Danegaptide voorkomt door TGF veroorzaakte 1-schade in epitheelcellen van de menselijke proximale tubulus van de nier

edmund.chen@wecistanche.com

Abstract:chronischnierziekte(CKD) is een wereldwijd gezondheidsprobleem dat gepaard gaat met een aantal comorbiditeiten. Recent bewijs impliceert een verhoogde hemikanaal-gemedieerde afgifte van adenosinetrifosfaat (ATP) bij de progressie van tubulo-interstitiële fibrose, de belangrijkste onderliggende pathologie van CKD. Hier evalueren we het effect van danegaptide op het blokkeren van hemikanaal-gemedieerde veranderingen in de expressie en functie van eiwitten geassocieerd met ziekteprogressie in tubulair epitheelniercellen. Primaire humane proximale tubulusepitheelcellen (hPTEC's) werden behandeld met de beta1-isovorm van de pro-fibrotische cytokine transformerende groeifactor (TGF 1) ± danegaptide. qRT-PCR en immunoblotting bevestigden mRNA- en eiwitexpressie, terwijl een cytokine-antilichaamarray de expressie/uitscheiding van pro-inflammatoire en profibrotische cytokinen beoordeelde. Carboxyflfluoresceïne kleurstofopname en ATP-biosensing maten hemikanaalactiviteit en ATP-afgifte, terwijl transepitheliale elektrische weerstand werd gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te beoordelen. Danegaptide negeerde de opname van carboxyfluoresceïnekleurstof en ATP-afgifte en beschermde tegen eiwitveranderingen geassocieerd met tubulair letsel. Het blokkeren van Cx43-gemedieerde ATP-afgifte ging gepaard met gedeeltelijk herstel van de expressie van celcyclusremmers, aanhangers en tight junction-eiwitten en verminderde paracellulaire permeabiliteit. Bovendien remde danegaptide door TGF 1-geïnduceerde veranderingen in de expressie en secretie van belangrijke adipokinen, cytokinen, chemokinen, groeifactoren en interleukinen. De gegevens suggereren dat danegaptide als een gap junction-modulator en hemikanaalblokker potentieel heeft bij de toekomstige behandeling van CKD.

trefwoorden:danegaptide; connexine; hemikanaal; ATP; chronische nierziekte; ontsteking; fibrose; hPTEC's; TGF 1; nier, nier

CISTANCHE ZAL NIER/NIIERZIEKTE VERBETEREN

Invoering

chronischnierziekte(CKD) is een groeiend gezondheidsprobleem dat gepaard gaat met een verhoogd risico op hart- en vaatziekten en morbiditeit [1]. Naar schatting treft 10 procent van de wereldbevolking [2], risicofactoren zijn leeftijd, diabetes, hypertensie, dyslipidemie en obesitas [3]. De ziekte wordt gekenmerkt door een afname van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR), naast proteïnurie, met glomerulosclerose, tubulaire atrofie en tubulo-interstitiële fibrose (TIF), die veelvoorkomende histopathologische veranderingen zijn [4]. Met als hoogtepunt het verlies van epitheliale stabiliteit, aanhoudende ontsteking en verhoogde afzetting van de extracellulaire matrix [5,6], vertegenwoordigt de behandeling van TIF en gevorderde CKD een onvervulde klinische behoefte [3]. Bijgevolg zijn dringende therapeutische benaderingen vereist. Veranderde expressie en functie van connexine (Cx) zijn betrokken bij de pathologie van verschillende vormen van de ziekte (zoals besproken in [7]), waaronder CKD (zoals beschreven in [8,9]). Connexines zijn een familie van membraangebonden eiwitten die oligomeriseren tot hexamere assemblages die connexons worden genoemd [10]. Wanneer naburige cellen op één lijn liggen, koppelen connexons om gap junctions te vormen, continue poriën waardoor boodschappermoleculen kunnen worden uitgewisseld, waardoor een directe communicatieroute mogelijk is [10]. Wanneer ze ongebonden zijn, vormen connexonen hemikanalen waardoor moleculen, bijv. adenosinetrifosfaat (ATP), kunnen worden afgegeven in de lokale extracellulaire ruimte om naburige cellen te beïnvloeden via activering van purinoreceptoren [11]. Expressie van de purinerge P2X7-receptor (P2X7R) wordt opgereguleerd in deniertubuli van mensen met diabetesnierziekte[12] en is sterk betrokken bij de progressie van fibrose, zowel in denier[13-17] en in andere weefseltypes [18-21]. Het is niet verwonderlijk dat het richten op purinerge signalering veel aandacht heeft gekregen. Tot op heden hebben klinische onderzoeken echter geen gunstige effecten van P2X7R-antagonisme bij tal van ontstekingsaandoeningen aangetoond, een effect dat mogelijk verband houdt met genetische variatie binnen de receptor [22]. Door zich stroomopwaarts van de ATP-afgifte te richten, zouden deze problemen kunnen worden omzeild.

Bewijs verbindt de afwijkende expressie en/of activiteit van connexines met verschillende vormen van CKD [12,23-26]. Eerste studies door Abed et al. rapporteerde dat heterogene (Cx43 plus /-) muizen, met unilaterale ureterale obstructie (UUO), verminderde afzetting van extracellulaire matrix (ECM) en verminderde ontsteking [27], terwijl de Cx43-specifieke mimeticum, GAP{{6} }, was in staat om monocytadhesie te remmen en de expressie van collageen I in het renine-transgen (RenTG) muismodel van renine-afhankelijke CKD te verminderen [25]. Meer recent hebben we vastgesteld dat de overheersende connexine-isovorm die tot expressie wordt gebracht in de proximale tubulus, Cx43, verhoogd is in biopsiemateriaal dat is geïsoleerd van personen met diabetische nefropathie, een waarneming die gepaard gaat met verhoogde hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte in met TGFp1-behandelde primaire proximale tubuluscellen [12]. Bij het evalueren van de impact van lokale verhogingen van extracellulaire ATP-concentraties, hebben we vastgesteld dat afwijkende Cx43-gemedieerde communicatie de demontage van aanhangers (bijv. E-cadherine) en strakke (bijv. Zona Occludens) junctiecomplexen initieert via activering van P2X7R. Deze effecten, die teniet werden gedaan in een heterogeen Cx43 plus /- muismodel van UUO [12], suggereren een duidelijk verband tussen Cx43 en tubulair letsel. Terwijl gedeeltelijke ablatie van Cx43 een rol bevestigt voor connexines bij het initiëren van fenotypische veranderingen van tubulaire schade, heeft farmacologische interventie met het Cx43 hemikanaalblokkerpeptide vastgesteld dat de beschermende aard van deze verminderde Cx43-activiteit voortkomt uit remming van hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte. Het gebruik van mimetische peptiden om de beschermende aard achter het blokkeren van hemikanaalactiviteit te onderstrepen, is met succes gerapporteerd in andere ziektemodellen, waaronder retinopathie [28], neuro-inflammatie [29], glioom [30,31] en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie [32, 33]. Uiteindelijk koppelen studies veranderde connexine-activiteit aan verhoogde ontsteking [34-36] en fibrose [37-40] en suggereren dat stabiliserende hemikanaal- en/of gap-junction-gemedieerde communicatie (GJIC) het begin van schade kan vertragen waargenomen in verschillende modellen van letsel. Dientengevolge biedt het remmen van connexine-hemikanalen een aantrekkelijk middel om ontstekingen te verminderen en is het van aanzienlijk therapeutisch belang.

