Suppletie met arseen in de voeding induceert oxidatieve stress door de aan kernfactor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 in de lever en nieren van legkippen te onderdrukken

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ABSTRACT

Deze studie onderzocht de effecten van arseensuppletie via de voeding op de legprestaties, eikwaliteit, lever- en nierhistopathologie en oxidatieve stress in de lever ennieren van legkippen. Verder werd de nucleaire factor erytroïde {{0}}gerelateerde factor 2 (Nrf2)-Kelch-achtige ECH-geassocieerde eiwit 1 (Keap1) route onderzocht om het moleculaire mechanisme van de stress te onthullen. Vijfhonderdtwaalf 40-weken oude Hyline White leghennen werden willekeurig verdeeld over 4 groepen met 8 hokken per groep en 16 hennen per hok. De doses arseen die aan de 4 groepen werden toegediend, waren 0,95, 20,78, 40,67 en 60,25 mg/kg. Uit de resultaten bleek dat suppletie met arseen via de voeding de productie van kippeneieren significant verminderde (P, 0, 05), gemiddeld eigewicht (P, 0,05), Haugh-eenheden (P, 0,05), eiwithoogte (P, 0,05) en eierschaalsterkte (P, 0,05). Voedingsarseensuppletie veroorzaakte ook de accumulatie van arseen en histopathologische schade in de lever ennier. In overeenstemming hiermee verhoogde arseensuppletie via de voeding significant serumalanineaminotransferase (P, {{0}}.05), aspartaataminotransferase (P, 0.05) , bloedureumstikstof (P, {{10}}.05) en urinezuur (P, 0.05). Na blootstelling aan arseen waren de activiteiten van superoxidedismutase (SOD) (P=0,05), catalase (P=0,01), glutathionreductase (P 0,05), glutathionperoxidase (P 0,05) en glutathiongehalte (P 0,05) significant verlaagd, terwijl het malondialdehydegehalte significant was verhoogd (P, 0,05) in de lever en de nieren. Positieve correlaties traden op tussen antioxiderende enzymactiviteiten en antioxiderende enzymgenexpressie in de lever en nier, behalve voor niermangaansuperoxidedismutase-genexpressie en SOD-activiteit. Bovendien was hepatische en renale Nrf2-mRNA-expressie positief gecorreleerd met genexpressie van antioxidanten en negatief gecorreleerd met Keap1-mRNA-expressie. Samengevat induceerde suppletie met arseen via de voeding oxidatieve stress door de Nrf2-Keap1-route in de levers en nieren van legkippen te onderdrukken.

