een enkelstrengs oligodeoxynucleotide (ssODN) werden ontworpen om het 22-kb-gebied te verwijderen, en een EcoRI-site werd toegevoegd met het oog op herkenning voor succesvolle insertie in mutante muizen. Voor elektroporatie werden cRNA's, tracrRNA, ssODN en Cas9-eiwit geïntroduceerd in de C57BL/6-zygoten. Na elektroporatie werden de zygoten overgebracht naar pseudo-zwangere ICR-vrouwtjesmuizen, en de oorspronkelijke muizen werden gescreend door middel van PCR en DNA-sequencing. Tree knock-out muizen (#4, #10, #23) werden verkregen, en een van hen (#23) had het ontworpen EcoRI knock-in allel. Gids-RNA-sequenties zijn ontworpen door CRISPRdirect (//crispr.dbcls.jp). De crRNA's, tracrRNA en ssODN-sequenties die werden gebruikt voor genoombewerking werden als volgt gesynthetiseerd: 5'-cRNA, 5'-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug-3′, 3'-cRNA , 5′-CAGCCACCUCUGAUC UGACCguuuuagagcuaugcuguuuug-3′; tracrRNA, 5′-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC

GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3′; ssODN, 5′-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

AGCCACAAACTCCATATGCATATGTGAACTCCACCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCCTCCACCCCCACAT-3′ . De hoofdletters en kleine letters geven respectievelijk coderings- en hulpreeksen aan. De muis #23-lijn werd drie keer gekruist met C57BL/6 en de muizen van de N3-generatie werden in experimenten gebruikt.

De experimenten met muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research of Waseda University, en werden uitgevoerd in overeenstemming met de door die commissies verstrekte protocollen. Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen: https: //arriveguidelines.org.

Genotypering. Genotypering voor muizen werd uitgevoerd door PCR. Voor Camsap3dc/dc-muizen gebruikten we primers beschreven in Toya et al. (2016). Voor Camsap3–/– muizen hebben we de volgende primers gebruikt om wildtype (WT) (P1/P2, 411 bp) of Camsap3–/– (P1/P3, 614 bp) allel te detecteren (aanvullend Fig. S2a, b) : P1, 5′- CATGTACCTACCACC ATCC-3′; P2, 5′- GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3′; P3, 5′- GCAGGCTGTAGTGAGCC-3′ . Het P1/P3-gebied in WT werd niet geamplificeerd onder de gebruikte PCR-omstandigheden.

Histologie: Bereiding van bevroren weefselcoupes. Ontleed nierweefsel werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gefixeerd in 2 procent paraformaldehyde (Termo Fisher) / 0.1 M sorbitol (Nacalai Tesque) / PEM-buffer. Recept voor PEM is: 100 mM PIPES (Nacalai Tesque), 5 mM EGTA (Nacalai Tesque) en 5 mM MgCl2 (Wako), ingesteld op pH 6,9 met 2 M KOH. Na fixatie werd het nierweefsel driemaal gespoeld met PEM gedurende 10 minuten. Ten tien werd cryoprotectie uitgevoerd met sucrose / PEM: 15 procent sucrose in PEM-oplossing gedurende 2 uur bij 4 graden, gevolgd door 20 procent sucrose in PEM-oplossing 's nachts bij 4 graden, en vervanging door 30 procent sucrose in PEM-oplossing gedurende ~ 2 uur bij 4 graden. Het nierweefsel werd ingevroren in OCT-verbinding in een inbeddingsvorm (Polysciences, Inc.) in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 graden. Bevroren monsters werden met een CM1850 Cryostat (Leica) met een dikte van 5 µm in plakjes gesneden. Secties op objectglaasjes werden op -80 graden gehouden tot kleuring.