Danegaptide ((2S, 4R)-1-(2-aminoacyl)-4-benzamidopyrrolidine2-carbonzuur), ook bekend als ZP1609 of GAP-134, is een kleine dipeptide afgeleid van rotigaptide (AAP10, ZP123). Oorspronkelijk ontwikkeld als een anti-aritmisch middel [41], interageert het met Cx43 [42] en werkt het als een krachtige gap junction modifier [43]. De verbinding heeft beschermende en anti-aritmische eigenschappen aangetoond en heeft eerder significante effecten laten zien in gevestigde preklinische modellen van cardiale ischemische reperfusieletsels [44,45]. Terwijl klinische fase 2-onderzoeken bij mensen helaas hun eindpunt niet bereikten [46], hebben onderzoeken van andere groepen het therapeutische potentieel van danegaptide in andere weefseltypen en ziektemodellen onderzocht [41,47-49]. Bovendien is er, hoewel er weinig bekend is over zijn rol bij het moduleren van hemikanaalactiviteit, aangetoond dat danegaptide hemikanaal-gemedieerde kleurstofopname in C6-glioomcellen vermindert [43]. Desondanks moet een rol voor deze verbinding bij het blokkeren van hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte in andere weefseltypen nog worden bevestigd.

CISTANCHE ZAL NIER-/NIERSTORING VERBETEREN

De huidige studie onderzocht de werkzaamheid van danegaptide bij het tenietdoen van door connexine gemedieerde hemikanaal-ATP-afgifte in primaire met TGF 1-behandelde humane proximale tubulusepitheelcellen (hPTEC's), voordat de beschermende rol ervan werd afgebakend tegen de expressie en functionele veranderingen die gewoonlijk worden geassocieerd met de progressie van tubulo-interstitiële fibrose. Met behulp van technieken om veranderingen in expressie (qRT-PCR, immunocytochemie, immunoblotting, antilichaamarrays) en functie (ATP-biosensing, kleurstofopname, transepitheliale elektrische weerstand, antilichaamarrays) te bepalen, tonen onze bevindingen aan dat nanomolaire concentraties van danegaptide Cx hemikanaal-gemedieerde ATP blokkeren afgifte en gedeeltelijke verzwakking van TGF 1-geïnduceerde veranderingen in de expressie van celcycluseiwitten (bijv. p16, p21, cycline D1) en reno-beschermende factoren (bijv. Klotho). Bovendien vermindert danegaptide de veranderingen die vaak worden waargenomen bij tubulair letsel, waaronder demontage van adhesieve junctions (inclusief verlies van E-cadherine) en tight junctions (inclusief verlies van zona occludens 1 (ZO-1) en claudine 2). Belangrijk is dat de proteoomprofiler-array het vermogen van danegaptide aantoonde om veranderingen in de expressie en secretie van belangrijke extracellulaire matrixeiwitten, adipokines, chemokinen en groeifactoren geïnduceerd door TGF 1 te herstellen. Bijgevolg suggereren onze in vitro-gegevens dat danegaptide (50-100 nM ) kan met succes hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte in primaire hPTEC's blokkeren en gedeeltelijk beschermen tegen veranderingen geassocieerd met ontsteking en fibrose, zoals waargenomen bij CKD in een laat stadium.

2. Resultaten

2.1. Danegaptide heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van tubulaire epitheelcellenMenselijknier2 (HK2)-cellen werden 48 uur in lage glucose (5 mM) gekweekt, voordat ze een nacht in serum werden uitgehongerd en vervolgens behandeld met de optimale concentratie van TGF 1 (10 ng / ml) [12,24] ± danegaptide (50 nM–1 µM) gedurende 48 uur (Figuur 1A, n=3). Een 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-assay bevestigde dat geen van beide TGF 1 (101,9 ± 11,7 procent) noch danegaptide alleen veranderde de levensvatbaarheid van de cellen (95,2 ± 7 procent (50 nM), 103 ± 5,7 procent (100 nM) en 96,6 ± 5,3 procent (1 µM)) in vergelijking met controles. Er werd geen effect waargenomen wanneer met TGF 1-behandelde cellen samen werden geïncubeerd met danegaptide (104,1 ± 2,2 procent (50 nM), 93,4 ± 1,6 procent (100 nM) en 89,3 ± 3,7 procent (1 µM)). Om deze gegevens te bevestigen, werd een kristalviolet (CV) en lactaatdehydrogenase (LDH) -assay uitgevoerd. LDH-afgifte in met TGF 1-behandelde cellen was vergelijkbaar met controles (109,3 ± 11,3 procent), en co-incubatie met danegaptide had geen bijkomend effect (106,4 ± 11,6 procent (50 nM), 113,9 ± 15,6 procent (100 nM) en 113,2 ± 4,3 procent (1 µM)). Zoals verwacht veranderde danegaptide alleen de LDH-afgifte niet significant in vergelijking met controles (104,4 ± 4,3 procent (50 nM), 95,3 ± 4,7 procent (100 nM) en 92,6 ± 3,3 procent (1 µM)). Celkleuring met kristalviolet recapituleerde deze bevindingen, waarbij gegevens voor TGF 1 (10 ng/mL; 96,9 ± 7,3 procent) en TGF 1 plus danegaptide (50 nM–1 µM) vergelijkbaar waren met controles (98,2 ± 1,9 procent (50 nM) , 97,5 ± 1,8 procent (100 nM) en 85,8 ± 5,3 procent (1 µM) Ten slotte veranderde danegaptide alleen de kristalviolette kleuring niet (98,3 ± 2,5 procent (50 nM), 99,6 ± 2,7 procent (100 nM) en 98,5 ± 2,2 procent (1 µM) van de controles. In het licht van deze gegevens werd een concentratie van 50-100 nM gekozen voor vervolgonderzoeken.