trefwoorden:arseen, leghen, Nrf2-Keap1-route, oxidatieve stress, nieren

INVOERING

In de afgelopen jaren zijn gevaren voor het milieu geconstateerd in toenemende concentraties. Arseen is een zeer metalloïde giftige stof, zelfs in een zeer lage concentratie in pluimveevoer. De fysiologische rol ervan bij pluimvee is goed gedefinieerd, aangezien het noodzakelijk is voor de synthese van methioninemetabolieten, waaronder cysteïne. De aanbevolen concentraties arseen in pluimveevoer liggen tussen {{0}}.012 en 0.050 mg/kg (Balo s et al., 2019). Uit eerder onderzoek is echter gebleken dat de arseenconcentraties in pluimveevoer waarschijnlijk hoger zijn dan de tolerantieniveaus van dieren wanneer het pluimveevoer zeewier, cupricarbonaat, cuprisulfaatpentahydraat, dikoperchloridetrihydroxide of ferrocarbonaat bevat (Adamse et al., 2017) . Kazi et al. (2013) meldden dat er een grote kans is dat arseen in pluimveevoer de gezondheid van vleeskuikens aantast. De overmatige hoeveelheden arseen in pluimveevoeders en de toxicologische effecten ervan op pluimvee zijn nog steeds ernstige problemen. Wanneer een teveel aan arseen in een dier terechtkomt, kan het een verscheidenheid aan nadelige gezondheidseffecten veroorzaken, zoals immunotoxiciteit, respiratoire toxiciteit, cardiovasculaire toxiciteit, hepatotoxiciteit, hepatotoxiciteit, nefrotoxiciteit, neurovirulentie, reproductietoxiciteit en genotoxiciteit. De toxicologische effecten van arseen op viscerale organen zijn voornamelijk gedocumenteerd in zoogdierstudies, wat suggereert dat arseen een risico vormt voor de lever- en nierfuncties (Waalkes et al., 2004; Mazumder, 2005; Zheng et al., 2014). Desalniettemin zijn de toxicologische effecten van blootstelling aan arseen via de voeding op de lever en de nieren van legkippen nog steeds onduidelijk. De toxiciteit van arseen bij dieren hangt nauw samen met oxidatieve stress, die de pro/antioxidant-balans verstoort (Flora, 2011). Wanneer arseen een cel binnenkomt, bindt het zich met intracellulair glutathion (GSH) of oxideert het, wat leidt tot de vorming van vrije radicalen. Zoals we weten, kunnen cytoprotectieve genen worden gereguleerd door een aantal intracellulaire transcriptiefactoren, waaronder nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2), activatorproteïne 1 en nucleaire factor kappa-B (Kwak et al., 2001 ). De transcriptiefactor Nrf2 is een essentieel molecuul dat de stressniveaus in cellen reguleert. Onder rustige omstandigheden interageert Nrf2 met Kelch-achtig ECH-geassocieerd eiwit 1 (Keap1), dat zich meestal in het cytoplasma bevindt. Wanneer oxidatieve stress wordt geactiveerd, verplaatst Nrf2 zich van het cytoplasma naar de kern na scheiding van het Keap1-molecuul en activeert vervolgens de expressies van cytoprotectieve genen (Motohashi en Yamamoto, 2004). Daarna reguleren cytoprotectieve genen de activiteiten van stroomafwaartse antioxidantenzymen, waaronder superoxidedismutase (SOD), glutathionreductase (GR), glutathionperoxidase (GSH-Px) en katalase (CAT). Een eerdere studie heeft aangetoond dat de transcriptiefactor Nrf2 deelneemt aan door arseen geïnduceerde stress bij zoogdieren (Sinha et al., 2013). De exacte effecten van blootstelling aan arseen op de effecten van oxidatieve stress bij legkippen blijven echter ongrijpbaar. In de huidige studie hebben we het effect onderzocht van arseensupplementen via de voeding op de legprestaties, eikwaliteit, serumbiochemische indices, hepatische en renale histopathologische veranderingen en oxidatieve stress bij legkippen. Verder werd de Nrf2-Keap1-route onderzocht om het moleculaire mechanisme in de levers ennierenvan legkippen. Deze studie geeft inzicht in de biologische theorie van overmatige arseentoxiciteit in de lever enniervan legkippen.

cistanche reddittotnierpijn verlichten

MATERIALEN EN METHODES

Deze studie werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee. Alle experimentele procedures die op dieren werden uitgevoerd, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Chinese Association for Laboratory Animal Sciences.

Dieren, diëten en experimenteel ontwerp

Vijfhonderdtwaalf {{0}} weken oude Hyline White-leghennen met vergelijkbare lichaamscondities werden willekeurig geselecteerd en in 4 groepen verdeeld. Elke groep bevatte 8 replica's van 16 vogels. Arseen werd toegevoegd aan het basale maïs-bonendieet in 4 verschillende concentraties (0, 20, 40 en 60 mg/kg; in de vorm van arsanilzuur) (supplementtabel 1). De concentraties arseen in het voer werden gemeten door atoomabsorptiespectrometrie met hydridegeneratie volgens eerdere methodologie (Dos Passos et al., 2012). De werkelijke arseenconcentraties in de 4 groepen waren 0,95, 20,78, 40,67 en 60,25 mg/kg. De vogels werden gehouden in kooien (60 ! 50 ! 50 cm3) uitgerust met 1 voerbak en 2 drinknippels, en per kooi werden 2 hennen gehuisvest. Gedurende de gehele proefperiode hadden de hennen vrije toegang tot voer en drank. Het hele experiment duurde 10 weken, inclusief een 1-week aanpassingsperiode en een 9-week formele experimentele periode.

Legprestaties en eikwaliteit

Gedurende de gehele experimentele periode werden dagelijks legprestatie-indexen geregistreerd, waaronder voerconsumptie, productie van kippeneieren en eiergewicht (EW). Bepalingen van voeropname en EW in elke groep werden uitgevoerd met behulp van een gevoelige weegschaal (XS2002S, Mettler Toledo, Zürich, Zwitserland). Voerconversieratio (FCR) werd berekend volgens de volgende formule: FCR 5 voeropname in gram/eimassa in gram. Een totaal van 40 eieren van elke groep werden willekeurig verzameld om de parameters van de eikwaliteit te meten binnen 24 uur na het leggen van de eitjes aan het einde van het experiment. De eieren werden gewogen met een gevoelige weegschaal (XS2002S, Mettler Toledo). Daarna werden de Haugh-eenheid, albuminehoogte, dooierkleur en eierschaalsterkte bepaald door een digitale eiertester (DET6000, Nabel Co. Ltd., Kyoto, Japan). Eierschaaldikte met het binnenmembraan werd bepaald op het scherpe, middelste en stompe gebied van het ei met behulp van een meetklokmicrometer(547-350, Mitutoyo, Kawasaki, Japan) en de gemiddelde waarden werden gebruikt voor de statistische analyse.

