Differentiële controle van menselijke Treg- en effector-T-cellen in tumorimmuniteit door Fc-ontworpen anti-CTLA-4-antilichaam

Anti–CTLA-4 mAb is effectief bij het verbeteren van de tumorimmuniteit bij mensen. CTLA-4 wordt tot expressie gebracht door conventionele T-cellen na activatie en door natuurlijk voorkomende FOXP3 plus CD4 plus Treg-cellen constitutief, wat de vraag doet rijzen hoe anti-CTLA{4}} mAb deze functioneel tegengestelde T-celpopulaties differentieel kan controleren in tumor immuniteit. Hier laten we zien dat FOXP3 hoog krachtig onderdrukkende effector Treg-cellen overvloedig aanwezig waren in melanoomweefsels, CTLA -4 op hogere niveaus tot expressie brachten dan tumor-infiltrerende CD8 plus T-cellen. Na in vitro tumor-antigeenstimulatie van perifere mononucleaire bloedcellen van gezonde personen of melanoompatiënten, Fc-regio-gemodificeerd anti-CTLA-4 mAb met hoge antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) en cellulaire fagocytose (ADCP ) activiteit putte selectief CTLA-4 plus FOXP3 plus Treg-cellen uit en breidde bijgevolg tumorantigeen-specifieke CD8 plus T-cellen uit.

Belangrijk is dat de expansie alleen optrad wanneer de antigeenstimulatie enkele dagen na de antilichaambehandeling werd uitgesteld om CTLA-4 plus geactiveerde effector CD8 plus T-cellen te vrijwaren van door mAb gemedieerde doding. Evenzo verlengde bij muizen met een hoog ADCC/ADCP-anti-CTLA-4 mAb-behandeling met vertraagde tumor-antigeenvaccinatie hun overleving significant en verhoogde de cytokineproductie door tumor-infiltrerende CD8 plus T-cellen significant, terwijl antilichaambehandeling gelijktijdig met vaccinatie niet. Anti-CTLA4 mAb gemodificeerd om minder of geen Fc-bindende activiteit te vertonen, vertoonde geen dergelijke timingafhankelijke in vitro en in vivo immuunverbetering. Aldus kan een hoog ADCC anti–CTLA-4 mAb selectief effector Treg-cellen uitputten en tumorimmuniteit opwekken, afhankelijk van de CTLA-4– die de status van effector CD8 plus T-cellen tot uitdrukking brengt. Deze bevindingen spelen een belangrijke rol bij het ontwerpen van kankerimmunotherapie met mAb's die zich richten op de moleculen die gewoonlijk tot expressie worden gebracht door FOXP3 plus Treg-cellen en tumor-reactieve effector-T-cellen.

Regulatoire T-cellen|CTLA-4|FOXP3|kankerimmunotherapie|antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit.

Natuurlijk voorkomende CD25 plus CD4 plus Treg-cellen, die de transcriptiefactor FOXP3 tot expressie brengen, spelen een onmisbare rol bij het handhaven van immunologische zelftolerantie en homeostase (1). Ze belemmeren echter ook effectieve immuunresponsen tegen tumorcellen die uit zichzelf voortkomen, zoals geïllustreerd door de bevindingen dat muistumoren eenvoudig kunnen worden uitgeroeid door uitputting van Treg-cellen (2-5).

Bij mensen is er steeds meer bewijs voor overvloedige infiltratie van Treg-cellen in verschillende tumorweefsels (6-8), en een significante correlatie tussen Treg-infiltratie en slechte prognose bij verschillende soorten kanker (9). Controle van Treg-cellen in tumorweefsels is daarom waarschijnlijk een veelbelovende manier om effectieve tumorimmuniteit bij kankerpatiënten op te wekken.

Voor antitumor vonden we dat Cistanche deserticola een duidelijk antitumoreffect heeft in onderzoek bij ratten. 3 De polysaccharidecomponenten in Cistanche deserticola kunnen de immuunfunctie van het lichaam versterken, de activering van witte bloedcellen bevorderen, de immuunstatus van het lichaam verbeteren en kunnen ook rechtstreeks inwerken op tumorcellen. Rem de proliferatie, metastase en invasie van tumorcellen. Remt ook angiogenese. Tumorgroei en metastase hebben de ondersteuning nodig van de groei van nieuwe bloedvaten, en de polysaccharidecomponenten in Cistanche kunnen angiogenese remmen, waardoor tumorgroei en metastase worden verminderd.

Klik hier om cistanche te kopen

Menselijke FOXP3-die CD4 plus T-cellen tot expressie brengen, zijn heterogeen in functie, inclusief Treg-cellen en niet-onderdrukkende conventionele T-cellen. Ze kunnen worden gefractioneerd in drie subpopulaties door hun verschillende expressieniveaus van FOXP3 en CD45RA (10) (Fig. 1A): (i) CD45RA plus FOXP3lo naïeve / rustende Treg-cellen [Fractie (Fr). I]; (ii) CD45RA- FOXP3hi effector Treg (Treg) cellen (Fr. II), die terminaal gedifferentieerd en zeer onderdrukkend zijn; en (iii) CD45RA-FOXP3lo niet-Treg-cellen (Fr. III), die geen onderdrukkende activiteit hebben en in staat zijn pro-inflammatoire cytokines uit te scheiden. Na antigene stimulatie, Fr. I naïeve Treg-cellen differentiëren tot Fr. II Treg-cellen, die CTLA sterk tot expressie brengen-4 (10).

Fig. 1. Preferentiële CTLA-4-expressie door FOXP3hi Treg-cellen in melanoomweefsel. (A en B) Representatieve percelen van CD4 plus T-celkleuring (A) en frequenties van elke fractie (B). PBMC's van gezonde donoren (HD, n=5), en PBMC's en TIL's van melanoompatiënten (respectievelijk n=11 en 14) werden onderworpen aan directe kleuring voor CD4, CD45RA en FOXP3. (C en D) Representatieve plots van CCR7- en CD45RA-expressie door CD8 plus T-cellen (C) en samenvatting van elke CD8 plus T-celsubset (D). (E) CTLA-4–uitdrukking van clusters (stippellijn) in PBMC's en TIL's van melanoompatiënten door CyTOF-analyse. viSNE-plots van CD4 plus en CD8 plus T-cellen met heatmaps voor aangegeven markerexpressieniveaus worden getoond (n=2). (F) Alleen oppervlakte- of oppervlakte- en intracellulaire kleuring van CTLA-4 in HD PBMC. (G) Oppervlakte-CTLA-4-expressies door elke cellulaire fractie van TIL's en PBMC's van melanoompatiënten. Betekent ± SEM. *P Kleiner dan of gelijk aan {{20}}.05, **P Kleiner dan of gelijk aan 0.01, ***P Kleiner dan of gelijk aan 0,001, en ****P kleiner dan of gelijk aan 0,0001 volgens eenzijdige ANOVA met post-hoc Tukey's HSD-test.

