Blootstelling aan dieseluitlaatgassen verandert de expressie van netwerken die betrokken zijn bij neurodegeneratie in zebravishersenen Deel 2

Voorbereiding van eiwitmonsters

Om eiwitmonsters te bereiden werden de koppen van 80 tot 100 verdoofde larven (5 pdf) zorgvuldig geïsoleerd en gewassen met PBS voordat ze werden overgebracht naar een lysisbuffer die bestond uit 15% voorgekoelde TCA/aceton met daarin 0,07% beta-mercaptoethanol (ME )en proteaseremmercocktail (fabrikant nodig) in een totaal volume van 500 ul.

De afgelopen jaren is er veel belangstelling geweest voor de effecten van eiwitmonsters op het geheugen. Steeds meer mensen beginnen het belang van voeding voor de gezondheid te beseffen, vooral de belangrijke rol van eiwitten in het menselijk lichaam.

Eiwitten zijn de basisbouwstoffen van het menselijk lichaam en spelen een belangrijke rol in het menselijk lichaam. Hierdoor zijn eiwitmonsters voor veel mensen een belangrijk kanaal geworden in hun streven naar gezondheid en schoonheid. Naast het opbouwen van spieren en het vormgeven van het lichaam, kunnen eiwitmonsters ook het geheugen van een persoon verbeteren.

Sommige wetenschappers hebben de relatie tussen eiwitten en geheugen bestudeerd. Ze ontdekten dat langdurige inname van voldoende eiwitten gunstig is voor alle aspecten van de lichamelijke gezondheid, vooral het geheugen. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat de inname van eiwit via de voeding een belangrijke invloed heeft op de hersenfunctie en het geheugen.

Eiwit is een belangrijk onderdeel van neuronen in het menselijk brein, dus de dagelijkse eiwitinname heeft een belangrijke invloed op het geheugen en het denkvermogen van mensen. Langdurige eiwitinname voldoet niet alleen aan de eiwitbehoeften van het lichaam, maar helpt ook de hersenen actief en gezond te blijven.

Bovendien kunnen eiwitten het lichaam ook helpen de bloedsuikerspiegel in evenwicht te houden en een stabiel humeur te behouden. Dit is erg belangrijk voor het behoud van het geheugen en het denkvermogen. Daarom kan een matige inname van eiwitten verschillende cognitieve functies en emotionele toestanden van het menselijk lichaam helpen verbeteren.

Over het algemeen is er een sterke relatie tussen eiwitmonsters en geheugen. Het verhogen van uw eiwitinname helpt uw ​​hersenen en lichaam gezond te houden, waardoor het denkvermogen en het geheugen worden verbeterd. Voor mensen die hun geheugen moeten verbeteren, is het zeer noodzakelijk om een ​​passende hoeveelheid eiwitten te consumeren. We moeten op de juiste manier eiwitrijk voedsel eten en aandacht besteden aan redelijke maaltijden om een ​​gezond lichaam en een scherpe geest te behouden. Het is duidelijk dat we het geheugen moeten verbeteren, en Cistanche deserticola kan het geheugen aanzienlijk verbeteren, omdat Cistanche deserticola antioxiderende, ontstekingsremmende en anti-verouderingseffecten heeft, die kunnen helpen de oxidatie- en ontstekingsreacties in de hersenen te verminderen, waardoor de hersenen worden beschermd. gezondheid van het zenuwstelsel. Bovendien kan Cistanche deserticola ook de groei en het herstel van zenuwcellen bevorderen, waardoor de connectiviteit en functie van neurale netwerken wordt verbeterd. Deze effecten kunnen het geheugen, het leervermogen en de denksnelheid helpen verbeteren en kunnen ook de ontwikkeling van cognitieve stoornissen en neurodegeneratieve ziekten voorkomen.

Klik op supplementen kennen om het geheugen te vergroten

Na korte homogenisatie werden de eiwitten gedurende 12 uur bij 20 graden geprecipiteerd, gevolgd door centrifugatie bij 12,000 rpm gedurende 5 minuten bij 4 graden. Het supernatant werd verwijderd en de eiwitpellet werd tweemaal gewassen met koude aceton (die 0.07% ME en proteaseremmercocktails bevatte). De uiteindelijke eiwitpellet werd opgelost in een lysisbuffer die 7,0 M ureum bevatte, en 2,0 M thioureum door sonicatie op ijs.