Histologie: Bereiding van in paraffine ingebedde weefselcoupes. Ontleed nierweefsel werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in Super Fix-oplossing (Kurabo) gefixeerd en vervolgens 's nachts overgebracht naar 4 graden. Elk monster werd blootgesteld aan drie waterige ethanoloplossingen met toenemende concentratie bij kamertemperatuur: 30 procent ethanol gedurende 3{{20}} min tweemaal, 50 procent ethanol gedurende 3{ {35}} min, en uiteindelijk 70 procent ethanol gedurende 30 min. Elk monster werd verwerkt met een ASP300 Tissue Processor (Leica). Tien werden de nierweefselmonsters ingebed in parafnwas (Sakura Finetek) met een EG1160 (Leica) en bewaard bij 4 graden. In parafn ingebedde monsters werden gesneden met een dikte van 6 µm met een RV240 Rotary Microtome (Yamato Kohki). Secties op objectglaasjes werden op 4 graden gehouden tot kleuring. Immunofluorescerende kleuring. Bevroren niercoupes werden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur ondergedompeld in 0,1 procent Triton X-100 (Nacalai Tesque)/PEM. Tien monsters werden permeabel gemaakt door 0,2 procent Triton X-100/PEM gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur aan te brengen. Opnieuw werden monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur ondergedompeld in 0,1 procent Triton X-100 / PEM. Vervolgens werden monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geblokkeerd met 3 procent runderserumalbumine (BSA; Roche) / 0,1 procent Triton X -100 / PEM, gevolgd door primaire antilichaamreactie gedurende een nacht bij 4 graden. Primaire antilichamen werden verdund in 3 procent BSA / 0,1 procent Triton X-100 / PEM. Voor primaire antilichamen die in muizen zijn opgewekt, werd aanvullende blokkering met MOM Blocking Reagent (Vector Laboratories) uitgevoerd voordat blokkering in 3 procent BSA / 0,1 procent Triton X-100 / PEM werd uitgevoerd. MOM Blocking Reagent werd verdund in 0,1 procent Triton X-100/PEM en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op de monsters aangebracht. Na de MOM-behandeling werden de monsters driemaal gewassen met 0,1 procent Triton X-100/PEM gedurende 5, 10 en 15 minuten bij kamertemperatuur. Na de primaire antilichaamreactie werden de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gewassen met driemaal 0,1 procent Triton X-100/PEM. De secundaire antilichaamreactie werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker uitgevoerd. Secundaire antilichamen werden verdund in 3 procent BSA / 0,1 procent Triton X-100 / PEM. Na de reactie werden de monsters gewassen met 0,1 procent Triton X-100/PEM driemaal gedurende 5, 10 en 15 minuten bij kamertemperatuur en afgesloten met VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories). Antilichamen en reagentia. DNA werd gekleurd met DAPI-oplossing (Dojindo, D523, 1:1000). F-actine werd gekleurd met Alexa Fluor 594 phalloidin (Termo Fisher, A12381, 1:400). Microtubuli werden gekleurd met muis-anti- -tubuline-FITC (DM1A; Sigma Aldrich, F2168, 1:200). De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: geit anti-Megalin (P-20; Santa Cruz Biotechnology, sc-16478, 1:200), konijnen anti-NaCl co-transporter (MERCK, AB3533, 1:500 ), anti-aquaporine van konijnen-2 (abcam, AB3274, 1:400), anti-SGLT1 van geit (M-19; Santa Cruz Biotech- nology, sc-20582, 1:200) , konijnen-anti-SGLT2 (Novus Biologicals, NBP1-92384, 1:200), muizen-anti-ezrin (3C12; abcam, ab4069, 1:500), konijnen-anti-giantin (Covance, PRB-114 C, 1:700), konijnen-anti-aPKC (Santa Cruz Biotech- nology, sc-216, 1:400), geiten-anti-DPP IV (R&D Systems, AF954, 1:100), muizen-anti-Na plus /K plus -ATPase (abcam, ab7671, 1:100), muis anti-geacetyleerd tubuline (Sigma Aldrich, T6793, 1:200), konijn anti-CAMSAP3 (Tanaka et al., 2012, 1:400), muis anti-tyrosinated tubuline (Sigma Aldrich, T9028, 1:200), konijn anti-Ki-67 (SP6; abcam, ab16667, 1:250), konijn anti-YAP (Cell Signaling, #4912, 1:100 ), konijn anti-myosine lichte keten 2 (Cell Signaling, #8505, 1:100), konijn anti-piezo1 (Novus Biologicals, N BP1-78446, 1:100), ratten-anti-E-cadherine (52, 1:400) en konijnen-anti-merlin (Sigma Aldrich, HPA003097, 1:100). De volgende secundaire antilichamen werden gebruikt: ezel Dylight 594-geconjugeerd anti-geit IgG (Jackson, 1:500), geit Alexa Fluor 488/594-geconjugeerd anti-konijn IgG (Termo Fisher, A-11034, A -11037, 1:500), geit Alexa Fluor 488/594 – geconjugeerd anti-muis IgG (Termo Fisher, A-11029, A-11032, 1:500), en geit Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-rat IgG (Termo Fisher, A-11006,