Hoewel de meeste cellen in Fr. III zijn niet-Treg-cellen en differentiëren niet in Fr. II eTreg-cellen, een circulerende subset van T-folliculaire regulerende cellen, die CXCR5 plus CD45RA− zijn, is opgenomen in Fr. III (11), wat duidt op heterogeniteit van de Fr. III bevolking. Daarentegen, met de aanwezigheid van deze drie FOXP3 plus populaties in het bloed, vertonen de meeste tumoren overheersende infiltratie van Treg-cellen, die effectieve antitumor immuunresponsen bij kankerpatiënten lijken te onderdrukken (12). Deze bevindingen suggereren dat uitputting/reductie van Treg-cellen in tumoren en regionale lymfeklieren een belangrijke rol speelt bij het opwekken en versterken van antitumor immuunresponsen, zoals onlangs is aangetoond met enkele monoklonale antilichamen (mAbs) die specifiek zijn voor de moleculen die specifiek tot expressie worden gebracht door Treg-cellen (13).

CTLA-4 wordt tot expressie gebracht door conventionele T-cellen bij activatie en constitutief door FOXP3 plus CD25 plus CD4 plus Treg-cellen. Het speelt een sleutelrol in Treg-gemedieerde onderdrukking, althans gedeeltelijk, door de expressie van CD80/CD86 te controleren door antigeenpresenterende cellen (APC's) (14-16). Anti-humaan CTLA-4 mAb, dat klinisch effectief is bij de behandeling van melanoom (17, 18), werd aanvankelijk beschouwd als het blokkeerde door CTLA-4 gemedieerde negatieve signalen in geactiveerde effector-T-cellen, waardoor hun geactiveerde toestand in tumorcellen aanvallen. Recente preklinische onderzoeken hebben echter aangetoond dat anti-CTLA-4 mAb FOXP3 plus Treg-cellen kan uitputten, vooral in tumorweefsels, waardoor de tumorimmuniteit wordt vergroot (19-21). Bij mensen is het echter controversieel of CTLA-4 mAb het aantal of de functie van Treg-cellen of effector T-cellen, of beide, beïnvloedt bij het versterken van antitumor immuunresponsen in klinische contexten.

In deze studie hebben we in vivo en in vitro, bij mensen en muizen, de effecten onderzocht van Fc-gemanipuleerde anti-CTLA-4 mAb's op FOXP3 plus Treg-cellen en zelf/tumor antigeen-specifieke CD8 plus T-cellen. We laten zien dat celafbrekend anti-CTLA-4 mAb met hoge antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC)-activiteit antitumor-immuunresponsen kan oproepen, afhankelijk van de niveaus en de kinetiek van CTLA-4-expressie door de twee populaties. De resultaten kunnen worden uitgebreid tot celuitputtende mAb's die gericht zijn op andere celoppervlakmoleculen die zowel Treg- als effector T-cellen (Teff) gewoonlijk op verschillende niveaus en met verschillende kinetiek tot expressie brengen.

Betekenis

Anti-CTLA-4 mAb kan de tumorimmuniteit ondanks CTLA-4-expressie versterken door T-celpopulaties functioneel tegen te werken: geactiveerde effector T-cellen (Teff) en FOXP3 plus CD4 plus Treg-cellen. Hier laten we zien dat anti-CTLA -4 mAb ontworpen om cytotoxische verarmde Treg-cellen te zijn effectief in vitro bij mensen en in vivo bij muizen. Het breidde antigeenspecifieke CD8 plus Teff-cellen uit wanneer de stimulatie van tumorantigeen enkele dagen werd uitgesteld om ze te beschermen tegen doden door het mAb. Anti–CTLA-4 mAb gemodificeerd om een ​​mindere of geen celuitputtende activiteit te vertonen vertoonde dergelijke effecten niet. Deze strategie van differentiële controle van Treg- en Teff-cellen door cytotoxische anti-CTLA -4 mAb om effectieve tumorimmuniteit op te wekken, zal helpen bij het ontwerpen van kankerimmunotherapie gericht op andere moleculen die gewoonlijk tot expressie worden gebracht door Treg- en Teff-cellen.

Auteursbijdragen: DH, A. Tanaka, HN en SS ontworpen onderzoek; DH, A. Tanaka, TK, A. Tanemura, DS, JBW, ELL, KWWT, DA en IK hebben onderzoek gedaan; A. Tanemura heeft nieuwe reagentia/analysetools bijgedragen; DH, A. Tanaka, TK, DS, DA, EWN, IK, HN en SS geanalyseerde gegevens; en DH, A. Tanaka en SS schreven de krant.

Recensenten: MA, Tokyo Medical and Dental University; en SAQ, University College London.

Verklaring belangenverstrengeling: HN ontving een onderzoekssubsidie ​​van Bristol Myers Squibb. SS ontving een onderzoekssubsidie ​​van Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. TK is in dienst van Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., dat enkele van de antilichamen leverde die in dit onderzoek werden gebruikt.

Gepubliceerd onder de PNAS-licentie.

1 Huidig ​​adres: Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Nagoya University, 466-8550 Nagoya, Japan.

2 Huidig ​​adres: Afdeling Immunologie, Moffitt Cancer Center, Tampa, FL 33612.

3 Huidig ​​adres: Division of Cancer Immunology, Exploratory Oncology Research & Clinical Trial Center, National Cancer Center, 277-8577 Kashiwa, Japan.

4 Aan wie correspondentie moet worden gericht. E-mail: shimon@ifrec.osaka-u.ac.jp.

Online gepubliceerd op 26 december 2018.

Resultaten

Accumulatie van CTLA-4–tot expressie brengende, terminaal gedifferentieerde FOXP3hi Treg-cellen in melanoomweefsels.

We hebben eerst de frequentie van verschillende subpopulaties van T-cellen onder tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) bij melanoompatiënten beoordeeld. CD45RA− FOXP3hi eTreg-cellen (Fr. II) waren overwegend (∼10-voudig) verhoogd in verhouding tussen CD4 plus TIL's, vergeleken met CD4 plus T-cellen in perifeer bloed bij gezonde donoren of melanoompatiënten (Fig. 1 A en B ). De frequentie van CD45RA− FOXP3lo Fr. III niet-Treg-cellen namen ook licht toe (∼ tweevoudig) onder CD4 plus TIL's. Daarentegen waren CD45RA plus FOXP3lo-naïeve Treg-cellen (Fr. I) significant verminderd in TIL's tot gemiddeld een kwart van de overeenkomstige fractie in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's).

Onder FOXP3-conventionele CD4 plus T-cellen in TIL's, CD45RA-FOXP3- effector/geheugen CD4 plus T-cellen, die verder zouden kunnen worden ontleed in de CD25 plus (Fr. IV) en de CD25- (Fr. V) populaties (10) , iets (~1,3-voudig) toegenomen, terwijl CD45RA plus FOXP3-naïeve CD4 plus T-cellen (Fr. VI) significant verminderden tot een tiende van die in PBMC's. In de CD8 plus T-celfractie van TIL's, vergeleken met PBMC's van de patiënten of gezonde donoren, was er een significante toename (∼ 1,6- maal) van CD45RA− CCR7− effectorgeheugen-T (TEM)-cellen, met een significante afname van CD45RA plus CCR7 plus naïeve en CD45RA plus CCR7-terminaal gedifferentieerde effectorgeheugencellen (TEMRA) tot respectievelijk de helft en een vijfde van die in PBMC's, en geen significante verandering in CD45RA- CCR7 plus centrale geheugen T (TCM) cellen (Fig. 1 C en D). Bij melanoompatiënten werd ook opgemerkt dat naïeve CD8 plus T-cellen in PBMC's duidelijk (∼14- maal) afnamen in vergelijking met gezonde donoren.