De oplosbaar gemaakte eiwitmonsters werden gedurende 10 minuten bij 4 graden bij 15,000 rpm gecentrifugeerd om onoplosbare deeltjes neer te slaan, en de concentratie van de uiteindelijke eiwitmonsters werd gemeten met behulp van de Bradford-methode.

Op TMT gebaseerde proteomics-analyse met hoge doorvoer

Monsters werden verkleind, gealkyleerd en gedigereerd door de opeenvolgende toevoeging van trypsine en lys-C-proteasen. Peptiden werden vervolgens gelabeld met behulp van 10-plexTMT isobare tags volgens de instructies van de fabrikant. Gelabelde monsters werden gemengd en vervolgens fijn gefractioneerd met behulp van omgekeerde-fasechromatografie bij hoge pH.

Individuele fracties werden vervolgens geanalyseerd met LC-MS/MS met behulp van online omgekeerde fasechromatografie en tandemmassaspectrometrie op een Thermofsher Fusion Lumos-massaspectrometer. Gegevens werden verkregen met behulp van de op synchrone precursorselectie gebaseerde MS3-methode, zoals eerder beschreven (McAlister et al. 2014). Het zoeken in databases en het extraheren van TMT-reporterioninformatie werden uitgevoerd met behulp van het MaxQuant-softwareplatform (Cox en Mann 2008).

De vergelijking van TMT-gegevens tussen monsters werd uitgevoerd met behulp van MSStats (Choiet al. 2014). Transcriptomische analyse Ongeveer 80-100 hoofden werden geïsoleerd uit verdoofde embryo's (120 uur), gewassen met PBS en onderworpen aan totale RNA-extractie met behulp van Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis , VS) reagens volgens de instructies van de fabrikant.

De kwaliteit en kwantiteit van RNA werden geëvalueerd met behulp van een NanoDrop2000 spectrofotometer (Thermo Scientific, MA) en verder door Agilent 2100 Bioanalyzer om de minimale concentratie van 50 ng/ul en RNA-integriteitsgetal (RIN) van 8 te garanderen. Het voorbereiden van de bibliotheek werd vervolgens uitgevoerd met behulp van een Illumina HiSeq4000 volgens het protocol: "TruSeqStranded Total RNA Library Prep workflow met Ribo-Zero Gold", en de monsters werden gesequenced onder de volgende omstandigheden: "Gepaarde eindrun, R1=75 cycli (antisense streng), Index=8 cycli, R2=75 cycli (detectiestreng)."

Gegevensanalyse

Beide datasets voor proteomische en transcriptomische studies werden gelijktijdig geüpload en geanalyseerd met behulp van de online tool Metascape, die gen-annotatie voor verschillende soorten mogelijk maakt, waaronder Danio rerio (Zhou et al. 2019). Om de bijdrage van proteoom- of transcriptoomprofielverandering in specifieke routes te evalueren, werden gegevens verzameld geanalyseerd met behulp van Ingenuity Pathways Analysis (IPA)-software (Krämer et al. 2014).

Gegevenssets met gen- of eiwitidentificatoren en bijbehorende expressiewaarden werden naar de applicatie geüpload. Elke identificatie werd toegewezen aan het overeenkomstige object in de kennisbank van Ingenuity.

Er werd een grenswaarde voor de wijziging van de expressie van 1.3--voudig ingesteld om moleculen te identificeren waarvan de expressie differentieel werd gereguleerd. Functionele analyse identificeerde de biologische functies en/of ziekten die het meest significant waren voor de dataset. Moleculen uit de dataset die aan de grenswaarde voldeden en geassocieerd waren met biologische functies, werden voor de analyse in aanmerking genomen. De exacte test van Right-tailedFisher werd gebruikt om een ​​p-waarde te berekenen die de waarschijnlijkheid bepaalde dat elke biologische functie en/of ziekte die aan die dataset werd toegewezen, uitsluitend op toeval berust.