Figuur 1. Danegaptide voorkomt door TGF 1-opgewekte verhogingen van hemikanaal-gemedieerde kleurstofopname. In paneel (A), mensnier2 (HK2) cellen werden 48 uur gekweekt in lage glucose (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (50, 100 en 1000 nM) en de levensvatbaarheid van de cellen was beoordeeld. Resultaten worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM (n=3). Incubatie met TGF 1 (10 ng/ml ± danegaptide (50-1000 nM)) veranderde niet 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{ 19}}difenyltetrazoliumbromide (MTT) opname, lactaatdehydrogenase (LDH) afgifte of kristalviolet (CV) kleuring. In panelen (B) en (C) werd de opname van carboxyfluoresceïnekleurstof gebruikt om de hemikanaalactiviteit in HK2-cellen en menselijke proximale tubulusepitheelcellen (hPTEC's) te beoordelen, waarbij de mate van kleurstoflading recht evenredig was met het openen. Cellen werden 48 uur gekweekt in lage glucose (5 mM) ± TGF 1 (10 ng / ml) ± danegaptide (50 of 100 nM). Danegaptide voorkwam dat TGF 1-opwekte verhogingen van de opname van carboxyflfluoresceïnekleurstof in HK2-cellen (paneel (B)) en hPTEC's (paneel (C)). Minimale kleurstofbelading vond plaats in controlecellen, terwijl kleurstofbelading significant toenam in cellen behandeld met TGF 1. De toevoeging van danegaptide (50 of 100 nM) verminderde de kleurstofopname, waardoor de FL-fluorescentie-intensiteit terugkeerde naar controleniveaus. De intensiteit wordt uitgedrukt als een percentage in vergelijking met controles met een laag glucosegehalte en is representatief voor 3 afzonderlijke experimenten. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM (n=3), waarbij de belangrijkste significantie wordt aangegeven (** p <0,01, ***="" p=""><0,001; one-way="" anova="" en="" tukey's="">

2.2. Danegaptide blokkeert TGF 1-opgeroepen veranderingen in hemichannel-gemedieerde kleurstofopname in tubulaire epitheelcellenWe hebben eerder aangetoond dat TGF 1 de Cx43-gemedieerde hemikanaalactiviteit en ATP-afgifte uit proximale tubulusepitheelcellen verhoogt [24]. Een carboxyflfluoresceïne-kleurstofopname-assay werd gebruikt om te bepalen of danegaptide TGF 1-geïnduceerde kleurstofopname via hemikanalen in HK2-cellen en primaire hPTEC's kan tenietdoen. Zoals verwacht verhoogde TGF 1 (10 ng/mL) de kleurstofopname tot 354,9 ± 32,6 procent van de controles in HK2-cellen, terwijl co-incubatie met danegaptide (50 nM en 100 nM) aanzienlijk afstompt de respons op respectievelijk 165,5 ± 17,9 procent en 147,6 ± 18,1 procent (Figuur 1B; p Kleiner dan of gelijk aan 0,001, n=4). Danegaptide alleen veranderde de kleurstofopname niet. De opname van carboxyflfluoresceïnekleurstof was verhoogd met TGF 1 (10 ng/ml) in primaire hPTEC's (310,8 ± 38,6 procent van de controles), een respons die gedeeltelijk teniet werd gedaan door de co-incubatie van danegaptide (100 nM; 145 ± 19,7 procent) in vergelijking met controles (Figuur 1C; p Kleiner dan of gelijk aan 0,01, n=4).

2.3. Danegaptide negeert TGF 1-geïnduceerde hemichannel-gemedieerde ATP-afgifte in HK2-cellenOm te bepalen of danegaptide (5{{10}}–100 nM) de door TGF 1 (10 ng/mL) geïnduceerde afgifte van ATP zou kunnen voorkomen van hemikanalen in HK2-cellen gebruikten we ATP-biosensing [24,50]. TGF 1 (10 ng/ml) verhoogde ATP-afgifte van 0,33 ± 0,11 µM tot 3,60 ± {{40} }.29 µM (Figuur 2A,B,E; p Kleiner dan of gelijk aan 0.001), een effect dat gedeeltelijk teniet wordt gedaan door danegaptide bij beide 50 nM (1,90 ± 0,26 µM; p Kleiner dan of gelijk aan 0,01 ) en 100 nM (0,79 ± 0,19 µM; p Minder dan of gelijk aan 0,001) (Figuur 2D, E, n=3, zes herhalingen/monsternummer). Danegaptide alleen had geen invloed op de ATP-afgifte (Figuur 2C, E), met ATP-niveaus geregistreerd bij 0,35 ± 0,10 M (50 nM) en 0,31 ± 0,09 M (100 nM) in vergelijking met controles (Figuur 2E).

2.4. Danegaptide keert door TGF 1-geïnduceerde veranderingen in celcycluseiwitten en een marker van reno-bescherming in hPTEC's omOm te bepalen of danegaptide hemikanaal-gemedieerde regulatie van gemeenschappelijke celcyclus en reno-beschermende markers teniet kan doen, werden hPTEC's geïncubeerd met TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (10 0 nM) voor 12 uur en de expressie van kandidaatgen-mRNA beoordeeld door middel van qPCR-analyse. Toevoeging van danegaptide aan met TGF 1- behandelde hPTEC's leverde de expressie van p16 op van 358,8 ± 21,1 procent tot 193 ± 18,5 procent van de controles, p21-expressie van 221,8 ± 12,9 procent tot 142,2 ± 6,2 procent en cycline D1-expressie van 253,2 ± 7,7 procent tot 132,9 ± 15,0 procent (Figuur 3; p Kleiner dan of gelijk aan 0,001, n=3). Bovendien keerde danegaptide de daling in Klotho gedeeltelijk om van 43,3 ± 3,8 procent naar 59,9 ± 11,7 procent van de controles (Figuur 3, n=3).

2.5. Danegaptide herstelt TGF 1-gemedieerde veranderingen in aanhechtende en strakke verbindingseiwitten en paracellulaire permeabiliteit in hPTEC'sIn denierverminderde E-cadherine (ECAD)-gemedieerde celadhesie initieert een reeks gebeurtenissen die culmineren in een intermitterend fenotype geassocieerd met gedeeltelijke epitheliale naar mesenchymale transformatie. Initiatie vergemakkelijkt de demontage van zowel aanhangers als tight junction-complexen, met als hoogtepunt verlies van adhesie, verminderde intercellulaire communicatie tussen gap junctions en lekkend epitheel [12,24,51]. Om te bepalen of danegaptide door TGF 1-gemedieerde veranderingen in hechting en tight junction-eiwitten teniet kan doen, werden hPTEC's geïncubeerd met TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (10{{41 }} nM) gedurende 48 uur en de expressie van kandidaat-eiwitten werd beoordeeld. Danegaptide herstelde gedeeltelijk E-cadherine-expressie van 33,3 ± 3,3 procent tot 89 ± 7,6 procent van de controles, N-cadherine (NCAD)-expressie van 224,4 ± 29,6 tot 161,9 ± 27,4 procent en vimentine-expressie van 212,9 ± 13 procent tot 147,3 ± 8,8 procent ( Figuur 4A; p Kleiner dan of gelijk aan 0.001, p Kleiner dan of gelijk aan respectievelijk 0,01 en p Kleiner dan of gelijk aan 0,001; n {{43} }). -catenine-expressie bleef ongewijzigd door de hemikanaalblokker van 149,2 ± 11,2 procent (alleen TGF 1) tot 151,6 ± 16,8 procent (TGF 1 plus danegaptide, figuur 4B; p=NS, n=3). Beoordeling van de effecten van danegaptide op tight junction-eiwitten bevestigde dat de gap junction-modulator de expressie van claudine-2 gedeeltelijk herstelde van 44,5 ± 5 procent tot 74,6 ± 5 procent van de controles en ZO-1 van 27,8 ± 11,3 procent tot 52,8 ± 5,4 procent in vergelijking met controles (Figuur 4B; p Kleiner dan of gelijk aan 0,05, n=3). Studies naar transepitheliale elektrische weerstand bevestigden dat verminderde expressie van tight junction-eiwitten gezien met TGF 1 (10 ng/ml) gepaard gaat met een verlies van transepitheliale weerstand van 57,33 ± 1.86 Ω·cm2 tot 10 ± 1,53 Ω· cm2 (p Kleiner dan of gelijk aan 0,001, n=3). Deze verhoogde lekkage werd gedeeltelijk gecorrigeerd door co-incubatie met danegaptide (36 ± 2,08 Ω·cm2) (Figuur 4C; p Kleiner dan of gelijk aan 0,001, n=3).