Vervolgens hebben we beoordeeld welke T-celpopulatie CTLA-4 tot expressie bracht in TIL's of PBMC's van melanoompatiënten door middel van cytometrie met een time-of-flight (CyTOF) massaspectrometrische cytometer (Fig. 1E en SI-bijlage, Fig. S1A). De CD4 plus CD45RA-Foxp3hi-cluster van cellen, die Fr. II eTreg-cellen brachten voornamelijk CTLA4 tot expressie in PBMC en TIL, terwijl CD8 plus T-cellen nauwelijks CTLA-4 tot expressie brachten in PBMC of TIL's. Bij muizen werd overheersende CTLA4-expressie door FOXP3 plus Treg-cellen op vergelijkbare wijze waargenomen in de milt en CMS5a-tumorweefsel (SI-bijlage, Fig. S1B). CTLA4 tot expressie gebracht door menselijke Fr. II Treg-cellen bevonden zich meestal in het intracellulaire compartiment en CTLA{18}} op het celoppervlak was beperkt (Fig. 1F). Desalniettemin zijn in TIL's, Treg-cellen en in mindere mate Fr. III niet-Treg-cellen bleken oppervlakte-CTLA -4 op significant hoge niveaus tot expressie te brengen (Fig. 1G en SI-bijlage, Fig. S2). TIL CD8 plus TCM- en TEM-cellen brachten ook een hoger niveau van oppervlakte-CTLA-4 tot expressie in vergelijking met een van de circulerende T-celfracties, hoewel Treg-cellen een veel hogere expressie vertoonden bij melanoompatiënten (Fig. 1G en SI-bijlage, Fig. S2).

Alles bij elkaar genomen, zijn de hoofdkenmerken van menselijke melanoomweefsels een duidelijke toename en afname van respectievelijk Treg-cellen en naïeve Treg-cellen, en een duidelijke toename van effector/geheugen CD8 plus T-cellen met een vermindering van naïeve CD8 plus T-cellen. Deze Treg-cellen en CD8 plus T-cellen in TIL's brengen CTLA-4 tot expressie op het celoppervlak, met een hogere expressie door de eerste dan door de laatste. In tegenstelling tot TIL eTreg-cellen, zijn circulerende eTreg-cellen bij melanoompatiënten significant lager in het niveau van oppervlakte-CTLA4-expressie, wat suggereert dat ze mogelijk minder worden beïnvloed door anti-CTLA-4 mAb-behandeling.

Vermindering van zowel Treg-cellen als antigeenspecifieke CD8-plus-T-cellen door in-vitrobehandeling met celafbrekende anti-CTLA{3}} mAb en gelijktijdige antigeenstimulatie.

Om na te gaan of de antitumoreffecten van anti-CTLA-4 mAb afhankelijk zouden zijn van het vermogen om Treg-cellen uit te putten door ADCC, hebben we het Fc-gedeelte van anti-CTLA-4 IgG1 mAb (kloon MDX{{3 }}, ipilimumab), dat een matige ADCC-activiteit bezat, om zijn affiniteit voor Fc RIIIa (CD16a), een activerend Fc R dat tot expressie wordt gebracht door NK-cellen, monocyten/macrofagen en andere cellen, te veranderen (22) (Fig. 2A). Een aldus gegenereerd anti-CTLA-4 mAb met een hoge ADCC-activiteit, dat we asymmetrisch re-engineeringtechnologie-Fc-domein (ART-Fc) noemden, bezat verschillende aminozuursubstituties op elke zware keten (23); dat wil zeggen, L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A-substituties in het ene Fc-gebied met zware keten en D270E/K326D/A330M/K334E-substituties in het andere. Het gereconstrueerde mAb vertoonde een 1,{24}}voudig hogere bindingsaffiniteit voor humaan Fc RIIIa dan ongemodificeerd mAb zonder de affiniteit voor remmend Fc RIIb te verhogen. We genereerden ook een anti-CTLA-4 mAb dat nauwelijks bindt aan FcR's, dat we stille-Fc anti-CTLA-4 noemden, door aminozuursubstituties; dat wil zeggen, L235R, G236R en S239K in het Fc-gebied van beide zware ketens. Vergeleken met niet-gemodificeerde of stille Fc-anti-CTLA-4 mAb, vertoonde ART-Fc een veel hogere in vitro cytotoxiciteit voor CTLA-4- tot expressie brengende ovariumcellen van Chinese hamsters (CHO) in aanwezigheid van PBMC's van gezonde donoren , met verhoogde cytotoxiciteit door langere incubatie (Fig. 2B). Evenzo doodde ART-Fc anti-CTLA -4 mAb effectief vers bereide Fr. II Treg-cellen en, in mindere mate, Fr. III niet-Treg of Fr. I naïeve Treg-cellen, terwijl IgG1 (ipilimumab) of stil-Fc-mAb nauwelijks dodende activiteit vertoonde (Fig. 2C).

Vervolgens hebben we de effecten van deze Fc-gemanipuleerde mAb's op in vitro antigeenspecifieke expansie van CD8 plus T-cellen beoordeeld door PBMC's van HLA-A * 0201 te stimuleren - gezonde donoren of melanoompatiënten tot expressie brengen gedurende 9 dagen met verschillende peptiden, bijvoorbeeld: afgeleid van Melan-A/MART-1, een zelf/tumor-antigeen dat tot expressie wordt gebracht door normale melanocyten en sommige melanoomcellen (24); en NY-ESO-1, kanker/testisantigeen dat tot expressie wordt gebracht door verschillende soorten kankercellen en menselijke kiembaancellen (25), cytomegalovirus (CMV) of influenzavirus (griepvirus). Deze in vitro peptidestimulatie, bijvoorbeeld door Melan-A-peptide, handhaafde de hoge expressie van CTLA4 door Treg-cellen (Fig. 2D en SI-bijlage, Fig. S3). De peptidestimulatie alleen breidde ook peptide-specifieke tetrameer (Tet) plus CD8 plus T-cellen uit, die hogere niveaus van CTLA-4 tot expressie brachten, vooral op het celoppervlak, in vergelijking met Tet-cellen (Fig. 2 E, F, en ik). Wanneer ART-Fc anti-CTLA-4 mAb aanwezig was vanaf het begin van de peptidestimulatie van PBMC's van gezonde donoren of melanoompatiënten, was de verhouding van Treg-cellen die CTLA-4 tot expressie brachten ten opzichte van CD4 plus T-cellen aanzienlijk verminderd op een dosisafhankelijke manier, terwijl silent-Fc mAb dit effect niet kon laten zien (Fig. 2 D en G en SI Appendix, Fig. S4 en S5).