Verzameling van monsters

Na het kweekexperiment werden 32 vogels uit elke groep willekeurig geselecteerd en geëuthanaseerd door de nekaders af te snijden. Bloedmonsters werden verzameld in steriele centrifugebuizen en onmiddellijk naar het laboratorium getransporteerd voor meting van biochemische indices in serum. Daarna werden de vogels ontleed, en de lever ennierenuit de buikholte werden verwijderd. de lever enniermonsters werden in 4 delen gesneden. Een deel werd onmiddellijk gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde voor histopathologisch onderzoek. De andere 3 delen werden onmiddellijk opgeslagen in vloeibare stikstof voor verdere bepaling van oxidatieve stressparameters, arseenafzetting en genexpressie.

Arseenafzettingstest

Na meting van de eikwaliteit werd de dooier gescheiden van het eiwit. Accumulatie van arseen in het albumine en de dooier werd gemeten door atoomabsorptiespectrometrie met hydridegeneratie volgens eerdere methodologie (Dos Passos et al., 2012). De accumulatie van arseen in het hele ei werd berekend door het arseengehalte in het eiwit en de dooier bij elkaar op te tellen. Op een vergelijkbare manier werd atoomabsorptiespectrometrie met hydridegeneratie gebruikt om de accumulatie van arseen in de lever ennier van legkippen(Dos Passos et al., 2012).

Bepaling van biochemische indices in serum

Totaal eiwit, albumine, globuline, alanine aminotransferase (ALT) en aspartaat aminotransferase (AST) niveaus zijn belangrijke indexen voor het evalueren van de leverfunctie. Deze parameters werden gemeten met behulp van geschikte testkits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Bloedureumstikstof (BUN), urinezuur (UA) en creatinine (CT) niveaus zijn belangrijke indexen voor het evalueren van de nierfunctie en werden bepaald met behulp van detectiekits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).

Histopathologische veranderingen

Lever- en nierweefsels gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde werden gedehydrateerd in 70, 80, 90, 95 en 100 procent ethanol en uiteindelijk ingebed in paraffine. De weefsels werden in plakjes van 6- mm dikte gesneden en vervolgens gekleurd met hematoxyline en eosine. Daarna observaties van histopathologische veranderingen in de lever ennierweefsels werden uitgevoerd door een patholoog onder een optische microscoop (Olympus, Melville, NY).

Lipideperoxidatie (LPO) en antioxidant-enzymactiviteitstesten

De activiteiten van SOD, CAT, GR en GSH-Px, en het gehalte aan malondialdehyde (MDA) en GSH in de lever en de nieren werden bepaald met geschikte analysekits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). In het kort werd het MDA-gehalte gemeten met een spectrofotometrische methode gebaseerd op de reactie tussen thiobarbituurzuur en MDA (Janero, 1990). GR-activiteit en GSH-gehalte werden bepaald met behulp van 5,5- dithiobis(2-nitrobenzoëzuur) (Carlberg en Mannervik, 1985; Abegg et al., 2012). SOD-activiteit werd bepaald volgens de remmende reactie tussen nitroblauwtetrazoliumreductie en xanthine-oxidase. CAT-activiteit werd bepaald op basis van de vorming van een stabiel waterstofperoxide-ammoniummolybdaatcomplex (Aebi, 1984). De GSH-Px-activiteit werd bepaald door de reductie van t-butylhydroperoxide te evalueren (Wheeler et al., 1990).