1:400). De bindingsspecificiteit van de anti-YAP (Cell Signaling, #4912) en anti-PIEZO1 (Novus Biologicals, NBP1-78446) antilichamen die in het onderzoek werden gebruikt, werden geverifieerd door eerder werk46,53. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring. Glasplaatjes met niercoupes werden gedurende 30 minuten op een plaat van 55 graden geplaatst om de parafn uit te rekken. Monsters werden vervolgens tweemaal gedurende 15 minuten ondergedompeld in xyleen, gevolgd door onderdompeling in een reeks van 70-100 procent ethanol: 100 procent ethanol gedurende 5 minuten tweemaal, 90 procent ethanol gedurende 5 minuten, 80 procent ethanol gedurende 5 minuten en 70 procent ethanol gedurende 5 minuten. Na 20 min spoelen in water en 1 min in gedestilleerd/gedeïoniseerd H20 (ddH2O) werden de monsters 5 min gekleurd in Mayer's hematoxyline-oplossing (Wako). Monsters werden tweemaal in ddH20 gedompeld en vervolgens 10 minuten gespoeld met ddH20. Monsters werden opnieuw in ddH20 gedompeld en vervolgens 2 minuten in eosine-oplossing (Merck) gekleurd. Voor uitwassing werden de monsters 30 s ondergedompeld in ddH2O, gevolgd door onderdompeling in series van 70-100 procent ethanol en xyleen: 70 procent ethanol gedurende 5 s, 80 procent ethanol gedurende 5 s, 90 procent ethanol gedurende 5 s, 100 procent ethanol gedurende 5 s tweemaal, en xyleen gedurende 10 minuten. Tenslotte werden de monsters verzegeld in glycerol. Microscopie. Beelden werden verkregen met BZ-X710 All-in-one fluorescentiemicroscoop (Keyence) of LSM880 laser scanning confocale microscoop (Zeiss). Voor de BZ-X710 waren de gebruikte objectieflenzen Nikon CFI Plan Apo λ 2 × , 10 × , 40 × , 100 × en Nikon CFI Plan Fluor 4 × . De verkregen beelden werden verwerkt met BZ-X Analyzer-software. De LSM880 was uitgerust met een Axio Observer Z1 omgekeerde microscoop met een Plan-Apochromat 63 × /1.40 NA olie-immersie objectieflens (Zeiss). Afbeeldingen werden verwerkt en geanalyseerd met ImageJ en Adobe Photoshop CC2019. Cystic index analyse. Cystic index werd geanalyseerd door ImageJ met behulp van H & E-gekleurde beelden van de horizontale sectie van de nier. Als een meting van het cyste-bevattende gebied werd de omtrek van het verwijde buisvormige lumen getraceerd met behulp van de functie "Selecties uit de vrije hand", en het gebied ervan werd gemeten met de functie "Meten". Dit werk werd uitgevoerd voor alle cysten in de niersectie, en de gebieden van alle cysten werden bij elkaar opgeteld om het cyste-bevattende gebied te bepalen. Het totale nieroppervlak werd op dezelfde manier gemeten. De buitenomtrek van de nier werd getraceerd met behulp van de functie "Freehand selections" en de oppervlakte werd bepaald. Ten slotte hebben we de cystische index berekend door het cyste-bevattende gebied te delen door het totale niergebied.

Definitie van verwijde tubuli en niet-verwijde tubuli. In dit onderzoek zijn tubuli met een lumenoppervlak groter dan of gelijk aan 500 µm2 gedefinieerd als "verwijd", terwijl tubuli met een lumenoppervlak van<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