De reductie van Treg-cellen ging echter niet gepaard met de expansie van antigeenspecifieke CD8 plus T-cellen; de behandeling veroorzaakte eerder een sterke vermindering van de verhouding van Tet plus CD8 plus T-cellen tussen CD8 plus T-cellen (Fig. 2H). Bij deze in vitro stimulaties vertoonde ongewijzigd IgG1 of stille-Fc anti-CTLA-4 mAb geen significante eTreg-uitputtende activiteit (Fig. 2I). De mate van eTreg-celreductie door deze mAb's was inderdaad gecorreleerd met de reductie van antigeenspecifieke CD8 plus T-cellen, ongeacht het stimulerende antigeen, bijvoorbeeld Melan-A of CMV-peptide (Fig. 2I).

Dus terwijl Treg-cellen constitutief CTLA-4 tot expressie brengen, vooral intracellulair CTLA-4, breidt antigeenstimulatie CD8 plus T-cellen uit die hoge niveaus van CTLA-4 tot expressie brengen, vooral op het celoppervlak. ART-Fc anti–CTLA-4 mAb met hoge ADCC-activiteit kan daarom niet alleen CTLA-4 plus Treg-cellen uitputten, maar ook antigeen-geactiveerde CTLA-4 plus CD8 plus T-cellen . Deze effector CD8 plus T-celdepletie kan een immuunversterkend effect van eTreg-celdepletie in immuunresponsen in vitro compenseren.

Fig. 2. Gelijktijdige in vitro peptidestimulatie met ART-Fc anti-CTLA-4 mAb beperkt antigeenspecifieke CD8 plus T-celresponsen. (A) Samenvatting van aminozuursubstituties gemaakt aan het Fc-gedeelte van anti-humaan CTLA-4 IgG1-mAb (kloon MDX-010, ipilimumab) om ART-Fc- of stille-Fc-mAb's te genereren, en hun affiniteiten tot remmend Fc RIIb of activerend Fc RIIIa. Silent-Fc mAb-affiniteit lag onder de detectielimiet van de BIACORE-assay. (B) ADCC-activiteit van verschillende anti-CTLA4-mAb's tegen menselijke CHO-cellen die CTLA-4 tot expressie brengen. Anti-CTLA-4 mAb's (ART, ADCC-versterkte anti-CTLA-4 ART-Fc; IgG1, conventionele ongewijzigde anti-CTLA-4 IgG1; Silent, Fc-regio-geïnactiveerde anti- CTLA-4 silent-Fc) werden geïncubeerd met CHO-cellen en HD PBMC's (n=3) bij een E/T-verhouding van 50:1. Betekent ± SEM. Sterretjes geven significante verschillen aan tussen elk antilichaam en stil-Fc bij respectieve concentraties voor {{30}}uur (zwart) of 24-uur (rood) kweken. (C) ADCC-activiteit voor elke cellulaire fractie van CD4 plus en CD8 plus T-cellen van PBMC's door ART-Fc, IgG1 of stille-Fc anti-CTLA-4 mAb's (n=4 of 5). Frequenties van dode cellen onder vooraf gelabelde CTV-cellen na de {{40}}h-kweek zijn aangegeven. (D) CTLA-4 uitdrukking door Fr. II Treg-cellen na 9 dagen Melan-A-peptidestimulatie en 1 ug/ml ART-Fc-, silent-Fc- of IgG1-anti-CTLA-4 mAb-behandeling voor hele PBMC's (n {{50 }}). (E en F) Oppervlakte CTLA-4 expressies door Tet plus en Tet− CD8 plus T-cellen na aangegeven peptidestimulaties. Representatieve histogrammen (E) en samenvatting van gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) (F) (Melan-A, n=9; CMV, n=9; Griep, n=3; ESO{{ 57}}, n=4). (G en H) Representatieve percelen en frequenties van Fr. II eTreg-cellen (G) en antigeenspecifieke CD8 plus T-cellen (H) van HD's (n=6) of melanoompatiënten (n=5) na de kweek met aangegeven peptide en 1 ug/ml ART -Fc anti–CTLA-4 mAb zoals in D. (I) Kwantificering van de frequentie van Treg-cellen (bovenste) en Tet plus CD8 plus T-cellen (onderste) na 9 dagen van Melan-A- of CMV-antigeenstimulatie om HD PBMC's met aangegeven anti-CTLA-4 mAb's in G en H. Betekent ± SEM. De afgebeelde significantie tussen de twee groepen werd berekend met behulp van gepaarde t-test, eenrichtings-ANOVA of tweerichtings-ANOVA met post-hoc Tukey's HSD-test. *P Kleiner dan of gelijk aan 0,05, **P Kleiner dan of gelijk aan 0,01, ***P Kleiner dan of gelijk aan 0,001, en ****P Kleiner dan of gelijk aan 0,0001.

Robuuste uitbreiding van antigeenspecifieke CD8 plus T-cellen door eTreg-celdepletie vóór antigeenstimulatie.

. We probeerden vervolgens CTLA-4 plus Treg-cellen uit te putten vóór antigeenstimulatie om te voorkomen dat antigeen-geactiveerde CTLA-4-expressie CD8 plus T-cellen worden gedood door anti-CTLA-4 mAb's. We kweekten hele PBMC's van gezonde donoren of melanoompatiënten in aanwezigheid van ART-Fc anti-CTLA-4 mAb gedurende 5 dagen zonder antigeenstimulatie, verwijderden het mAb, stimuleerden vervolgens de cellen met verschillende peptiden gedurende 8 dagen en analyseerden ze op de verhouding van Treg-cellen en Tet plus CD8 plus T-cellen tussen respectievelijk CD4 plus T-cellen of CD8 plus T-cellen (figuur 3A). De verhouding van FOXP3hi Treg-cellen was significant verminderd binnen 5 dagen door de ART-Fc-voorbehandeling (Fig. 3A en SI-bijlage, Fig. S6), en op een laag niveau gehouden tijdens daaropvolgende peptidestimulatie (Fig. 3B), wat aangeeft dat Treg cellen waren niet volledig hersteld tijdens de antigeenstimulatieperiode. Deze ART-Fc-voorbehandeling in combinatie met antigeenstimulatie induceerde een robuuste expansie van Melan-A-specifieke CD8 plus T-cellen van PBMC's van gezonde donoren en NY-ESO-1-specifieke CD8 plus T-cellen van PBMC's van patiënten bij wie melanoomweefsel tot expressie kwam NY-ESO-1 (Afb. 3C). CMV-specifieke CD8 plus T-cellen werden niet veel beïnvloed door ART-Fc-gemedieerde Treg-uitputting. In tegenstelling tot ART-Fc veranderde stille-Fc anti-CTLA -4 mAb de frequentie van Treg-cellen niet en kon Tet plus CD8 plus T-cellen niet uitbreiden ongeacht de antigeensoort (Fig. 3D).