Totale RNA-isolatie en realtime kwantitatieve PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd uit de lever- en nierweefsels met de Trizol RNAiso Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) volgens de instructies van de fabrikant. De RNA-monsters werden omgekeerd getranscribeerd in cDNA met behulp van de PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, Dalian, China). De voorwaartse en achterwaartse primers voor mangaan superoxide dismutase (MnSOD), koper-zink superoxide dismutase (CuZnSOD), CAT, GR, GSH-Px, Nrf2, Keap1 en het huishoudgen (b-actine) worden getoond in aanvullende tabel 2. De overvloed aan genen werd gemeten met een StepOnePlus Real-Time PCR-systeem (ABI 7500, Applied Biosystems, Foster City, CA). De fietsomstandigheden waren 30 s 95 ° C, gevolgd door 35 cycli van 95 ° C gedurende 5 seconden, 59 ° C gedurende 10 seconden en 72 ° C gedurende 30 seconden. Het vouwverschil in mRNA-expressie werd gemeten met behulp van de relatieve kwantificatiemethode met behulp van real-time PCR-efficiënties en genormaliseerd naar het niveau van b-actine, om de relatieve CT-veranderingen tussen alle groepen te vergelijken (Livak en Schmittgen, 2001).

Statistische analyse

Alle gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde 6 SE. Statistische analyse werd uitgevoerd door eenrichtings-ANOVA met behulp van SPSS-versie 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Wanneer de verschillen tussen de groepen significant waren (aangegeven door P, 0.05), werden de gemiddelden vergeleken met het eerlijk significante verschil van Tukey voor post hoc meervoudige vergelijkingen. Pearson-correlaties werden geanalyseerd door bivariate correlatieanalyse (SPSS versie 20.0, SPSS Inc.). De significantie- en correlatiecoëfficiënten worden respectievelijk weergegeven als "p" en "r".

RESULTATEN

Legprestaties en eikwaliteit Vergeleken met die in de {{0}},95 mg/kg arseengroep, waren de productie van kippeneieren en EW significant verlaagd in de 60,25 mg/ kg arseengroep (P, 0.05). Arseen in de voeding had echter geen invloed op de voeropname of FCR (tabel 1). Vergeleken met die in de {{20}},95 mg/kg arseengroep, was de Haugh-eenheid significant verlaagd in de 40,67 mg/kg (P, 0,05) en 60,25 mg /kg (P, 0,05) arseengroepen. Bovendien waren zowel de albuminehoogte als de sterkte van de eierschaal significant afgenomen in de groep van 20,78 mg/kg arseen vergeleken met de groep van 0,95 mg/kg arseen (P, 0,05), een plateau bereikt in de groep van 40,67 mg/kg arseen en sterk afgenomen in de groep van 60,25 mg/kg arseengroep (P, 0,05). Dieetarseen had geen invloed op de dooierkleur of de dikte van de eierschaal (tabel 1)

Afzetting van arseen

De afzetting van arseen in het eiwit (P, {{0}}.05), dooier (P, 0.05) en het hele ei (P, 0.05) significant verhoogd naarmate de dosis arseen via de voeding toenam van 0,95 tot 60,25 mg/kg (Tabel 2). Evenzo, toen de dosis arseen via de voeding toenam van 0,95 tot 60,25 mg/kg, nam de afzetting van arseen in de lever (P, 0,05) en nier (P, 0,05) significant toe (Tabel 2)

Correlatieanalyse tussen eikwaliteit en afzetting van arseen in het ei

De afzetting van arseen in het albumine was negatief gecorreleerd met de Haugh-eenheid (r {{0}}.622, P, 0.{{10}}1), albumine hoogte (r 5 20.878, P, 0.01), en eierschaalsterkte (r 5 20.897, P, 0.{{ 30}}1). Ondertussen was de afzetting van arseen in de dooier ook negatief gerelateerd aan de Haugh-eenheid (r 5 20.654, P, 0.01), albumine hoogte (r 5 20.893, P, 0.01) en sterkte van de eierschaal (r 5 20.902, P, 0.01). Evenzo werden negatieve relaties gevonden tussen de afzetting van arseen in het hele ei en de Haugh-eenheid (r 5 20.640, P, 0.01), eiwithoogte (r 5 20.888, P, 0.01) , en eierschaalsterkte (r 5 20.902, P, 0.01) (Tabel 3)

Serum biochemische indexen

Vergeleken met die in de {{0}},95 mg/kg arseengroep, waren de ALT-spiegels significant verhoogd in de 20,78 mg/kg (P , 0.{ {16}}5), 40,67 mg/kg (P, 0,05) en 60,25 mg/kg (P, 0,05) arseengroepen. Ondertussen waren de AST-spiegels in de arseengroep van 60,25 mg/kg aanzienlijk verhoogd in vergelijking met die in de arseengroep van 0,95 mg/kg (P: 0,05). Dieetarseen had geen invloed op de totale eiwit- of albuminespiegels in serum (tabel 4).