Elektronenmicroscopie. Voor elektronenmicroscopie werden P21 mannelijke muizen onderzocht. Monsters voor scanning-elektronenmicroscopie werden als volgt bereid volgens Takahashi-Iwanaga met bepaalde modificaties. Muizen werden verdoofd met isofuraan en geperfuseerd met 2 procent (w/vol) formaldehyde en 2,5 procent (vol/vol) glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaatbufer, pH 7,4. Elke nier werd uitgesneden en in blokjes gesneden die een nacht in hetzelfde fixeermiddel werden ondergedompeld, en vervolgens gespoeld met 0.1 M cacodylaatbufer. De gefixeerde monsters werden overgebracht door een 30 procent waterige oplossing van dimethylsulfoxide in 60 procent dimethylsulfoxide, en vervolgens gebroken in vloeibare N2. De gebroken monsters werden gespoeld met 0.1 M cacodylaatbufer en 1{{30}}–20 min bij 60 graden in 6 N NaOH geplaatst. Na maceratie in de NaOH-oplossing werd elk monster gespoeld met 0,1 M cacodylaatbufer die 0,05 procent Tween 20 bevatte en nagefixeerd met 1 procent Os04 in 0,1 M cacodylaatbufer op ijs gedurende 2 uur. De nabewerkte monsters werden: (1) gespoeld met ddH2O en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in 1 procent waterige thiocarbohydrazide geplaatst, en (2) gespoeld met ddH2O en opnieuw nabewerkt in 1 procent Os04 in 0,1 M cacodylaatbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur . Na het herhalen van stappen (1) en (2) werden de monsters gespoeld met ddH20 en een nacht bij kamertemperatuur gekleurd met 0,5 procent uranylacetaatoplossing. De weefselblokken werden gespoeld met ddH2O en gedehydrateerd door een gegradeerde reeks ethanol, overgebracht naar isopentylacetaat en kritisch puntgedroogd met vloeibaar CO2. De gedroogde monsters werden verdampt met osmium en onderzocht met een JSM-5600LV scanning elektronenmicroscoop bij een versnellingsvoltage van 10 kV. Afbeeldingen zijn bewerkt met Adobe Photoshop.

Voor transmissie-elektronenmicroscopie werden kubussen van ontlede nieren gedurende ten minste 2 uur gefixeerd in 2 procent (w/vol) formaldehyde en 2,5 procent (vol/vol) glutaaraldehyde in 0.1 M cacodylaatbufer bij kamertemperatuur. De monsters werden gewassen met 0.1 M cacodylaatbufer en nagefixeerd met 1 procent OsO4 in {{10}}.1 M cacodylaatbufer op ijs gedurende 2 uur. Monsters werden vervolgens gewassen met ddH20 en overnacht gekleurd met 0,5 procent waterig uranylacetaat bij kamertemperatuur. De gekleurde monsters werden gedehydrateerd met een gegradeerde reeks ethanol, overgebracht naar propyleenoxide en ingebed in Polybed 812 (Polysciences). Ultradunne secties werden gesneden met een diamanten mes, dubbel gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat, en waargenomen bij 100 kV versnellende spanning met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (JEM-1010; JEOL) uitgerust met een ladingsgekoppelde apparaatcamera ( BioScan-model 792; Gatan). Afbeeldingen zijn bewerkt met Adobe Photoshop.

Urineonderzoek en bloedonderzoek. Ter vergelijking met Camsap3dc/dc-muizen werden WT (plus/plus) en heterozygote (plus/dc) muizen gebruikt als controles in deze testen. Heterozygote muizen vertonen geen tekenen van Camsapdisfunctie10en hebben apico-basale arrays van microtubuli georganiseerd. Muizen waren 56-60 weken oud.

Muizen werden gehuisvest in een metabole kooi (TECNIPLAST). Urinemonsters werden elke dag gedurende vijf opeenvolgende dagen verzameld en de verzamelde monsters werden bewaard bij -80 graden. Ten slotte werden alle vijf monsters van elke muis gemengd, zodat het laatste mengsel de gemiddelde toestand van elke muis over die periode weerspiegelde.

Voor de bloedafname hebben muizen {{0}},02 ml verdoving per gram lichaamsgewicht toegediend. De samenstelling van de anesthesie was Domitor (ZENOAQ) 30 µL, Midazolam (Sandoz) 80 µL, Vetorphale (Meiji Seika Pharma) 100 µL en 0,9 procent waterig NaCl tot 1 ml. Bloed werd verzameld door middel van een hartpunctie. Om hemolyse te voorkomen, werd de spuit voorzichtig ingebracht en eruit getrokken. Elk bloedmonster werd gedurende 1 uur op kamertemperatuur gehouden om te coaguleren. Elk monster werd vervolgens gecentrifugeerd (10,000xg, 25 graden, 15 min), en serum werd verzameld en bewaard bij -80 graden. Alle urine- en bloedmonsters werden geanalyseerd door Oriental Yeast Co.