Een van de verschillende onderdrukkingsmechanismen die door Treg-cellen worden gebruikt, is CTLA-4–afhankelijke downregulatie van CD80- en CD{3}}-expressie door dendritische cellen (DC's) (14, 15). Om mogelijke bijdragen van dit mechanisme aan de expansie van eigen/tumor antigeen-specifieke CD8 plus T-cellen na in vitro ART-Fc anti-CTLA-4 mAb-behandeling te onderzoeken, hebben we CD80- en CD{11}}-expressie beoordeeld door DC's, die fenotypisch werden gedefinieerd als Lin-1− CD11c plus HLA-DR plus, in PBMC's van gezonde donoren. Zowel CD80- als CD86-expressie vertoonde duidelijke opwaartse regulatie in de met ART-Fc voorbehandelde groep, in tegenstelling tot ongewijzigde CD80/CD86-expressie in een ongewijzigde IgG1- voorbehandelde, stille-Fc -voorbehandelde of onbehandelde groep (Fig. 3E). Bovendien had de mate van Fc R-bindingsaffiniteiten van mAbs een goede correlatie met hun Treg-uitputtingsactiviteit en ook met Tet plus CD8 plus T-cel-inducerende activiteit (Fig. 3F). Omdat loutere blokkade van CTLA-4 door silent-Fc CD80/86 niet verhoogde, gaven de resultaten aan dat Treg-depletie door ART-Fc DC's activeerde, hoewel er een mogelijkheid bestaat dat ART-Fc zelf dragen bovendien bij aan de activering van DC's via binding met hoge affiniteit aan hun activerende Fc-receptoren.

Alles bij elkaar geven deze resultaten aan dat Treg-uitputting door ART-Fc anti-CTLA-4 mAb enkele dagen voor blootstelling aan antigeen het doden van CTLA-4 plus antigeen-geactiveerde CD8 plus T-cellen door het antilichaam kan besparen, breid ze, althans gedeeltelijk, uit door CD80/CD86-expressie door APC's te verbeteren.

Fig. 3. Predepletie van Treg-cellen met behulp van ART-Fc anti-CTLA-4 mAb verbetert zelf-/tumorantigeenspecifieke CD8 plus T-celresponsen. (A-D) Antigeen-specifieke CD8 plus T-cellen werden geïnduceerd uit hele PBMC's van HD's (n=7) of patiënten (n=5) ​​na 5 dagen voorbehandeling met ART-Fc anti-CTLA{ {11}} mAb. (A) Schema van het experiment en representatieve FOXP3- en CD45RA-kleuring van CD4 plus T-cellen op dag −5 en dag 0 van het experiment. Samenvatting van Fr. II eTreg-frequenties op dag 0 (Onder). (B en C) Representatieve FOXP3-kleuring van CD4 plus T-cellen (B) en antigeenspecifieke CD8 plus T-cellen (C) met of zonder ART-Fc-voorbehandeling voor elk peptide na de kweek. Samenvatting van Treg en antigeenspecifieke CD8 plus T-celfrequenties na de kweek (onder). (D) Samenvatting van Fr. II eTreg en Tet plus CD8 plus T-celfrequenties met silent-Fc anti-CTLA-4 mAb-voorbehandeling in plaats van ART-Fc zoals in A–C. (E) Expressieniveaus van CD80 en CD86 door Lin-1−CD11c plus HLA-DR plus DC's na 5 dagen Melan-A-stimulatie met de voorbehandeling van geïndiceerde anti-CTLA -4 mAbs (n=6). Getallen op histogrammen tonen MFI. (F) Samenvatting van Treg en Tet plus CD8 plus T-celfrequenties na voorbehandeling met geïndiceerde anti-CTLA-4 mAb's gevolgd door Melan-A26-35-stimulatie zoals in A-C. Betekent ± SEM. Afgebeelde significantie tussen de twee groepen werd berekend met behulp van gepaarde t-test. *P Kleiner dan of gelijk aan 0,05.

CTLA-4–Gemedieerde Treg-depletie vóór tumorantigeenvaccinatie verbetert antitumorreacties bij muizen.

Om de in vitro bevindingen met menselijke PBMC's en anti-menselijke CTLA-4 mAb's bij muizen te valideren, hebben we mAb's gegenereerd met een hoge of lage ADCC en antilichaamafhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP)-activiteit van anti-muis CTLA{{4 }} mAb (kloon UC10) van IgG2a-isotype (hierna mIgG2a genoemd) door aminozuursubstitutie in het Fc-domein (Fig. 4A). De mutatie S239D in beide zware ketens verhoogde de affiniteit voor Fc RIV van muis met een factor zeven (mFa55 mIgG2a-variant), terwijl L235R-, G236R- en S239K-mutaties in beide zware ketens ervoor zorgden dat ze niet-bindend waren voor Fc R's van muis (mFa31 mIgG2a-variant); de eerste heette muis ADCC / ADCP-enhanced-Fc (verbeterd), de laatste muis silent-Fc (mSilent) mAb. Om de antitumoractiviteit van deze Fc-gemodificeerde anti-muis-CTLA-4 mAb's in combinatie met tumorantigeenvaccinatie te vergelijken, hebben we subcutaan geïnoculeerd in BALB/c-muizen CMS5a fibrosarcoomcellen die humaan NY-ESO{24}}-antigeen tot expressie brengen, en op dag 9, toen de tumor zich vestigde, behandelde de muizen met 100 µg van elk mAb en vaccineerde ze op dezelfde dag met NY-ESO-1-peptide (dag 9; we noemen het protocol hierna "gelijktijdige behandeling") of 3 d later (dag 12; hierna "Ab voorbehandeling") (fig. 4B). Ab-voorbehandeling met mEnhanced mAb was effectiever dan gelijktijdige behandeling of voorbehandeling met mIgG2a of mSilent mAb bij het vertragen van tumorgroei; de effecten van de laatste twee mAb's op tumorgroei waren laag en niet significant verschillend tussen Ab-voorbehandeling en gelijktijdige behandeling (Fig. 4C). De overleving was significant beter bij muizen die waren voorbehandeld met mEnhanced mAb, en ook bij muizen met gelijktijdige behandeling of voorbehandeling met mIgG2a, hoewel beide manieren van behandeling met mIgG2a bij de meeste muizen geen tumorregressie veroorzaakten (Fig. 4 C en D).