Vergeleken met die in de {{0}},95 mg/kg arseengroep, waren zowel de BUN- als de UA-spiegels significant verhoogd in de 60,25 mg/kg arseengroep (P, 0,05), terwijl de blootstelling aan arseen via de voeding dat niet deed. invloed op het CT-niveau in het serum (Tabel 4).

Histopathologische veranderingen

Het uiterlijk van leverweefsel was normaal en onveranderd in de {{0}},95 mg/kg arseengroep. Naarmate de dosis arseen via de voeding echter toenam van 20,78 tot 60,25 mg/kg, werden de proliferatie van de galwegen, hepatocytsteatose en vervorming van de centrale ader ernstiger (figuren 1A-1D). Het uiterlijk van nierweefsel was normaal en onveranderd in de 0,95 mg/kg arseengroep. Er was echter ernstige glomerulaire krimp in de 20,78 mg/kg arseengroep vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep. Naarmate de dosis arseen via de voeding toenam van 40,67 tot 60,25 mg/kg, werden de vergroting van de niertubuli, tubulaire fifibrose en hyalinisatie ernstiger (figuren 1E-1H).

Biomarkers voor oxidatieve stress

Vergeleken met die in de {{0}},95 mg/kg arseengroep, waren de MDA-spiegels in de lever significant verhoogd in de 60,25 mg/kg arseengroep (P , {{12} }.05) en de renale MDA-spiegels waren significant verhoogd in de 20,78 mg/kg (P , 0,05), 40,67 mg/kg (P , 0,05) en 60,25 mg/kg (P , 0,05) arseen groepen (Figuur 2A). GSH-niveaus in de lever enniersignificant afgenomen in de groep van 20,78 mg/kg arseen vergeleken met die in de groep van 0,95 mg/kg arseen (P, 0.05) en bereikte een plateau in de 40.67 en 60.25 mg/kg arseengroepen (Figuur 2B). De SOD-activiteit in de lever was significant verlaagd in de 40,67 mg/kg (P, 0,05) en 60,25 mg/kg (P, 0,05) arseengroepen vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep. De renale SOD-activiteit was significant verlaagd in de 20,78 mg/kg arseengroep vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep (P, 0,05) en bereikte een plateau in de 40,67 en 60,25 mg/kg arseengroepen (Figuur 2C). CAT-activiteit in de lever ennieraanzienlijk afgenomen naarmate de dosis arseen via de voeding toenam van {{0}},95 tot 60,25 mg/kg (P, 0.05, Figuur 2D). Vergeleken met die in de 0,95 mg/kg arseengroep, was de GR-activiteit in de lever en de nieren significant verlaagd in de 60,25 mg/kg arseengroep (P, 0,05, figuur 2E) ). Bovendien, vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep, was de hepatische GSH-Px-activiteit significant verlaagd in de 60,25 mg/kg arseengroep (P, 0,05), en de renale GSH Px-activiteit nam sterk af in de 20,78 mg/kg arseengroep (P, 0,05) en plateaued in de 40,67 en 60,25 mg/kg arseen groepen (Figuur 2F).

