De Novo transcriptoomassemblage en genontdekking van Cistanche Deserticola vlezige stengel-Ⅱ

Functionele classificatie van alle uitgedrukte transcripties op basis van genontologie en KEGG-databases

Gene Ontology (GO) -annotatie werd verkregen uit het UniProt-annotatie- en identiteitsassociatiebestand. In totaal werden 20.907 transcripten, goed voor 32,69% van de totale tot expressie gebrachte sequenties, toegewezen aan 1.745 functionele termen. Van de totale functionele GO-termen vormden toewijzingen aan het biologische proces de meerderheid (1.116, 63,95%), gevolgd door de cellulaire component (329, 18,85%) en de moleculaire functie (300, 17,20%). De toegewezen functies van tot expressie gebrachte transcripties besloegen een breed scala aan GO-categorieën, en de top 10 GO-termen met de meest geannoteerde transcripties zijn weergegeven in Tabel 3. We bieden de distributie van alle tot expressie gebrachte transcripties in drie categorieën van genontologie (moleculaire functie, cellulaire component en biologisch proces) in het aanvullende bestand (S3 Dataset). GO-termen gerelateerd aan bindingsfuncties en transferase-activiteit waren voornamelijk vertegenwoordigd in de categorie moleculaire functie. Wat betreft de bindingsfuncties vertegenwoordigde kationbinding (4.394 transcripten) het meest voorkomende, gevolgd door nucleotide/nucleosidebinding (gemiddeld 3.404 transcripten) en eiwitbinding (2.422 transcripten). Terwijl ze tot de transferase-activiteitsgroep behoren, zijn het de meeste degenen met overdragende fosforbevattende groepen (2.256 transcripten, 65,77%). Onder de categorie cellulaire componenten bevonden transcripten zich meer intracellulair (gemiddeld 10.581 transcripten), terwijl onder de categorie biologische processen transcripten meer betrokken waren bij het metabolische proces van biopolymeren (gemiddeld 6.683 transcripten), gevolgd door regulering van cellulaire processen (4.841 transcripten). ), genexpressie (4.678 transcripten) en transport (3.512 transcripten).

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VOORKOMEN VAN DE ZIEKTE VAN ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Om genen te ontginnen die betrokken zijn bij de biosynthese van lignine en PhG, werden 21.358 niet-redundante potentiële eiwitsequenties doorzocht tegen gensequenties van 13 plantenorganismen in de KEGG-database, en ze werden toegewezen aan 275 KEGG-routes met ten minste 5 hits. De top 10 routes met de meest uitgelijnde sequenties zijn weergegeven in Tabel 4. De meeste routes waren betrokken bij primaire metabolische processen, zoals het aminozuur- of eiwitmetabolisme (ko01230, ko04141 en ko04120), het koolhydraatmetabolisme (ko01200 en ko00500) en het nucleotide- of nucleotidemetabolisme. nucleosidemetabolisme (ko03018, ko00230 en ko00240). Daarnaast zijn er 27 secundaire metabolisme-gerelateerde routes (Fig. 2), zoals de biosynthese van de terpenoïde ruggengraat, de biosynthese van fenylpropanoïden, de biosynthese van carotenoïden, de biosynthese van isochinoline-alkaloïden en de biosynthese van tropaan-, piperidine- en pyridine-alkaloïden. Deze resultaten vormen een verdere indicatie dat er actieve metabolische processen gaande waren in deC. deserticolastam weefsel. Alle tot expressie gebrachte transcripten die verband houden met KEGG-routes werden vermeld in het aanvullende bestand (S4-gegevensset). Hoewel er enkele significant veranderde routes zijn tussen C. deserticola en andere planten, zoals rijst (S5 Dataset), is ons belangrijkste doel in deze studie om het volledige transcriptoomprofiel van de C. deserticola-stam te onthullen en de gerelateerde routes van PhGs-biosynthese in beeld te brengen. wat nuttig zou kunnen zijn voor het begeleiden van de teelt.