Fig. 4. Voorbehandeling met ADCC/ADCP-versterkte anti-CTLA-4 mAb induceert sterke antitumoreffecten bij muizen. (A) Samenvatting van aminozuursubstituties gemaakt aan het Fc-gedeelte van anti-muis CTLA-4 IgG2a mAb (kloon UC10; mIgG2a) om ADCC/ADCP-versterkte anti-muis-CTLA te genereren{{ 10}} (verbeterde) of stille-Fc anti-muis–CTLA-4 (mSilent) mAb's, en hun affiniteiten met muis Fc RIV worden getoond. De mSilent mAb-affiniteit lag onder de detectielimiet van de BIACORE-assay. (B– D) Schema van experiment (B). Muizen werden op dag {{40}} uitgedaagd met 2 × 106 CMS5a fibrosarcoom dat humaan NY-ESO tot expressie brengt-1 en werden onbehandeld gelaten of behandeld met mEnhanced, mIgG2a of stil anti-muis–CTLA-4 mAb op dag 9. Vaccinatie van NY-ESO-181–88 peptiden gemengd met CFA werd uitgevoerd op dezelfde dag (dag 9, gelijktijdige behandeling) of 3 dagen later (dag 12, Ab voorbehandeling). Tumorgroei van elke muis met een vetgedrukte lijn die het gemiddelde van elke behandelingsgroep aangeeft (C) (n=8–13 per groep). Samenvatting van de gemiddelde tumorgroei van elke behandelingsgroep (D, links). Sterretjes geven P-waarden aan tussen de mEnhanced mAb-voorbehandelingsgroep door tweeweg-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Samenvatting van het overlevingspercentage (D, rechts) van elke behandelingsgroep. P-waarden tussen de overleving van elke groep en de overleving van de controlegroep met alleen vaccin werden berekend door middel van een log-rank-test. Overlijdensgebeurtenis komt overeen met tumorlengte groter dan of gelijk aan 200 mm of overlijden van de muis. *P Kleiner dan of gelijk aan 0,05, **P Kleiner dan of gelijk aan 0,01, ***P Kleiner dan of gelijk aan 0,001, en ****P Kleiner dan of gelijk aan 0,0001.

De verbeterde mAb-voorbehandeling resulteerde ook in een significante toename van het aantal tumor-infiltrerende CD8 plus T-cellen en de CD8 / Treg-verhouding in TIL's, hoewel het percentage FOXP3 plus cellen onder CD4 plus T-cellen enigszins toenam (Fig. 5 A- C). Bovendien, terwijl de frequentie van NY-ESO-1-peptidespecifieke CD8 plus TIL's niet statistisch verschilde tussen de muizen die met elk mAb werden behandeld of tussen voorbehandeling en gelijktijdige behandeling, waren de antigeenspecifieke CD8 plus TIL's van voorbehandeld met versterkt mAb muizen vertoonden, vergeleken met andere groepen, significant meer actieve IL-2- en IFN-productie na in vitro herstimulatie met NY-ESO-1-peptide (Fig. 5 D en E). Bovendien namen effectorgeheugen CD8 plus T-cellen gedefinieerd als de CD44high CD62Llow-populatie significant toe onder NY-ESO -1-specifieke CD8 plus TIL's in verbeterde met mAb voorbehandelde muizen (Fig. 5 F en G).

Alles bij elkaar genomen was mEnhanced mAb-voorbehandeling het meest effectief bij het opwekken van tumorimmuniteit, gevolgd door voorbehandeling met mIgG2a, dat enige ADCC-activiteit had, terwijl mSilent mAb veel minder effectief was. De resultaten geven aan dat voorbehandeling van tumordragende muizen met ADCC/ADCP-versterkte anti-CTLA{3}} mAb gevolgd door tumorantigeenvaccinatie effectief antitumor immuunresponsen in vivo kan opwekken.

Discussie

De belangrijkste bevindingen in dit rapport zijn: (i) terminaal gedifferentieerde, sterk onderdrukkende eTreg-cellen zijn overvloedig aanwezig in tumorweefsels en brengen oppervlakte-CTLA-4 op hogere niveaus tot expressie dan tumor-infiltrerende CD8 plus T-cellen; (ii) anti-CTLA-4 mAb met hoge ADCC-activiteit is in staat CTLA-4hoge eTreg-cellen en CTLA-4 plus effector CD8 plus T-cellen uit te putten/te verminderen; en (iii) celafbrekend anti-CTLA-4 mAb kan effectieve tumorimmuniteit opwekken en versterken wanneer het antilichaambehandelingsregime zo is ontworpen dat het geen effect heeft op CTLA-4 plus effector CD8 plus T-cellen, bijvoorbeeld door het veranderen van de timing van Treg-celdepletie en vaccinatie tegen kankerantigeen.

De ADCC-activiteit van anti-CTLA-4 mAb is een belangrijke bepalende factor voor de effectiviteit van eTreg-reductie en de resulterende expansie van tumor-reactieve CD8 plus T-cellen. Ter ondersteuning van het idee hebben we aangetoond dat anti-CTLA-4 mAb (ART-Fc) met een verhoogde ADCC-activiteit (en/of ADCP-activiteit bij muizen) in staat was om antitumor immuunresponsen in vitro bij mensen en in vivo bij mensen te versterken. muizen door CTLA uit te putten-4–tot expressie brengende Treg-cellen. Anti-CTLA4 mAb's (silent-Fc) gemodificeerd om veel minder of geen ADCC-activiteit te vertonen, konden dergelijke antitumoractiviteit niet vertonen, zelfs als ze dezelfde specificiteit bezaten voor een epitoop van het CTLA{8}}-molecuul. Het blijft bij mensen onduidelijk of het antitumoreffect van ipilimumab met IgG1 Fc-gedeelte wordt toegeschreven aan de blokkade van het CTLA4-molecuul of de uitputting van cellen die CTLA-4 tot expressie brengen door ADCC. Bij muizen werd aangetoond dat een versterking van de antitumorimmuniteit door een anti-CTLA -4 mAb depletie van tumor-infiltrerende Treg-cellen door Fc R-gemedieerde ADCC vereiste (19-21, 26, 27). Evenzo bleken antilichamen tegen GITR-, OX40- en CD25-moleculen, waarin tumor-infiltrerende Treg-cellen de hoogste hoeveelheden tot expressie brengen, afhankelijk te zijn van ADCC-gemedieerde uitputting van Treg-cellen bij tumorafstoting (19, 26, 28). Er werd ook gemeld dat behandeling met ipilimumab bij melanoompatiënten de FOXP3 plus Treg-cellen in de tumorweefsels significant verminderde, vooral bij klinische responders (29).

Bovendien heeft een recent rapport aangetoond dat, onder melanoompatiënten met een hoge tumormutatielast, degenen die genetisch een hoge-affiniteitsvariant van Fc RIIIa met verbeterde ADCC (V158-variant, in tegenstelling tot de F158 lage-affiniteitsvariant) hadden, significant beter presteerden. klinische respons op behandeling met ipilimumab en betere algehele overleving (27). Deze bevinding ondersteunt het idee dat anti-CTLA-4 mAb met betere Treg-depletie-activiteit mogelijk effectiever is dan ipilimumab bij immunotherapie bij kanker. Het is dus waarschijnlijk dat ART-Fc anti-CTLA4 mAb, dat een hoge affiniteit heeft voor de V158-variant (KD=3.7 × 10−10 M, vergeleken met 3,1 × 10−6 M voor ipilimumab of IgG1) , kan een betere klinische werkzaamheid hebben bij kankerimmunotherapie door Treg-cellen uit te putten. Alles bij elkaar geven deze bevindingen bij mensen en muizen aan dat hoog-ADCC/ADCP anti-CTLA-4 mAb effectief kan zijn bij het opwekken en versterken van tumorimmuniteit door Treg-cellen uit te putten.