2.6. Danegaptide voorkomt dat TGF 1-opgewekte opregulatie van extracellulaire matrixeiwitten in hPTEC'sveroorzaakt door een onbalans tussen vorming en afbraak, is de accumulatie van de ECM een belangrijk kenmerk van CKD. Een rol voor TGF 1 in dit proces is goed ingeburgerd [52], en het begrijpen hoe deze veranderingen teniet kunnen worden gedaan, heeft duidelijke implicaties voor de progressie van de ziekte. Om het effect van danegaptide op door TGF 1-opgewekte veranderingen in de expressie van ECM-eiwitten te onderzoeken, werden hPTEC's 48 uur in lage glucose (5 mM) gekweekt, een nacht uitgehongerd met serum en behandeld met TGF 1 (1{{ 28}} ng/ml) ± danegaptide (100 nM) gedurende 48 uur. In vergelijking met controles verhoogde TGF 1 de expressie van de ECM-eiwitten collageen I (334,6 ± 30,14 procent), collageen IV (354,5 ± 16,9 procent), fibronectine (301,7 ± 50,4 procent) en laminine (324,8 ± 36,4 procent) (Figuur 5A, B; p Kleiner dan of gelijk aan 0,001, n=3). Co-incubatie met danegaptide verzwakte deze veranderingen aanzienlijk en herstelde de expressie tot 180,7 ± 27,3 procent (collageen I), 164 ± 6,9 procent (collageen IV), 161,3 ± 4 procent (fibronectine) en 149 ± 20,4 procent (laminine) (p Less dan of gelijk aan 0,001; n=3 in elk geval). Danegaptide (100 nM) verminderde ook door TGF 1 (10 ng/mL) opgewekte veranderingen in integrine-linked kinase 1 (ILK1) van 378,9 ± 16,8 procent tot 251,8 ± 33 procent (p kleiner dan of gelijk aan 0,001) maar had een minimaal effect op matrix metalloproteinase 3 (MMP3), waardoor de expressie werd verlaagd van 185,3 ± 19,6 procent met alleen de cytokine tot 147,1 ± 12,2 procent bij gelijktijdige incubatie met danegaptide (Figuur 5B)

2.7. Danegaptide vermindert TGF 1-opgewekte veranderingen in de expressie van adipokines, chemokinen, groeifactoren en interleukinen van hPTEC's

De ontstekingsreactie in en rond de proximale tubuli omvat zowel de activering van meerdere celtypen als de afscheiding van talrijke ontstekingsmarkers. In het bijzonder rekruteren en activeren oplosbare chemokinen, cytokinen en groeifactoren infiltrerende immuuncellen en stimuleren ze residente fibroblasten. Aanhoudende activering van deze cellen medieert tubulo-interstitiële fibrose. We gebruikten de proteome profiler-array om te bepalen of danegaptide TGF 1-geïnduceerde veranderingen in de expressie en secretie van belangrijke pro-inflammatoire mediatoren tenietdoet. Primaire hotels werden gekweekt, zoals hierboven beschreven, en gedurende 48 uur behandeld met TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM). Een lijst van veranderingen in het lysaat (Figuur 6) en supernatant (Figuur 7) wordt gegeven voor 31 kandidaat-eiwitten gegroepeerd op primaire functie.

3. Discussie

In 2017 bedroeg de wereldwijde incidentie van CKD 697,5 miljoen gevallen, waarbij de aandoening werd geïdentificeerd als de 12e belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd [53]. Tot op heden zijn er geen curatieve therapeutische opties voor eindstadiumnierziekte(ESRD). Bovendien, met lage dialyseoverlevingspercentages en een wereldwijd tekort aannierdonoren, is er een dringende behoefte om therapieën te ontwikkelen die de progressie van CKD kunnen voorkomen en de kwaliteit van leven van de patiënt kunnen verbeteren. Bij CKD bepaalt de ernst van de ontsteking in de proximale tubulus hoe snelnierzal mislukken. Bijgedragen door de activering van meerdere celtypen, lijkt het, gedeeltelijk, connexine-gemedieerde cel-tot-cel communicatie te betrekken [9]. Connexines vergemakkelijken directe en lokale paracriene-gemedieerde celcommunicatie door hun vermogen om te oligomeriseren tot hexamere connexons. Wanneer aangrenzende cellen op één lijn liggen, koppelen connexons om gap junctions te vormen [10]. Deze continue kanalen bieden een directe route voor informatieoverdracht, waardoor cellen zich op een bepaalde frequentie kunnen vergrendelen en activiteit kunnen synchroniseren. In tegenstelling tot gap junctions, die doorgaans opengaan onder fysiologische omstandigheden, hebben ontkoppelde connexons, ook wel hemikanalen genoemd, een lage open waarschijnlijkheid en openen ze als reactie op letsel [10]. Veranderde hemikanaalactiviteit is geassocieerd met de pathofysiologie van meerdere ziektetoestanden, met bewijs dat veranderde cel-tot-cel communicatie koppelt aan verhoogde senescentie [54], ontsteking [34.55.56] en fibrose [18-21]. Gegevens uit ons eigen laboratorium tonen aan dat de overheersende connexine-isovorm in de proximale tubulus (Cx43) wordt opgereguleerd bij gevorderde CKD en correleert met verhoogde niveaus van TGF 1 en de ernst van fibrose en ontsteking [24]. Bovendien vertaalt deze veranderde expressie zich in een verlies van intercellulaire communicatie tussen spleetovergangen, wat gepaard gaat met verhoogde hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte en veranderingen die wijzen op vroege tubulaire beschadiging. Bijgevolg kan het blokkeren van Cx43-gemedieerde hemikanaal-ATP-afgifte een levensvatbaar doelwit zijn voor de behandeling van de schade in een laat stadium die zich ontwikkelt bij personen met CKD.