Genexpressies van antioxidante enzymen, Nrf2 en Keap1-moleculen

Hepatische CuZnSOD-genexpressie was significant verlaagd in de groep van 20,78 mg/kg arseen vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep (P, 0.{{16} }5) en bereikte een plateau in de 40,67 en 60,25 mg/kg arseengroepen. Renale CuZnSOD-genexpressie was significant verlaagd in de 40,67 mg/kg (P , 0.05) en 60,25 mg/kg (P , 0.05) arseengroepen vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep (Figuur 3A). Vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep, was de MnSOD-genexpressie in de lever significant verlaagd in de 20,78 mg/kg arseengroep (P, 0).{{73 }}5) en bereikte een plateau in de 4{{80}},67 en 60,25 mg/kg arseengroepen. Renale MnSOD-genexpressie was niet significant verschillend tussen de groepen (Figuur 3B). Hepatische CAT-genexpressie was significant verlaagd in de groep van 20,78 mg/kg arseen vergeleken met de {{105}},95 mg/kg arseengroep (P, 0,05) en bereikte een plateau in de arseengroepen van 40,67 en 60,25 mg/kg. De renale CAT-genexpressie was significant verlaagd in de 20,78 mg/kg arseengroep vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep (P, 0,05) en bereikte een plateau in de 40,67 mg/kg arseengroep, en was sterk verlaagd in de 60,25 mg/kg arseengroep vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep (P, 0,05, figuur 3C). GR-genexpressie in de lever en nieren was significant verlaagd in de 20,78 mg/kg arseengroep vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep (P, 0,05) en bereikte een plateau in de 40,67 en 60,25 mg/kg arseengroepen (Figuur 3D). Bovendien nam de GSH-Px-genexpressie in de lever significant af naarmate de dosis arseen via de voeding toenam van 0,95 tot 40,67 mg/kg (P, 0,05) en vervolgens een plateau bereikte in de 60,25 mg/kg arseengroep. Renale GSH-Px-genexpressie nam aanzienlijk af in de arseengroep van 20,78 mg/kg in vergelijking met de arseengroep van 0,95 mg/kg (P, 0,05) en bereikte een plateau in de arseengroepen van 40,67 en 60,25 mg/kg (Figuur 3E). Nrf2-genexpressie in de lever en nieren was significant verlaagd in de 20,78 mg/kg arseengroep vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep (P, 0,05) en bereikte een plateau in de 40,67 en 60,25 mg/kg arseengroepen (figuren 4A en 4C ). Daarentegen was de Keap1-genexpressie in de lever en de nieren sterk verhoogd in de 20,78 mg/kg arseengroep vergeleken met de 0,95 mg/kg arseengroep (P, 0,05) en bereikte een plateau in de 40,67 en 60,25 mg/kg arseengroepen (figuren 4B en 4D).

Correlatieanalyses gerelateerd aan de Nrf2- Keap1-route

De genexpressie van CuZnSOD (lever, r {{0}}.613, P , 0.01;nier, r {{0}}.687, P , 0.{{10}}1), KAT (lever, r 5 0.738, P , 0.01; nier, r 5 0.903, P , 0.01), GR (lever, r 5 0.477, P , 0.05; nier, r 5 0.485, P , 0.05) en GSH-Px (lever, r 5 0.450, P , 0.05; nier , r 5 0,767, P , 0,01) in de lever en de nieren, en de patische MnSOD-genexpressie (r 5 0},707, P , 0,01) waren positief gecorreleerd met de activiteiten van hun overeenkomstige antioxidante enzymen. Bovendien was Nrf2-genexpressie positief gecorreleerd met de genexpressies van CuZnSOD (lever, r 5 0.756, P , 0.01;nier, r {{0}}.736, P , 0.01), CAT (lever, r 5 0.893, P , 0.01;nier, r {{0}}.740, P , {{10}}.01), GR (lever, r 5 0 .837, P , 0.01; nier, r 5 0.915, P , 0.01) en GSH-Px (lever, r 5 0.822, P , 0.01; nier, r {{17} }.722, P , 0.01) in de lever ennier, en hepatische MnSOD-genexpressie (r {{0}}.720, P , 0.01). Er was een negatieve correlatie tussen de mRNA-expressie van Nrf2 en Keap1 (lever, r 5 20.746, P , 0.01;nier, r {{0}}.771, P , 0.01) in de lever en de nieren. Bovendien was er geen correlatie tussen MnSOD-genexpressie en SOD-enzymatische activiteit, of Nrf2-mRNA-expressie in denieren van legkippen(Tabel 5).