Fig. 5. Ag-specifieke CD8 plus T-celresponsen geïnduceerd in tumordragende muizen door voorbehandeling met ADCC/ADCP-versterkte anti-CTLA-4 mAb. (A – G) TIL's uit Fig. 4 werden 19 dagen na tumorimplantatie geanalyseerd (n=4 –6 per groep). Het aantal geïnfiltreerde T-cellen per gram tumor (A). CD8/Treg-celverhouding (B). Frequentie van Foxp3 plus Treg-cellen onder CD4 plus T-cellen (C). Representatieve grafieken van IL-2 plus IFN- plus CD8 plus T-cellen (D). Cytokineproductie werd gemeten door TIL's opnieuw te stimuleren met ESO-181–88-peptiden in vitro gedurende 5 uur. Samenvatting van Tet plus CD8 plus T-cellen in de tumor, en IL{{20}} plus IFN- plus CD8 plus T-cellen in D na de herstimulatie (E). Representatieve plots (F) en samenvatting (G) van CD44- en CD62L-expressies door NY-ESO-1-Tet plus CD8 plus T-cellen in de tumor van elke behandelingsgroep. Gegevens werden verkregen uit drie onafhankelijke experimenten. P-waarden tussen Naïeve of EM CD8 plus T-celsubsets van elke aandoening. Betekent ± SEM. *P Kleiner dan of gelijk aan 0.05, † P Kleiner dan of gelijk aan 0.05, **P Kleiner dan of gelijk aan 0,01, ††P Kleiner dan of gelijk aan 0,01, en ***P Kleiner dan of gelijk aan 0,001 door tweeweg-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest.

Materialen en methodes

Donor monsters.

Perifere bloedmonsters werden verkregen van gezonde individuen of patiënten met stadium III tot IV melanoom. PBMC's werden geïsoleerd door dichtheidsgradiënt met Ficoll-Paque (GE Healthcare). TIL's werden verkregen uit weggesneden melanoomweefsels. De tumor werd fijngehakt en eencellige suspensies gegenereerd na zachte MACS-dissociatie (Miltenyi) werden bereid door te filteren door een 40-μm-celzeef. Alle donoren hebben voorafgaand aan de bemonstering schriftelijke geïnformeerde toestemming gegeven volgens de Verklaring van Helsinki. De huidige studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Osaka.

CyTOF-analyse.

TIL's en splenocyten van tumordragende muizen werden verrijkt voor CD3-plus-cellen en gekleurd met 198-cisplatine voor discriminatie van dode cellen en een reeks antilichamen, waaronder de volgende metaal-geconjugeerde antilichamen: 172Yb-CD4 (RM4-5 ), 168Er-CD8 (53-6.7), 164Dy-CTLA-4 (UC-10), 158GdFOXP3 (FJK-16s). Voor menselijke PBMC's en TIL's werden celsuspensies voorzien van een streepjescode door middel van anti-CD45-antilichamen met verschillende metaalconjugaten, zoals eerder beschreven (35), voordat ze werden gekleurd met 198-cisplatine voor discriminatie van dode cellen en vervolgens met antilichaamkleuring met het volgende paneel. Metaal-geconjugeerde antilichamen werden verkregen van Fluidigm of Maxpar Antibody Labeling kit (Fluidigm) werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant om gezuiverde antilichamen te conjugeren: 89Y-CD45 (kloon: HI30; Fluidigm), 115In-CD45 (HI30; Biolegend), 175Yb- CD45 (HI30; Biolegend) antilichamen werden gebruikt voor het coderen van verschillende monsters; CLA-FITC (HECA-452; BD), CCR8-PE (L263G8; Biolegend), CXCR5-biotine (RF8B2; BD), eVolve 605 (114 cd)-CD8a (RPA -T8; eBioscience), 139La-CD123 (6H6; Biolegend), 141Pr-CCR6 (11A9; Fluidigm), 142Nd-CD14 (M5E2; Biolegend), 144Nd-FITC (CLA) (FIT22; Fluidigm), 145NdCD4 (RPA-T4 ; Fluidigm), 148Sm-CD20 (2H7; Biolegend), 149Sm-CCR4 (205410; Fluidigm), 150Nd-SAV (CXCR5) (1D4-C5; Fluidigm), 151Eu-ICOS (C398.4A; Fluidigm) , 152Sm-CD69 (FN50; Biolegend), 153Eu-CD45RA (HI100; Fluidigm), 154Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R&D-systemen), 156Gd-anti-PE (CCR8) ( PE001; Fluidigm), 158Gd-CD27 (L128; Fluidigm), 159TbCD19 (HIB19; Biolegend), 160Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm), 164Dy-CD95 (DX2; Fluidigm), 165Ho- CD45RO (UCHL1; Fluidigm), 166Er-CD279 (PD-1) (EH12.2H7; Biolegend), 167Er-PDL1 (29E.2A3; Biolegend), 169Tm-CD25 (IL-2R) ( 2A3; Fluidigm), 171Yb-CD11c (3.9; Biolegend), 172YbCD38 (HIT2; Fluidigm), 173Yb-TIGIT (MBSA43; eBioscience), 174Yb-HLA-DR (L243; Fluidigm), 176Yb-CD127 (IL-7R) (A019D5; Fluidigm), 209Bi-CD11b (ICRF44; Fluidigm), 146Nd-Helios (22F6; Biolegend), 161Dy–CTLA-4 (14D3; Fluidigm), 162Dy-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) en 168Er-Ki-67 (Ki-67; Fluidigm).

Menselijke cellen en muizencellen werden gefixeerd met eBioscience Foxp3 / transcriptiefactor-kleuringsbuffers (ThermoFisher) vóór intracellulaire kleuring. Gekleurde cellen werden vervolgens overnacht opnieuw gesuspendeerd in 2 procent PFA met 191/193-iridium DNA-intercalator (Fluidigm), daarna gewassen en opnieuw gesuspendeerd in Maxpar-water (Fluidigm) en EQ-kralen met vier elementen (Fluidigm) onmiddellijk vóór de analyse met Helios CyTOF systeem (Fluidigma). Genormaliseerde gegevens werden geanalyseerd met Cytobank Premium.

Stimulatie van antigeenspecifieke CD8 plus T-cellen.

Hele PBMC's van gezonde individuen en melanoompatiënten werden gestimuleerd met 10 μM korte peptiden specifiek voor HLA-A * 0201 (Operon Biotechnology) gedurende 8-9 d: Melan-A26-35 (EAAGIGILTV), CMV495-503 (NLVPMVATV), Flu58 –66 (GILGFVFTL), of NY-ESO1157–165 (SLLMWITQC) (12, 22). Om het effect van anti-CTLA-4 mAb's met verschillende ADCC's te bepalen, werd een van de volgende mAb's aan de kweek toegevoegd met 1 ug/ml (tenzij anders aangegeven) op dezelfde dag of 5 dagen vóór antigeenstimulatie: ADCC -enhanced anti-human–CTLA-4 IgG1 (MDX-010-ART-Fc), conventioneel ongewijzigd anti-CTLA-4 IgG1 (MDX-010-IgG1) of silent-Fc anti-CTLA-4 IgG1-antilichamen (MDX-010-silent-Fc): Alle mAb's zijn vriendelijk geleverd door Chugai Pharmaceutical. De helft van het medium werd elke 3 dagen vervangen door vers medium met 10 E/ml IL-2 en 40 ng/ml IL-7.