Kandidaatgenen die coderen voor enzymen die betrokken zijn bij de biosynthese van lignine

Lignine is het op een na meest voorkomende natuurlijke terrestrische polymeer in het plantenrijk en vormt tot een derde van het materiaal dat in de celwanden van planten wordt aangetroffen. Als belangrijk onderdeel van celwanden helpen ligninen het watertransport, zorgen ze voor mechanische ondersteuning en structurele integriteit, en verdedigen ze zich tegen ziekteverwekkers en herbivoren. Deze rollen van lignine zijn zeer waardevol bij het ondersteunen van de ondergrondse erectieve groei van C. deserticola in de woestijn. In deze studie presenteerden we het volledige beeld van de biosyntheseroutes van lignine in C. deserticola (Fig. 3), waarin de ligninemonomeren worden gebiosynthetiseerd uit fenylalanine via een reeks enzymatische reacties, waaronder hydroxylatie, methylatie, reductie en oxidatief polymerisatieproces. Aan ligninebiosynthese gerelateerde enzymen werden gedetecteerd voor drie voornamelijk gesynthetiseerde vormen in vaatweefsel (p-hydroxyl-fenyl (H), guaiacyl (G) en syringyl (S) lignine) en 5-hydroxyl-guaiacyl lignine, die alleen werd geïdentificeerd in COMT (cafeïnezuur 3-O-methyltransferase, EC 2.1.1.68)-deficiënte (zoals knock-down) planten.

Fenylalanine-ammoniak-lyase (PAL, EC 4.3.1.24) is het eerste sleutelenzym in de biosyntheseroute van lignine (Fig. 3) dat fenylalanine omzet in kaneelzuur door niet-oxidatieve deaminatie. In totaal werd de sequentie van 6.297 PAL-lezingen bepaald en werden 7 PAL-transcripten verzameld in C. deserticola (Tabel 5). Door vergelijking van sequentieovereenkomsten ontdekten we dat vier ervan (comp28550_c1_seq1/2/3/5) meer dan 95% gelijkenis vertoonden met de bekende mRNA-sequentie van C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), terwijl comp28550_c1_seq4 en comp25940_c0_seq1 respectievelijk 77% en 82% overeenkomsten vertoonden. ORF-voorspelling onthulde dat 5 transcripten potentie hadden voor coderende eiwitten en werden gedragen door het aromatische aminozuurlyasedomein (PF00221.14). Onder hen zou alleen het comp28550_c1_seq4-transcript kunnen coderen voor een volledige eiwitsequentie van 718 aminozuurresiduen. Er is gerapporteerd dat PAL werd gecodeerd door een kleine multigenenfamilie in de meeste plantensoorten, zoals 4 in Arabidopsis thaliana, 5 in Populus trichocarpa, 3 in Scutellaria baicalensis en 7 Cucumis sativus, enz. Onze fylogenetische analyse suggereerde dat er 4 waren. PAL-coderende genen in C.

deserticola en we noemden ze respectievelijk CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 en CdPAL4 (S2 Fig). 4-coumaraat-CoA-ligase (4CL, EC 6.2.1.12) en trans-cinnamaat 4-mono-oxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) zijn twee enzymen die verantwoordelijk zijn voor de transformatie van kaneelzuur naar dicoumarol-CoA in twee omgekeerde richtingen bestellingen. Ze bevinden zich ook in backbones en hun expressie-FPKM-waarden zijn respectievelijk 39,57 en 51,93.

De vier soorten ligninen werden gebiosynthetiseerd via verschillende routes die werden gecontroleerd door drie sleutelenzymen: cinnamoyl-CoA-reductase (CCR, EC 1.2.1.44), shikimaat-o-hydroxycinnamoyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133) en ferulaat{{1{ {56}}}}hydroxylase (F5H, EC 1.14.-.-). CCR werd gerapporteerd als een controlepunt van de lignineroute [50, 51] die X-CoA (X inclusief dicoumarol, caffeoyl, feruloyl, 5-hydroxyl-feruloyl en sinapoyl) katalyseerde tot Y-aldehyde (Y inclusief p -cougar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxylconiferyl en snap), terwijl HCT p-coumaroyl-CoA katalyseerde tot p-coumaroylshikiminezuur/p-coumaroylkininezuur. De twee enzymen regelden, net als een schakelaar, de biosynthese van P-hydroxyl-fenylligninen of de andere drie soorten ligninen. F5H was een andere vertakkingsschakelaar die syringyllignine en 5-hydroxyl-guaiacyllignine reguleerde. Andere belangrijke enzymen, waaronder cafeïnezuur 3-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) en cinnamylalcoholdehydrogenase (CAD, EC 1.1.1.195) ) werden ook tot expressie gebracht. Gedetailleerde informatie over de expressie is weergegeven in Tabel 6. Deze enzymgenen die in dit onderzoek zijn geïdentificeerd, zullen een waardevolle hulpbron vormen voor functionele genomische studies in deze belangrijke medicinale plant. 10 genen gerelateerd aan de biosyntheseroute van ligninen in Tabel 6 werden geselecteerd voor RT-qPCR-verificatie om onze RNAseq-resultaten te bevestigen (Fig. 4), en hun hoge correlaties (Pearson-correlatiecoëfficiënt: 0,90343) duidden op een hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van onze transcriptoomanalyse. S1 Dataset geeft een overzicht van de primersequenties die in deze analyse zijn gebruikt.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kandidaatgenen die coderen voor enzymen die betrokken zijn bij de biosynthese van PhG's