DISCUSSIE

Arseen is een alomtegenwoordige en giftige metalloïde in de natuur. Het induceert verschillende toxicoses bij mens en dier, waaronder hepatotoxiciteit, nefrotoxiciteit, neurovirulentie, immunotoxiciteit, cardiovasculaire toxiciteit, hepatotoxiciteit en reproductietoxiciteit (Mandal en Suzuki, 2002). Arseen richt zich het meest robuust op het voortplantingssysteem van dieren. Eerdere studies hebben aangetoond dat blootstelling aan roxarson via de voeding de legsnelheid en de eierproductie verstoort (Chiou et al., 1999; Zhang et al., 2017). In deze studie verminderde voedingssupplementen met arseen de legprestaties aanzienlijk, inclusief de eiproductie en EW. Eerdere studies hebben aangetoond dat suppletie met arseen via de voeding de accumulatie van arseen in eieren induceert en de eikwaliteit vermindert (Chiou et al., 1998; Zhang et al., 2017). In de huidige studie verminderde suppletie met arseen via de voeding de Haugh-eenheid, de albuminehoogte en de sterkte van de eierschaal aanzienlijk. Behalve voor dooierkleur en eischaaldikte werden negatieve correlaties gevonden tussen de depositie van arseen in eieren en eikwaliteitsparameters. Dit suggereert dat Haugh-eenheid, eiwithoogte en eierschaalsterkte kunnen worden beïnvloed door de afzetting van arseen in het ei. Zoals we weten, is de dikte van de palissadelaag in de eierschaal bepalend voor de dikte van de eierschaal (Ruiz en Lunam, 2000), terwijl pigmentafzetting de dooierkleur bepaalt. Daarom speculeerden we dat suppletie met arseen via de voeding mogelijk geen invloed heeft op de dikte van de palissadelaag van pigmentafzetting in de eieren van legkippen. Opkomend bewijs geeft aan dat lever- en nieraandoeningen vaak voorkomen bij zoogdieren na blootstelling aan arseen (Liu en Waalkes, 2008; Huang et al., 2009). Een eerdere studie toonde aan dat blootstelling aan arseen histopathologische laesies in de lever induceert, waaronder weefseldesoriëntatie, peliose en vacuolisatie vergezeld van karyolyse, apoptose en necrose van hepatocyten in Channa punctatus (Roy en Bhattacharya, 2006). In deze studie hebben we ernstige veranderingen waargenomen in de proliferatie van het galkanaal, hepatocytsteatose en vervorming van de centrale ader in de lever toen de dosis arseen via de voeding toenam van 20,78 tot 60,25 mg/kg. Roy en Bhattacharya (2006) ontdekten ook dat blootstelling aan arseen leidt tot krimp van de glomerulus, onregelmatigheden in de niertubuli en een toename van de ruimte van Bowman. In het huidige onderzoek, aangezien de dosis arseen via de voeding

verhoogd van 20,78 naar 60,25 mg/kg, waren de histopathologische veranderingen in de nieren zeer ernstig, waaronder vergroting van de niertubuli, glomerulaire krimp en tubulaire fifibrose en hyalinisatie, wat consistent is met een eerdere studie (Roy en Bhattacharya, 2006). Volgens eerdere rapporten is bewezen dat serum-AST- en ALT-spiegels surrogaatmarkers zijn van de leverontstekingsreactie en fifibrose (Wang et al., 2008; Khattab et al., 2015). In deze studie impliceerden verhogingen van AST- en ALT-spiegels in serum dat de ontstekingsreactie van de lever werd versterkt na blootstelling aan arseen, wat consistent was met de waargenomen histopathologische veranderingen in de lever van legkippen. Patel en Kalia (2013) ontdekten ook dat door arseen geïnduceerde hepatotoxiciteit zich manifesteert door een verhoging van de serum-ALAT- en AST-spiegels bij Wistar-ratten. De nierfunctie wordt routinematig gecontroleerd door BUN-, CT- en UA-spiegels in het serum. We ontdekten dat de serum BUN- en UA-spiegels significant verhoogd waren en dat de serum-CT-spiegel de neiging had te stijgen na arseensuppletie via de voeding, wat impliceert datnierschadeveroorzaakt door blootstelling aan arseen bij legkippen, wat consistent is met eerder onderzoek (Liu et al., 2000). Het is algemeen bekend dat weefselbeschadiging veroorzaakt door blootstelling aan arseen nauw verband houdt met oxidatieve stress (Jomova et al., 2011). Wanneer oxidatieve stress wordt geactiveerd, induceren intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) LPO, dat kan worden gevolgd door intracellulaire MDA-niveaus (Storey, 1996). In deze studie waren de MDA-spiegels in de lever en de nieren significant verhoogd na suppletie met arseen via de voeding, wat impliceert dat er een toename was in LPO, wat kan wijzen op oxidatieve schade in de lever ennieren van legkippen.GSH speelt ook een vitale rol bij de regulatie van intracellulaire oxidatieve stress (Finkel en Holbrook, 2000). Vergeleken met die in de 0,95 mg/kg arseengroep, GSH-waarden