Danegaptide is een klein therapeutisch peptide dat tot voor kort werd gebruikt in zijn vermogen om gap junction-koppeling te herstellen in meerdere modellen van letsel, waaronder ischemie [43,44] en retinopathie [49]. Van Danegaptide is aangetoond dat het hemikanaalactiviteit en kleurstofopname in C6-glioomcellen blokkeert [43]; een rol voor de verbinding bij het blokkeren van hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte moet echter nog worden bevestigd, en er zijn nog geen studies die de effecten van danegaptide op gewonden hebben geëvalueerdnierbuisjes. In de huidige studie hebben we overtuigend bewijs gepresenteerd dat danegaptide door TGF 1-geïnduceerde hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte in primaire humane proximale tubulusepitheelcellen blokkeert. Bovendien veroorzaakte de verbinding herstelde TGF 1-veranderingen in de expressie en secretie van eiwitten die verband houden met ontsteking en fibrose. Bij CKD ontwikkelt tubulo-interstitiële fibrose zich als reactie op verschillende morfologische en fenotypische veranderingen, waaronder epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT), infiltratie van ontstekingscellen, fibroblastactivering en hermodellering van extracellulaire matrix (ECM [57]. Recent bewijs suggereert dat cellulaire veroudering een sleutelrol kan spelen in de progressie van chronischenierziekte[58], met veroudering gekoppeld aan EMT, een pro-inflammatoir secretoom en extracellulaire matrixafzetting [59-62]. Senescentie duidt op onomkeerbare proliferatieve groeistop met bijbehorende veranderingen in chromatine-organisatie, gentranscriptie en eiwitsecretie [63,64]. Bijgevolg is het bekend dat verouderde cellen verhoogde expressie vertonen van cycline-afhankelijke kinase (CDK) remmers (CKI's), waaronder p21Cip1 (p21) en p16Ink4a (p16), en veranderde expressie van reno-beschermende Klotho [65-68]. In de huidige studie was mRNA-expressie van CDK-remmers p16, p21 en cycline D1 significant verhoogd in met TGF 1-behandelde tubulaire epitheelcellen, terwijl het reno-beschermende anti-verouderingseiwit Klotho verminderde expressie vertoonde in vergelijking met controles. Interessant genoeg werd de expressie van p16, p21 en cycline D1 verbeterd wanneer cellen samen met danegaptide werden geïncubeerd. Het belang van deze waarneming wordt ondersteund door talrijke in vivo onderzoeken [69,70], waaronder recent werk in het p16 INK4a-muismodel met dubbele knock-out. Wanneer ze werden geïnduceerd met UUO om geavanceerde interstitiële ontsteking en fibrose te vertonen, vertoonden deze muizen verminderde apoptose, senescentie, verminderde niveaus van TGF 1 / Smad-signalering en een vermindering van infiltratie van ontstekingscellen in vergelijking met wildtype dieren [70]. Bovendien vertoonden proximale tubuluscellen geïsoleerd uit het UUO-model verhoogde niveaus van p21, waarvan de onderdrukking gepaard gaat met een vermindering van markers die gewoonlijk worden geassocieerd met EMT [71,72]. Een directe link naar celveroudering en inductie van EMT is al vastgesteld [73].

Het verlies van E-cadherine-gemedieerde celadhesie is een initiërende trigger van EMT, met een gelijktijdige toename van N-cadherine (de cadherine-switch), vergezeld van demontage van de aanhechtingsverbinding en acquisitie van eiwitten die gewoonlijk worden geassocieerd met een fibroblastfenotype, bijv. , vimentine en fibroblast-specifiek eiwit [74]. In denier, het is algemeen bekend dat tubulaire verwonding een aantal morfologische en fenotypische veranderingen oproept die kenmerkend zijn voor gedeeltelijke, zo niet volledige, EMT. Onze recente studies hebben aangetoond dat door glucose opgewekte veranderingen in TGF 1 demontage van de aanhangers en het tight junction-complex mediëren door veranderingen in de hechting (ECAD, NCAD, -catenine) en tight junction (ZO-1) eiwitexpressie te reguleren. Bovendien verlaagde in vitro toediening van niet-hydrolyseerbaar ATP de E-cadherine-expressie in proximaleniercellen, waarvan het verlies gepaard ging met een vermindering van de intercellulaire ligatiekrachten, verminderde breukgebeurtenissen en hermodellering van het cytoskelet [51]. Gemedieerd door P2X7R, werden de effecten omgekeerd in het heterogene Cx43 plus /-UUO-model [12]. Voortbouwend op deze bevindingen onderstreept de effectiviteit van danegaptide een beschermende rol voor het blokkeren van hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte bij het voorkomen van veranderde expressie van sleutelepitheel (ECAD, -catenine, ZO-1, claudine 2) en mesenchymaal (NCAD, vimentine) eiwitten, waarvan de implicaties van therapeutisch belang zijn.