Het is bekend dat fenylethanoïdeglycosiden (PhG's) de belangrijkste actieve ingrediënten zijn in C. deserticola met activiteiten op het gebied van het verbeteren van de seksuele potentie, het wegvangen van vrije radicalen en het tegengaan van veroudering. Drie chemische componenten van PhG's zijn organisch zuur, saccharide en fenylethanolaglycon (figuur 3). De organische zuren, waaronder cafeïnezuur, ferulinezuur en cumalinezuur, zijn producten van de biosyntheseroute van fenylpropanoïden. De componenten van saccharide, waaronder glucose en rhamnose, zijn producten van koolhydraatmetabolismeroutes, zoals het metabolisme van zetmeel en sucrose, het metabolisme van aminosuiker en nucleotidesuiker, het metabolisme van fructose en mannose, enz. De biosyntheseroute van het fenylethanolgedeelte is echter nog niet duidelijk. Hier hebben we twee mogelijke routes voor de biosynthese van fenylethanol voorgesteld op basis van onze sequentiegegevens. Eén daarvan is de gerapporteerde cafeïnezuur- of ferulinezuurroute, ook bekend als de kaneelzuurroute, die vergelijkbaar is met de hoofdketen van de ligninebiosynthese. Een andere is gebaseerd op de metabolismeroute van fenylalanine (figuur 3), waarbij de fenylalanine naar fenylethanol werd bereikt via een bekende 'Enrlich-route' die een eeuw geleden voor het eerst werd gevonden in gist en gevalideerd in petuniabloemen, tomaat en roos. Vier enzymgenen die coderen voor aspartaat/tyrosineaminotransferase, histidinefosfaataminotransferase en primair amineoxidase, die verantwoordelijk zijn voor de omzetting van fenylalanine in fenylethanol, werden tot expressie gebracht in de stam van C. deserticola. Het product van fenylethanol kan verder worden geoxideerd door mono-oxygenase of gemethyleerd door methyltransferase tot zijn derivaten (fenylethanolaglycon) die deelnemen aan de PhG-biosynthese. Samenvattend werden twee vermeende biosyntheseroutes van fenylethanolaglycon voorgesteldC. deserticolamaar er is nog meer studie nodig.

Discussies

De afgelopen jaren heeft de plantengenomica zich snel ontwikkeld met de toepassing van de volgende generatie sequencingtechnologie, terwijl er maar weinig onderzoeken zijn gericht op de genomica van geneeskrachtige planten in de woestijn. Het is dringend noodzakelijk om genomisch of transcriptomisch onderzoek uit te voeren om de aanpassing ervan aan droogte- en zoutrijke omgevingen en de biosyntheseroute van de belangrijkste bioactieve componenten te begrijpen. De de novo transcriptoom-ontdekking voor sommige medische planten,