waren significant verminderd in de groepen die werden behandeld met hogere concentraties arseen, wat suggereert dat arseen zich zou kunnen binden aan GSH om de antioxiderende eigenschappen van de lever te verminderen ennier.Flora et al. (1997) meldden dat blootstelling aan arseen de GSH-concentratie verlaagt en uitgesproken laesies in de lever en veroorzaaktnierenvan ratten. Bovendien verlenen intracellulaire antioxidant-enzymatische systemen beschermende rollen om te beschermen tegen oxidatieve stress, waaronder SOD, CAT, GR en GSH-Px (Finkel en Holbrook, 2000). In deze studie verminderde voedingssupplementen met arseen de activiteiten van SOD, CAT, GR en GSH-Px in de levers en nieren van legkippen aanzienlijk. Wanneer antioxidantsystemen de overmaat aan intracellulaire ROS niet kunnen neutraliseren, treedt oxidatieve schade op als gevolg van LPO, wat op zijn beurt de activiteiten van antioxidante enzymen zou kunnen verzwakken. Een eerdere studie meldde op dezelfde manier dat arseen oxidatieve stress induceert in de rattennier (Sener et al., 2016). Antioxidant-enzymen zijn eiwitten en kunnen op transcriptioneel niveau door genen worden gereguleerd. In de huidige studie verminderde blootstelling aan arseen de mRNA-expressie van CuZnSOD, CAT, GR en GSHPx aanzienlijk. Bovendien was de genexpressie van CuZnSOD, CAT, GR en GSH-Px positief gecorreleerd met de activiteiten van antioxidante enzymen, wat impliceert dat blootstelling aan arseen de activiteiten van antioxidante enzymen verminderde door de mRNA-expressie te remmen. Evenzo rapporteerden correlaties tussen de activiteiten van antioxidante enzymen en genexpressie in de levers en nieren van legkippen na blootstelling aan kwik. Suppletie met arseen in de voeding had echter geen invloed op de MnSOD-expressie in denier.Dit kan zijn omdat SOD verschillende iso-enzymen heeft en de activiteit ervan niet wordt beïnvloed door het MnSOD-gen. Nrf2 speelt een vitale rol in het afweersysteem tegen oxidatieve stress. Onder basale omstandigheden bindt Nrf2 aan Keap1 in het cytoplasma. Zodra het intracellulaire ROS-niveau hoog genoeg is om de reactieve thiolgroepen van Keap1 te wijzigen, verplaatst Nrf2 zich veel gemakkelijker naar de kern, waar het de antioxidant-responsieve irriteert

element en activeert vervolgens stroomafwaartse beschermende genen (Sinha et al., 2013). In deze studie ontdekten we dat blootstelling aan arseen de Nrf2-genexpressie en de expressie van stroomafwaartse antioxidantenzymen aanzienlijk verminderde. Downregulatie van Nrf2- en stroomafwaartse antioxidant-enzymgenen na blootstelling aan arseen suggereerde dat arseen de expressie van antioxidant-enzymgenen remde door Nrf2-genexpressie in de lever te onderdrukken ennier. Bovendien was de versterking van Keap1-genexpressie negatief gecorreleerd met Nrf2- en antioxidant-enzymgenexpressie, wat impliceert dat opregulatie van cytoplasmatisch Keap1 Nrf2-translocatie van het cytoplasma naar de kern bevordert (Kensler et al., 2007). Een vergelijkbare studie meldde dat de intracellulaire Nrf2-Keap1-route wordt geïnactiveerd als reactie op blootstelling aan arseen (Janasik et al., 2018). Niettemin meldde een eerdere studie ook dat blootstelling aan arseen de Nrf2-Keap1-route verbetert om te beschermen tegen oxidatieve schade (Massrieh et al., 2006). Deze bevindingen zijn niet in strijd met dit onderzoek. In de vroege stadia van oxidatieve stress kunnen de beschermende effecten van Nrf2-Keap1 worden geactiveerd om oxidatieve stress te voorkomen. Desalniettemin is de Nrf2-Keap1-route mogelijk niet bestand tegen oxidatieve schade veroorzaakt door aanhoudende blootstelling aan een hoge dosis arseen (Kensler et al., 2007). Daarna kan de Nrf2- Keap1-route worden geremd en kan intracellulaire oxidatieve schade of zelfs apoptose optreden in de levers en nieren van legkippen. Met het oog op de huidige resultaten levert deze studie nieuw bewijs voor hepatische en renale antioxidantafweer onder arseenblootstelling bij legkippen en verheldert het voor de eerste keer een centrale rol van de Nrf2-Keap1-route in door arseen geïnduceerde oxidatieve stress . Samengevat verminderde arseensuppletie via de voeding de legprestaties en de eikwaliteit van leghennen. Histopathologische schade trad op in de lever ennierna blootstelling aan arseen via de voeding. Bovendien veroorzaakte blootstelling aan arseen via de voeding lever- en nieroxidatieve stress door de Nrf2-Keap1-route bij legkippen te verminderen.