Trajectanalyse

Om de bijdrage van proteoom- of transcriptoomprofielveranderingen in specifieke routes te evalueren, werden beide datasets geüpload naar de IPA-software (Krämer et al. 2014). De belangrijkste significant gewijzigde canonieke routes werden vervolgens verder geëvalueerd en geïnterpreteerd met behulp van PCR en Western-blotting, zoals hieronder beschreven.

Western-blotting

In totaal werd 25 µg eiwitten geladen op een 12% NuPAGE (Novex, CA) en overgebracht naar PVDF-membranen (Novex, CA) zoals beschreven (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing en 0,01% Tween 20 (TBST-buffer) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens overnacht bij 4 graden geïncubeerd met polyklonaal konijnenanti-Cyp1A1 (Abcam, CA) of monoklonaal anti-GAPDH-muis ( Abcam, CA), verdund in TBST-buffer die 1% magere melk bevat.

Na wassen in TBST werden de blots gedurende 2 uur geïncubeerd met secundaire ezel-anti-konijn-HRP (Abcam, CA) of geit-anti-muis-HRP (Santa Cruz, CA) antilichamen gedurende 2 uur, gevolgd door ontwikkeling met Pierce ™ ECL Plus western blotting substraat ( Thermo Fisher Scientific, VS). De banden werden gevisualiseerd door beeldvorming met behulp van een LI-COR-scanner en geanalyseerd via densitometrie (LI_COR Biosciences, NE).

Realtime PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd uit de koppen met behulp van TRIzol-reagens (Sigma Aldrich, Saint Louis, VS) volgens de instructies van de fabrikant en vervolgens gemeten met behulp van een NanoDrop 2000 spectrofotometer (Thermo Scientific, MA). Een hoeveelheid van 1 µg van elk RNA-monster werd omgekeerd getranscribeerd met behulp van iScript™ reverse transcription supermix (Bio-Rad, CA), en real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van SsoAdvancedUniversal SYBR Green supermix (Bio-Rad, CA), en de primers worden vermeld in aanvullende tabel 1. Relatieve expressieniveaus werden berekend met behulp van de 2−ΔΔCT-methode, en de statistische T-test werd gebruikt om de significante verschillen te bepalen.

resultaten en discussie

Proteomische en transcriptomische analyses zijn twee belangrijke hulpmiddelen voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ziekteprocessen en de reactie op omgevingsstimuli (Duan et al. 2017; García-Estrada et al.2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al.2012) . Hier hebben we diepe expressieanalyses uitgevoerd op zowel het transcriptomische als het proteomische niveau in de hoofden van zebravisembryo's die waren blootgesteld aan DEPe.

De hoofden, die voornamelijk uit hersenweefsel bestaan, werden geïsoleerd om de expressieprofielen van andere weefsels te elimineren, omdat we geïnteresseerd zijn in het bepalen van intrinsieke pathologische routes van het CZS.

Het expressieprofiel van de hoofden van zebravisembryo's

Profielanalyse leverde 11.172 gedetecteerde eiwitten en 14.748 mRNA-doelen op uit meer dan 26,000 coderende genen (Howe et al. 2013). Van de 11.172 eiwitten geïdentificeerd uit de TMT-gelabelde monsters (aanvullende tabel 2), werden 141 eiwitten significant opgereguleerd en 607 werden gedownreguleerd (aanvullende tabel 3 en figuur la). Op dezelfde manier werden 367 transcripten opgereguleerd en 149 werden gedownreguleerd onder de 14.748 transcripten (aanvullende tabel 4) gedetecteerd in de RNA-seq-analyse (figuur 1b en aanvullende tabel 5).
In de meeste gevallen waren de bevindingen uit de opgereguleerde proteomische en transcriptomische analyses consistent. De belangrijkste sterk opgereguleerde eiwitten omvatten bijvoorbeeld cytochroom P450 Cyp1a, Cyp1c1, Guaninenucleotide-bindende eiwit-subeenheid gamma, Annexine, Plexin B2b korte isovorm, lid van dehydrogenase/reductase (SDR-familie) 13-zoals 1, S-antigeen van retina/pijnappelklier (arrestine) b, en Sulfotransferase6B1.