CISTANCHE ZAL NIER/NIERENPIJN VERBETEREN

De aanhechtingsverbinding komt samen wanneer de cytoplasmatische staart van E-cadherine bindt aan -catenine, waardoor de hechting aan het cytoskeletnetwerk wordt bemiddeld en ervoor wordt gezorgd dat de celpolariteit en -architectuur behouden blijven [75]. Ondanks zijn rol bij het handhaven van de celpolariteit, zorgt demontage van deze verbindingen voor de afgifte van -catenine in het cytosol, dat wanneer geactiveerd door ofwel Wnt-eiwitten of andere stroomopwaartse regulatoren, bijv. en reguleren celspecifieke effecten. Integrine-gebonden kinase is een intracellulair serine/threonine-eiwitkinase dat een fundamentele rol speelt bij de regulatie van celadhesie, overleving, proliferatie en afzetting van extracellulaire matrix (ECM) [76]. Belangrijk is dat remming van ILK verzwaktnierfibrose in meerdere modellen van CKD [77]. In de huidige studie werden door TGF 1-geïnduceerde verhogingen in ILK1-expressie gedeeltelijk hersteld wanneer cellen samen werden geïncubeerd met danegaptide, een effect dat parallel liep met een afname in -catenine-expressie en ECM-gerelateerde eiwitten. Interessant is dat, hoewel danegaptide de TGF 1-geïnduceerde toename in -catenine-expressie niet significant veranderde, het belangrijk is op te merken dat de afwezigheid van een verandering in expressie niet de afwezigheid van zijn functie in de cel weerspiegelt. De canonieke Wnt-route omvat de nucleaire translocatie van -catenine en activering van doelgenen via een groep transcriptiefactoren die de T-celfactor/lymfoïde versterkende factoren (TCF/LEF) worden genoemd [78]. Normaal gesproken is de Wnt/-catenine-signalering stil, maar deze wordt na een blessure opnieuw geactiveerd in een aantal verschillende modellen van chronischenierziekte[79,80]. Bovendien is afwijkende Wnt/-catenine-signalering sterk geassocieerd met de initiatie van veroudering, een effect dat parallel loopt met het verlies van expressie van Klotho, een anti-verouderingseiwit dat fungeert als een negatieve regulator van de canonieke Wnt-route [81], en in de huidige studie werd gedownreguleerd in met TGF 1-behandelde cellen (Figuur 3). Bijgevolg is aanhoudende activering van Wnt/-catenine-signalering gekoppeld aan de progressie van fibrose in zowel denieren andere weefseltypes [79,82,83]. Eenmaal getransloceerd naar de kern, wordt -catenine geassocieerd met verhoogde expressie van de transcriptiefactor SNAIL en het matrixmetalloproteïnase MMP7. Interessant is dat deze gebeurtenissen geassocieerd zijn met transcriptionele repressie en extracellulaire domeinmembraanafscheiding van E-cadherine, waarvan de laatste een toename ziet in de cytoplasmatische pool van vrij -catenine [84]. Dienovereenkomstig is Wnt-signalering een belangrijke activator van EMT bij letsels [85]. Bovendien is het, met bewijs dat Wnt/-catenine-signalering de expressie van talrijke genen bevordert, waaronder fibronectine, FSP1, Snail1, MMP7 en cycline D1, niet verrassend dat verzwakking van deze signaalcascade gepaard gaat met verbeterdenierfunctie, verminderde EMT [86] en verminderde ontsteking [87] en fibrose [80,88]. Bijgevolg zou het gedeeltelijk de door TGF 1-geïnduceerde verhoogde expressie en uitscheiding van extracellulaire matrixeiwitten (Figuur 5), pro-inflammatoire cytokinen en chemokinen kunnen verklaren die in deze studie werden waargenomen (Figuur 6 en 7). Verhoogde ECM-afzetting en secretie van pro-inflammatoire moleculen zijn kenmerken van tubulo-interstitiële fibrose, met verschillende celtypen, waaronderniertubulaire epitheelcellen waarvan bekend is dat ze een groot aantal factoren afscheiden die gezamenlijk worden gedefinieerd als het CKD-geassocieerde secretoire fenotype (CASP). Gekenmerkt door talrijke moleculen, waaronder interleukinen, extracellulaire matrixeiwitten en chemokinen, vertoont dit CASP opvallende overeenkomsten met het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP), waarbij componenten van het CASP sterk geassocieerd zijn met de pathologie van tubulo-interstitiële fibrose [89]. Wanneer ze worden vrijgegeven, werken deze pro-inflammatoire factoren op een paracriene manier in op naburige gezonde cellen, waardoor de progressie van fibrose bij CKD wordt gestimuleerd. Omdat bekend is dat veel factoren die verband houden met de CASP fibrose in denier(bijv. TGF, interleukine (IL)-1 en interleukine (IL)-6), stroomopwaarts van deze inflammatoire signaleringstussenproducten zou een effectieve alternatieve strategie voor de behandeling van CKD kunnen blijken. Met behulp van een proteoomprofielarray werd het celsupernatant van met TGF 1 ± danegaptide behandelde cellen geïncubeerd op een celmembraan dat vooraf was geabsorbeerd met antilichamen die waren opgewekt tegen belangrijke ontstekingseiwitten. Zoals benadrukt in Figuren 6 en 7, herstelde co-incubatie van cellen met TGF 1 en danegaptide de expressie en secretie van een aantal kandidaat-eiwitten waarvan de rol innierziekteis algemeen bekend als schadelijk (tumornecrosefactor-alfa, interleukine 1-alfa, interferon-gamma) of beschermend (hepatocytgroeifactor). Bovendien rekruteren en activeren oplosbare chemokinen, adhesiemoleculen en groeifactoren bij CKD infiltrerende immuuncellen en residente fibroblasten om ontsteking en fibrose bij de gewonde te mediëren.nier. Onze arraygegevens bevestigen dat het moduleren van Cx43 en het blokkeren van hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte in tubulaire epitheelcellen de secretie van veel ontstekingsmediatoren, waaronder chemokines, monocyt chemo-attractant protein (MCP1) en gereguleerd bij activering, normale T, geheel of gedeeltelijk teniet doet. Cell Expressed and Secreted (RANTES), die beide betrokken zijn bij de rekrutering van monocyten. Verhoogd in zowel menselijk als experimenteelnierziekten, MCP1-secretie wordt veroorzaakt door interleukine-1, tumornecrosefactor-alfa [90] en interferon-gamma [91], die allemaal in ons model werden geïnduceerd door TGF 1, maar geblokkeerd wanneer ze samen met danegaptide werden toegepast. Bovendien werd ook waargenomen dat danegaptide door TGF 1--geïnduceerde secretie van intercellulaire celadhesiemolecule (ICAM1) [92], granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) [93] en epitheel-neutrofiel-activerende peptide voorkomt. (ENA78) [94]. Gezamenlijk zijn deze in verband gebracht met de progressie van CKD en met andere belangrijke pathogene eiwitten, waaronder dipeptidylpeptidase 4 (DPPIV) [95] en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) [96], en zijn geïdentificeerd als potentiële therapeutische doelen. Ondanks deze waarnemingen identificeerde array-analyse een aantal eiwitten na 48 uur, waarbij door TGF 1- geïnduceerde regulatie onafhankelijk bleek te zijn van hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte. Zoals blijkt uit de expressie van het FLT3-ligand in het cellysaat, slaagde danegaptide er niet in om door TGF 1- geïnduceerde veranderingen in expressie van hele cellen significant te veranderen. Het FLT3-ligand wordt aanvankelijk gesynthetiseerd als een membraangebonden eiwit, dat moet worden gesplitst om een ​​oplosbare groeifactor te worden. In met TGF 1-behandelde cellen werd een toename van membraangebonden FLT3L waargenomen in vergelijking met controles in het cellysaat, een respons die niet werd beïnvloed wanneer cellen samen met danegaptide werden geïncubeerd. Hoewel er weinig bekend is over het enzym dat betrokken is bij de proteolytische splitsing en afgifte van FLT3L, blijkt uit een onderzoek van Horiuchi et al. toonde aan dat het afstoten van FLT3L en het vrijkomen van het membraan afhankelijk zijn van metalloprotease en dat dit effect in fibroblasten afhankelijk is van het TNF-converterende enzym (TACE) [97]. Hoewel we alleen maar kunnen speculeren, is het mogelijk dat het blokkeren van door Cx43- gemedieerde ATP-afgifte de activiteit van een of meer eiwitten die nodig zijn voor het afstoten van FLT3-membraan, kan afzwakken en, bij afwezigheid van FLT3L-afgifte, de FLT3L-spiegels in het supernatant zijn significant minder in met TGF 1 plus danegaptide behandelde cellen in vergelijking met met TGF 1-behandelde controles. Interessant is dat, hoewel danegaptide de door TGF 1- geïnduceerde toename van het FLT3L-cellysaat niet leek om te keren, het wel een effect had op de uitgescheiden vorm van het eiwit.