zoals Panax ginseng, Ginkgo biloba en Glycyrrhiza uralensis zijn voor het eerst geëxploiteerd met behulp van het Roche 454-platform vanwege de lange leeslengte. Vanwege het effectieve assemblagevermogen met korte leesbewerkingen, vooral de bevoordeelde leesbewerkingen met gepaarde uiteinden, zijn op Illumina gebaseerde transcriptoomsequencing en -assemblage ook uitgebreid gebruikt voor model- en niet-modelorganismen. In de huidige studie hebben we ongeveer 8G van 101 bp paired-end-reads gegenereerd en langere unigene-sequenties geproduceerd met een gemiddelde lengte van 725 bp. Grootschalige stamspecifieke transcriptoomgegevens zouden nuttige referentiegegevens kunnen opleveren en kunnen worden gebruikt om het secundaire metabolisme van bioactieve componenten van C. deserticola te ontginnen. Er is 81,62% van de totale onbewerkte leesbewerkingen die strenge kwaliteitsfilters hebben doorstaan ​​(inclusief het bijsnijden van adapters en het weggooien van leesbewerkingen van lage kwaliteit) vóór de montage, wat de hoge kwaliteit van onze sequentiegegevens suggereert, en 82,08% van de hoogwaardige leesbewerkingen was nuttig voor de montage. Andere waarden die niet voor de assemblage zijn gebruikt, kunnen het gevolg zijn van sequentiefouten, assemblageparameters et al. Deze ongebruikte leesbewerkingen van hoge kwaliteit bleven nuttig bij het verbeteren van de novo-assemblage in combinatie met langere leesbewerkingen vanaf een ander platform (zoals Roche 454) in de toekomst.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Een groot aantal verzamelde transcripten (30.098) vertoonden hoge sequentie-overeenkomsten met bekende genen in openbare databases, wat suggereert dat onze op Illumina gebaseerde paired-end-gegevens een substantieel deel van de transcripten van C. deserticola besloegen. Transcripten zonder BLAST-treffers kunnen het gevolg zijn van 3'- of 5'-niet-getranslateerde gebieden, niet-coderend RNA of nieuwe gensequenties van C. deserticola. De tot expressie gebrachte transcripten werden geannoteerd in een breed scala aan GO-categorieën en KEGG-routes (tabellen 3 en 4), waarin veel transcripten werden toegewezen aan secundaire metabolismegerelateerde routes. Zoals we weten kan fenylpropanoïde functioneren als een induceerbare antimicrobiële verbinding met grote voordelen voor een ondergrondse levensstijl [1], en naast zijn medicinale nut ook fungeren als een signaalmolecuul in plant-microbe-interacties [68, 69]. Terpenoïde wordt gebruikt voor de biosynthese van bioactieve componenten (zoals 6- deoxycatalpol) [70]. We ontdekten dat genen die betrokken zijn bij de biosyntheseroute van fenylpropanoïden en terpenoïden zeer overvloedig aanwezig waren in C. deserticola. Belangrijker nog is dat de ontdekking van goed vertegenwoordigde routes van ligninebiosynthese (Fig. 3) het actieve metabolische proces van lignine in de C. deserticola-stam aantoonde. Alle bekende enzymgenen die betrokken zijn bij de biosynthese van lignine (Fig. 3) werden tot expressie gebracht, en vier belangrijke enzymen, waaronder PAL, CCR, HCT en F5H, hadden een lagere expressie-abundantie (respectievelijk FPKM 26,47, 3,89, 3,4 en 3,83) vergeleken met andere enzymgenen (Tabel 6). Of de expressieverandering van deze drie genen al dan niet de lignineproductie in C. deserticola zou kunnen beïnvloeden, is verder onderzoek waard. PAL is een sleutelenzym in de biosynthese van lignine en is ook betrokken bij de biosynthese van fenylpropanoïde, resveratrol, flavonoïde en coumarine [71-74]. We hebben vier verschillende PAL-genen gedetecteerd in het C. deserticola-genoom (S2 Fig), wat samenviel met het feit dat PAL werd gecodeerd door een kleine multigenfamilie [39, 43, 45-49] en bewezen verder dat het een belangrijke rol kan spelen in de metabolische koolstofflux. .

PhG is het belangrijkste actieve ingrediënt in C. deserticola. Genen die betrokken zijn bij de biosynthese van fenylethanol zijn belangrijk voor de kwaliteit van C. deserticola. We hebben twee verschillende biosyntheseroutes van fenylethanol en 17 enzymgenen afgeleid die betrokken zijn bij PhG-biosynthese in de C. deserticola-stam. De mogelijke post-cafeïne/ferulazuurprocessen (Fig. 3) werden voor het eerst ook afgeleid op basis van een structuurformule van tussenproducten en katalytische eigenschappen van overeenkomstige enzymen, waarbij het caffeïne/ferulazuur eerst zou worden geoxideerd tot een fenylpyruvaatderivaat; vervolgens werd de carboxylgroep beroofd door decarboxylasen; tenslotte werd de aldehydegroep door dehydrogenase weer omgezet in een alcoholgroep. Dit is de eerste toepassing van Illumina paired-end sequencing-technologie om het hele transcriptoom van C. deserticola te onderzoeken en RNA-seq-reads samen te stellen zonder een referentiegenoom. Deze studie zal in de toekomst nuttige bronnen en gensequenties opleveren voor functioneel genomica- en proteomics-onderzoek naar C. deserticola.

Conclusies

In deze studie hebben we het transcriptoom van de C. deserticola-stam geprofileerd op basis van high-throughput sequencing-gegevens, genen geïdentificeerd die betrokken zijn bij de biosyntheseroutes van lignine, en ook voor het eerst de potentiële biosyntheseroute van PhGs afgeleid, wat zeker het begrip zal versnellen. van de dubbelzinnige fysiologische processen en de grote medicinale waarde op moleculair niveau. Tot nu toe is dit de eerste poging om het volledige transcriptoom van de C. deserticola-stam de novo samen te stellen en de biosyntheseroute van medicinale componenten te detecteren met behulp van op Illumina gebaseerde sequencing-datasets. Onze studie kan de ontwikkeling van natuurlijke medicijnen en de selectie van cultivars met geneeskrachtige eigenschappen bevorderen.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%