Op dezelfde manier omvatten genen met de hoogste transcriptomicupregulatie cytochroom P450 (Cyp1a), chemokine (C-C-motief) ligand 27a, aryl-koolwaterstofreceptorrepressor A, cytochroom P450 (Cyp1b) en Rh-familie C-glycoproteïne. Aan de andere kant gereguleerde eiwitten en transcripten, waren niet altijd sterk gecorreleerd.

Complexine 2, Spectrin alpha, Cardiale myosine lichte keten-1, SEC23 interacterend eiwit, ATPsynthase-membraansubeenheid EA, Cytochroom b en NAD-afhankelijke eiwitdeacetylase behoren bijvoorbeeld tot de belangrijkste sterk gedownreguleerde eiwitten, terwijl het retinalouter-segmentmembraaneiwit 1a , opgeloste stofdragerfamilie 5 (jodidetransporter), FBJ muizen osteosarcoom viraal oncogen homoloog B, complexine 4c, FOS-achtig antigeen 1a, opsine 1 en v-fos vertonen de hoogste neerwaartse regulatie van transcriptie (tabellen 1 en 2).

Er zijn beperkte antilichamen die zebraviseiwitten herkennen, maar we hebben wel een voorbeeld van deze veranderingen bevestigd met behulp van Western blot-analyse. De opregulatie van het Cyp1A-eiwit en de neerwaartse regulatie van Complexine 2 (CPLX2) werden bevestigd met behulp van GAPDH als laadcontrole (Fig. 2a). Hogere niveaus van TAT- en UGT1B1-transcriptie en lagere niveaus van CHNRB en TH2 werden ook bevestigd door qPCR met behulp van Elf-alpha als de interne controle (Fig. 2b).

Gen-annotatie

Er zijn verschillende online bio-informaticatools en -software die nuttige informatie over genannotatie kunnen bieden. Onder hen werd Metascape, met de mogelijkheid van gen-annotatie voor Danio rerio (Zhouet al. 2019), in dit werk gebruikt.

Beide datasets voor proteomische en transcriptomische onderzoeken werden gelijktijdig geüpload en geanalyseerd met behulp van deze online tool. Na het combineren van de output van zowel proteomische als transcriptomische veranderingen in de software, werden verschillende processen zoals reactie op xenobiotische stimulus, metabolisme van xenobiotica door cytochroom P450 en circadiane regulatie van genexpressie werden geïnduceerd na DEPe-behandeling (Fig. 3a).

Deze analyse suggereerde ook onderdrukte niveaus van biologische processen zoals 'visuele perceptie', 'fototransductie' en 'internalisatie van G-eiwit-gekoppelde receptoren'. De veranderingen in gezichtsgerelateerde expressieprofielen waren niet onverwacht, aangezien DEPe-behandeling tijdens de vroege ontwikkeling resulteerde in kleinere ogen (gegevens niet getoond).

Xenobiotische metabolismesignalering

Xenobiotica, vreemde natuurlijke of synthetisch-chemische verbindingen, kunnen de cellulaire stressreactie opwekken, wat kan leiden tot differentiatie, proliferatie, apoptose of necrose. Het lichaam moet zichzelf actief beschermen tegen xenobiotica, en ook tegen toxische endogene verbindingen en hun metabolieten, via de expressie van enzymen en transporters die betrokken zijn bij de eliminatie en ontgifting ervan.

Deze enzymen worden in drie groepen ingedeeld: PhaseI-enzymen (CYP, ALDH, FMO) die polariteit introduceren in de xenobiotica; Fase II-enzymen (UGT,GST, SULT) die hydrofiliciteit introduceren via conjugatie van hydrofiele moleculen zoals sulfaat, glucuronzuur en glutathion aan de xenobiotica; en Fase III-enzymen (MDR1, OATP2, MRP) die de xenobiotica of conjugaten transporteren die tijdens Fase II zijn gevormd naar het extracellulaire gebied.