De oplosbare Receptor voor geavanceerde glycatie-eindproducten (RAGE) is een potentiële biomarker van ontsteking en oxidatieve stress [98]. Het werkt als een lokreceptor die voorkomt dat geavanceerde glycatie-eindproducten zich binden aan membraangebonden RAGE en RAGE-gerelateerde nadelige effecten. In de huidige studie zagen we een toename van 70 procent in de secretie van sRAGE met TGF 1, een effect dat door danegaptide weer onder controle werd gebracht. sRAGE is functioneel en kan een effect induceren wanneer het wordt uitgescheiden. Het potentieel van danegaptide om deze afscheiding significant teniet te doen is van duidelijk therapeutisch belang. Interessant is echter dat we na 48 uur geen toename van het RAGE-lysaat met TGF 1 ± danegaptide hebben waargenomen. Hoewel deze experimenten zijn uitgevoerd in menselijke primaire proximale tubuluscellen, kunnen de beperkingen van ons model cel-, tijd- en concentratie-afhankelijke effecten hebben. Hoewel een beter begrip van het werkingsmechanisme van danegaptide nodig is, leveren de bevindingen van deze studie belangrijke eerste bewijzen van de voordelen van het gebruik van danegaptide om door TGF 1-geïnduceerde veranderingen in markers van ontsteking en tubulair letsel teniet te doen via blokkade van hemikanaal-gemedieerde ATP-afgifte. We geven toe dat onze in vitro-gegevens een minimalistisch model bieden van de multifactoriële gebeurtenissen die aanleiding geven tot tubulo-interstitiële fibrose, en bevelen voorzichtigheid aan bij het vertalen van deze nieuwe bevindingen naar de in vivo situatie, vooral wanneer studies over andere soorten en modellen van letsel variabele effecten hebben aangetoond. [41,44,46-49]. Verdere studies zijn nu nodig om de selectiviteit van deze hemikanalen en het vermogen van het medicijn in preklinische modellen van chronische schade te bepalen, voorafgaand aan het testen van de werkzaamheid in klinische proeven bij mensen.

4. Materialen en methoden

4.1. Materialen

klonale mensnier2 (HK2) epitheelcellen en primaire humane proximale tubulus-epitheelcellen (hPTEC's) werden gekocht bij de American Type Culture Collection (ATCC) (LGC Standards). Weefselkweekbenodigdheden werden gekocht bij Invitrogen (Paisley, VK). Het Immobilon-FL PVDF-membraan was van Millipore (Watford, VK) en Odyssey-blokkerende buffer en secundaire FL-fluorescerende antilichamen werden gekocht bij LI-COR (Cambridge, VK). Antilichamen voor E-cadherine, N-cadherine, ILK1, MMP-3, -catenine, vimentine en ZO-1 werden verkregen van Cell Signaling Technologies (Hertfordshire, VK), terwijl claudine-2, laminine-, collageen I- en collageen IV-antilichamen werden verkregen van ABCAM (Cambridge, VK). Fibronectine-antilichaam werd gekocht bij Santa Cruz (Santa Cruz, CA, VS). Recombinant hTGF1 werd verkregen van Sigma (Poole, VK), evenals alle andere algemene chemicaliën. Danegaptide werd geleverd door Zealand Pharmaceuticals. ATP-biosensoren waren van Sarissa Biomedical Ltd. (Coventry, VK) en meelgerechten van WPI (Hertfordshire, VK). De filters van Transwell werden gekocht bij Corning (Nottinghamshire, VK). De Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit was van R&D Systems (Oxfordshire, VK).

4.2. Weefselkweek

Primaire humane proximale tubulusepitheelcellen (hPTEC's) werden in eennierepitheelcel basaal medium van de ATCC, aangevuld met 0,5 procent foetaal kalfsserum (FCS wt/vol, triiodothyronine (10 nM), rhEGF (10 ng/mL), hydrocortison hemisuccinaat (100 ng/mL), rhInsuline (5 µg/ml), epinefrine (1 µM), transferrine (5 µg/ml) en L-alanyl-glutamine (2,4 mM), in een vochtige atmosfeer bij 37 °C met 5 procent CO2. uithongering van het serum voorafgaand aan de behandelingnier2 (HK2) cellen (passages 18-30) werden gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Hams F12 medium, aangevuld met 10 procent FCS wt/vol, glutamine (2 mmol/L) en epitheliale groeifactor (EGF) ( 5 ng/mL), in een bevochtigde atmosfeer bij 37 ◦C met 5 procent CO2. HK2-cellen werden onsterfelijk gemaakt door de transductie van humaan papillomavirus 16 (HPV-16) E6/E7-genen en waren mycoplasma-vrij. In alle experimenten werden cellen gedurende 48 uur gezaaid in laag-glucose DMEM/F12 (5 mmol/L) en vervolgens een nacht uitgehongerd in serum voorafgaand aan de behandeling.

4.3. MTT-assay De 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-assay werd uitgevoerd, zoals eerder beschreven, om de cytotoxische effecten van danegaptide op celproliferatie [99]. HK2-cellen werden gezaaid in 96- putjesplaten en 48 uur gekweekt in laag-glucose DMEM/F12 (5 mM), voorafgaand aan serumuithongering gedurende de nacht, en vervolgens gedurende 48 uur gestimuleerd met TGF 1 (10 ng/ml ) ± danegaptide (50-1000 nM). Colorimetrische meting van formazanproductie kwam overeen met het aantal levensvatbare cellen.

4.4. Lactaatdehydrogenase-assayDe afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH) in media als gevolg van plasmamembraanbeschadiging wordt vaak gebruikt om celdood of cytotoxiciteit te evalueren. HK2-cellen werden gezaaid in 96-putjesplaten en 48 uur gekweekt in laag-glucose DMEM/F12 (5 mM) voorafgaand aan serumverhongering gedurende de nacht. Cellen werden vervolgens gedurende 48 uur gestimuleerd met TGF 1 (10 ng / ml) ± danegaptide (50-1000 nM). De LDH-cytotoxiciteitstestkit II (Abcam) werd gebruikt om LDH te kwantificeren volgens de instructies van de fabrikant.

4.5. Kristalviolet-assayDeze eenvoudige test wordt gebruikt voor het meten van de relatieve dichtheid van gehechte cellen aan schalen met meerdere putjes. Kristalviolet kleurt DNA en kan colorimetrisch worden gekwantificeerd na solubilisatie. HK2-cellen werden uitgezaaid in 12-putjesplaten en 48 uur gekweekt in laag-glucose DMEM/F12 (5 mM), voorafgaand aan serumuithongering gedurende de nacht, en vervolgens gedurende 48 uur gestimuleerd met TGF 1 (1{{16 }} ng/ml) ± danegaptide (50-1000 nM). De test is eerder beschreven [99]. In het kort werden cellen gefixeerd met behulp van paraformaldehyde gedurende 10 minuten, gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en gedurende 10 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur (RT) in een 0,1 procent kristalviolette oplossing. Na nog een aantal wasbeurten werd de vlek opgelost met 1 procent SDS en werd de absorptie gemeten met een plaatlezer.

4.6. Western-blottingBereiding van cytosolisch eiwit uit HK2-cellen en hPTEC's, hun scheiding door SDS-gelelektroforese en overdracht op Immobilon-FL PVDF-membranen zijn eerder beschreven [12]. Membranen werden geblokkeerd met behulp van Odyssey-blokkerende buffer (LI-COR) en vervolgens 's nachts onderzocht met antilichamen tegen E-cadherine (1:1000), N-cadherine (1:1000), claudine-2 (1:500), ZO -1 (1:1000), collageen I (1:1000), collageen IV (1:2000), fibronectine (1:2000), laminine (1:500), ILK1 (1:500), -catenine (1:2000), vimentin (1:500) en MMP3 (1:500). Banden werden gevisualiseerd met OdysseyFC en semi-gekwantificeerd met ImageStudio (v5.2, LI-COR, Lincoln, NE, VS).

4.7. Transepitheliale weerstandHK2-cellen werden gezaaid (6 × 104cellen/ml) op Transwell-filters (12 mm diameter, poriegrootte 0,4 µM; Corning, NY, VS) en gekweekt in laag-glucose DMEM/F12 (5 mM) voor 48 uur, serum-uitgehongerd 's nachts en vervolgens gestimuleerd met TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) gedurende 48 uur. Transepitheliale elektrische weerstand (TER) werd gemeten met behulp van het EVOM-apparaat (World Precision Instruments, Sarasota, FL, VS). Een blanco weerstand gemeten uit een putje met alleen medium werd afgetrokken van elke weerstandswaarde.

4.8. KleurstofopnamestudiesHK2-cellen en hPTEC's werden gezaaid op fluorodishes (22 mm diameter) en 48 uur gekweekt in laag-glucose DMEM/F12 (5 mmol/L). Na nachtelijke serumuithongering werden de cellen 48 uur geïncubeerd met TGF 1 (10 ng / ml) ± danegaptide (50-100 nM. Voor volgende stappen, een uitgebalanceerde zoutoplossing (BSS, pH 7,0) bestaande uit NaCl (137 mM), KCl (5,4 mM), MgSO4 (0,8 mM), Na2HPO4 (0,3 mM), KH2PO4 (0,4 mM), NaHCO3 (4,2 mM ), HEPES (10 mM) en glucose (5 mM) werden gebruikt. Om kleurstofopname te induceren, werden cellen gedurende 10 minuten blootgesteld aan Ca2 plus-vrij BSS (nul CaCl2 plus EGTA (1 mM)) plus carboxyflfluoresceïne (200 µM), gevolgd door een periode van 5 min in Ca2 plus-bevattend BSS (1,3 mM) plus carboxyflfluoresceïne (200 µM). De borden werden vervolgens gewassen met Ca2plus-bevattend BSS (12 ml). Beelden werden verkregen met een Cool Snap HQ CCD-camera (Roper Scientific, Gottingen, Duitsland) en Metamorph-software (Universal Imaging Corp., Marlow, Bucks, VK). ImageJ werd gebruikt om de kleurstofopname te kwantificeren, waarbij een interessegebied (ROI) rond elke cel werd getekend (ongeveer 10-15 cellen / schaal) en de gemiddelde pixelintensiteit werd gemeten. Van elke ROI werd een achtergrondfluorescentiewaarde afgetrokken.

CISTANCHE ZAL DE NIER/NIERDIALYSE VERBETEREN

4.9. ATP-biodetectieATP-biosensoren (Sarissa Biomedical, Coventry, VK) werden gebruikt in een gelijktijdige dual-recording amperometrische opstelling, zoals eerder beschreven [12]. Een nul-biosensor werd gebruikt om rekening te houden met niet-specifieke elektro-actieve artefacten en afgetrokken van het ATP-spoor. Glycerol (2 mM) werd in alle opnameoplossingen opgenomen om ATP-detectie mogelijk te maken. HK2-cellen werden gezaaid op glazen dekglaasjes (10 mm diameter) in laag-glucose DMEM/F12 (5 mmol/L) gedurende 48 uur voorafgaand aan serumverhongering gedurende de nacht. De cellen werden vervolgens 48 uur geïncubeerd met TGF 1 (10 ng/ml) ± danegaptide (100 nM). De dekglaasjes werden overgebracht naar een kamer die Ca2 plus-bevattende BSS bevat, geperfuseerd met 6 ml / min (37 C) en 10 minuten gelaten om te acclimatiseren. ATP en nul-biosensoren werden gebogen en neergelaten zodat de elektrode evenwijdig aan de cellulaire monolaag lag. Zodra een stabiele basislijn optrad, stimuleerde perfusie van Ca2 plus-vrij BSS de opening van het hemikanaal. Na ATP-afgifte werd Ca2plus-bevattend BSS gebruikt om hemikanalen te sluiten, gevolgd door een kalibratieoplossing van ATP (10 mM). Opnames werden verkregen bij 4 Hz met een Micro CED (Mark2)-interface met behulp van Spike (v8.03)-software.

4.10. Ontsteking Antilichaam Array,Een array van ontstekingsantilichamen (RnD Systems) beoordeelde door TGF 1-geïnduceerde regulatie van 31 ontstekingsmarkers. De array werd uitgevoerd door de instructies van de fabrikant te volgen. In het kort werden hPTEC's 48 uur gekweekt in DMEM/F12 (5 mM) met een laag glucosegehalte, voorafgaand aan serumverhongering gedurende de nacht, en vervolgens gedurende 48 uur gestimuleerd met TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM). De cellysaten en supernatant werden verzameld en overnacht geïncubeerd met vooraf geblokkeerde membranen die in duplo waren gespot met invangantilichamen. Een 800 CW FL fluorescerend streptavidine / gebiotinyleerd cocktailmengsel werd gebruikt om expressie-eiwit / antilichaamcomplexen te visualiseren met behulp van Odyssey FC en semi-gekwantificeerd met behulp van ImageStudio (v5.2, LI-COR).

4.11. Kwantitatieve realtime PCRRNA werd geëxtraheerd met behulp van een RNeasy-minikit (QIAGEN) en omgekeerd getranscribeerd (Invitrogen). Realtime PCR (SYBR GreenER, Invitrogen) werd uitgevoerd met behulp van een StepOne Plus-instrument (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, VS). cDNA-expressie werd verkregen door vergelijking met een standaardcurve van serieel verdund cDNA. De volgende primers zijn gebruikt: p16 (vooruit: CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA, achteruit: GGTCG GCGCAGTTGGGCTCC), p21 (vooruit: AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG, achteruit: TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG), cycline D1 (vooruit: TCTACACCGACATCAGTACTCCGCCAGTCAGTACTCCG) en GAPDH (vooruit: GTCTC CTCTGACTTCAACAGCG, achteruit: ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA). Smeltcurve-analyse bevestigde de specificiteit van de primer en controleerde op mogelijke contaminatie.

4.12. AnalyseVoor alle experimenten werd de controle met een laag glucosegehalte (5 mM) genormaliseerd tot 100 procent en alle andere omstandigheden werden vergeleken met hun respectievelijke controles. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een eenrichtings-ANOVA-test met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM, waarbij n het monsternummer aangeeft. Een p-waarde van minder dan of gelijk aan 0,05 betekende statistische significantie.