Deze enzymen worden geïnduceerd door signaalcascades waarbij specifieke receptoren (CAR, PXR, AHR) en MAPK-gemedieerde activering van transcriptiefactoren (NRF2, MAF) betrokken zijn (Omiecinski et al. 2011).

Bij afwezigheid van activatoren bevindt de constitutief actieve receptor (CAR) zich in het cytoplasma als een complex met CCRP en HSP90. Maar wanneer een activator aanwezig is, transloceert CAR naar de kern en bindt zich aan RXR om een ​​heterodimeer te vormen en bindt zich verder aan verschillende varianten van het herhalingsmotief, zoals DR3, DR4, ER6 en ER8, en draagt ​​bij aan de regulatie van genexpressie (aanvullende tabel 2).

Onze proteomics-analyse onthulde de activering van het xenobiotische metabolisme. De duidelijke opregulatie van CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (heem-oxygenase 1), CAT (catalase) en CES1 (carboxylesterase 1) toont inderdaad de inductie van Fase I-metabolisme aan, terwijl de verhoogde expressie van UGT1A1 (UDP-glucuronosyltransferasefamilie 1 lid A1) en GSTP1 ( glutathioneS-transferase pi 1) duidt op de activering van het PhaseII-metabolisme.

Interessant genoeg suggereert downregulatie van sulfaattransferasen zoals SULT1A1 (sulfotransferasefamilie 1A lid 1), SULT1C2 (sulfotransferasefamilie 1C lid 2) en SULT2B1 (sulfotransferasefamilie 2B lid 1) dat toenemende hydrofiliciteit in Fase II-metabolisme bij voorkeur plaatsvindt via conjugatie met glucuronzuur en glutathion. , maar geen sulfaatconjugatie (Fig. 4).

De resultaten van het transcriptomische onderzoek zijn behoorlijk consistent, aangezien CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 en UGT1A1 allemaal op RNA-niveau worden opgereguleerd. SULT2B1 vertoont echter opregulatie op RNA-niveau (terwijl het ondervertegenwoordigd is op eiwitniveaus).

Dit kan te wijten zijn aan de betrokkenheid van andere mechanismen die de afbraak of inactivatie van sulfaattransferase-enzymen induceren na behandeling met DEPe. Wat vooral verrassend is, is dat deze veranderingen in het xenobiotische metabolisme plaatsvonden in de koppen (vermoedelijk de hersenen) van de vissen. De expressie van xenobiotische genen is beschreven in het zenuwstelsel van zoogdieren, maar dit is het eerste rapport ervan in de hersenen van zebravissen (McMillan en Tyndale 2018).

Deze bevindingen komen overeen met een soortgelijk onderzoek uitgevoerd door Shankar en collega's die de effecten van verschillende groepen polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) uit de omgeving op de ontwikkeling van embryo's testten en de impact van elk behandelingsregime op het transcriptoomprofiel verder evalueerden.

Op het hele lichaam van 48 HPF-embryo's (HPF) toonden ze aan dat de opregulatie van Cyp1a op zowel transcriptie- als eiwitniveaus een vroege betrouwbare biomarker is voor xenobiotische AHR-activering en stroomafwaartse transcriptomische veranderingen (Shankar et al. 2019).

De NRF2-gemedieerde oxidatieve stressreactie

Oxidatieve stress kan apoptose en necrose veroorzaken en wordt verondersteld betrokken te zijn bij neurodegeneratie (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). Een belangrijke cellulaire verdedigingsreactie op oxidatieve stress is de inductie van antioxiderende en ontgiftende enzymen.

Nucleaire factor-erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) bindt zich aan promoter-antioxidantresponselementen (ARE) en activeert hun transcriptie. Inactief Nrf2 is geassocieerd met een actinebindend eiwit Keap1 en wordt vastgehouden in het cytoplasma.

Getriggerd door oxidatieve stress wordt Nrf2 gefosforyleerd als reactie op de routes van proteïnekinase C, fosfatidylinositol3-kinase en MAP-kinase. Het gefosforyleerde Nrf2 kan zich vervolgens naar de kern verplaatsen en AREs binden om ontgiftende en antioxiderende enzymen te transactiveren (aanvullende tabel 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com