Test van lactaatdehydrogenase-afgifte met menselijke CTLA-4–expressie van CHO-cellen.

Er werd een lactaatdehydrogenase (LDH)-afgiftetest uitgevoerd om de ADCC-activiteit in PBMC's te bepalen. De CHO DG44-hCTLA4-cellen (van Chugai Pharmaceutical) werden uitgezaaid op 96-putjes met ronde bodem (1 x 104 cellen per putje) en gedurende 15 minuten geïncubeerd met verschillende concentraties mAb's. PBMC's verkregen van gezonde donoren werden vervolgens aan de kweek toegevoegd met een effector-tot-doel (E∕T)-verhouding van 50:1. Cellen werden geïncubeerd bij 37 graden, 5 procent CO2 gedurende 6 of 24 uur, 100 μl van het supernatant van elk putje werd verzameld en de absorptie van 492 nm en 630 nm werd gemeten met behulp van Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek Instruments). De LDH-afgifte werd als maximaal beschouwd na incubatie van de cellen in 1 procent Nonidet P-40-oplossing. De cytotoxiciteit (%) werd bepaald uit de formule; (AC)∕(BC) × 100, waarbij A, B en C respectievelijk de LDH-afgifte van elk experiment, de maximale LDH-afgifte en de achtergrond-LDH-afgifte vertegenwoordigen. Alle experimenten werden in tweevoud uitgevoerd.

ADCC-test met vers geïsoleerde menselijke PBMC.

PBMC's van gezonde donoren werden FACS gesorteerd voor elke fractie van T- en Treg-cellen werden vooraf gelabeld met CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher) en gekweekt met niet-T-cellen, als effectorcellen, bij een doel-tot-effectorverhouding van 1:50. Vervolgens werd 1 ug/ml van het geïndiceerde anti-CTLA–4 mAb toegevoegd aan 10 procent humaan AB-serum met RPMI1640-medium met 5 IE/ml IL-2. Na 24- uur kweken bij 37 graden werd de frequentie van dode cellen, aangegeven door LIVE/DEAD fixeerbare kleuring (ThermoFisher), onder CTV plus cellen beoordeeld door FACS.

Muizentumorexperimenten.

BALB/c-muizen van zes tot 7- weken oud werden gekocht bij CLEA Japan en onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden. Muizen werden subcutaan uitgedaagd met 2 × 106 CMS5a-NY-ESO-1. Negen dagen na de tumorimplantatie kregen muizen intraveneus 100 µg anti-muis-CTLA4-mAb (UC-10-kloon; mIgG2a, mEnhanced of mSilent, van Chugai Pharmaceutical). mEnhanced-variant (mFa55 mIgG2a-variant) werd gegenereerd door S239D-mutatie in het CH2-domein en vertoont verbeterde bindingsaffiniteit voor muis Fc RIV met ongeveer zevenvoudig vergeleken met wildtype mIgG2a. Muizen werden behandeld met vaccinatie van 100 ug ESO-181–88 peptiden (Operon Biotechnology) gemengd met 200 μl CFA/PBS (verhouding 1:1) op dezelfde dag (dag 9, gelijktijdige behandeling) of 3 d later (dag 12, Ab-voorbehandeling) subcutaan. De tumorgrootte werd elke 3-4 dagen gemeten. Experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Review Board en uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Universiteit van Osaka.

Flowcytometrie.

Zoals eerder beschreven (12, 23), werden in vitro gegenereerde antigeenspecifieke CD8 plus T-cellen gekleurd met PE-gelabeld Melan-A, CMV of Flu-tetrameer (TC Matrix) of PE-gelabeld NY-ESO-1 tetrameer (MBL) gedurende 10 minuten bij 37 graden en vervolgens gekleurd met verschillende oppervlakte-mAb's. Voor de kleuring van oppervlakte-CTLA-4 in deze studie werd een gebiotinyleerd-anti-menselijk CD152-antilichaam (kloon BNI3; BD Biosciences) gedurende 15 minuten bij 4 graden gebruikt met andere antilichamen tegen oppervlaktemoleculen. Na het wassen voegden we APC-streptavidine (Biolegend) toe, ook bij 4 graden gedurende 15 minuten, om verkleuring van CTLA{20}}-moleculen die naar het oppervlak worden geëxternaliseerd te voorkomen na langdurige kleuring bij 37 graden. Deze kleuringsprocedures werden uitgevoerd vóór fixatie en permeabilisatie, zoals beschreven in onze vorige studie (24).

Intracellulaire kleuring van FOXP3 werd uitgevoerd met behulp van de FOXP3 Transcription Factor Staining Buffer-set (eBioscience). De volgende antilichamen met aangegeven fluorescerende labels werden gebruikt voor het kleuren van menselijke cellen: PerCP/Cy5.5-CCR7 (150503; BD Biosciences), FITC-CD45RA (HI100; BD Biosciences), biotine-CTLA-4 (BNI3 ; BD Biosciences), APC-streptavidin (BioLegend), V500-CD8 (RPA-T8; BD Biosciences), BrilliantViolet711-CD3 (OKT3; Biolegned), AlexaFluor700-CD4 (RPA -T4; eBioscience), FITC-Lineage-mengsel (BD Biosciences), PerCP/Cy5.5-CD11c (3.9; BioLegend), APC-HLA-DR (LN3; eBioscience), PE-CD86 (IT2.2; eBioscience), AlexaFluor700-CD80 (L307.4; BD Biosciences), PE-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) en fixeerbare vitaliteitskleurstof eFluor780 (eBioscience). De volgende antilichamen werden gebruikt om muizencellen te kleuren: V500-CD8 (53-6.7; BD Biosciences), PE-Cy7-CD3e (145-2C11; eBioscience), eFluor 450-CD4 (RM4-5; eBioscience), APC-CD25 (PC61.5; eBioscience), PE-FOXP3 (FJK-16s; eBioscience), FITC–IFN- (XMG1. 2; BD Biosciences), AlexaFluor647-IL-2 (JES6-5H4; eBiosciences) en fixeerbare vitaliteitskleurstof eFluor780 (eBioscience). Antigeen-specifieke TIL CD8 plus T-cellen van muizen werden gekleurd met PE-gelabelde, H-2Dd-beperkte ESO-181–88 tetrameren (TC Matrix), zoals hierboven beschreven. Om de cytokineproductie van CD8 plus T-cellen te meten, werden muizen-TIL's gedurende 5 uur opnieuw gestimuleerd bij 37 graden in de aanwezigheid van 10 μM van dezelfde ESO-181–88-peptiden die werden gebruikt voor een vaccinatie met GolgiPlug (BD Bioscience). Fixatie en permeabilisatie werden uitgevoerd met de Cytofix / Cytoperm-bufferset (BD Bioscience). Cellen werden verkregen met LSR Fortessa (BD Bioscience) en geanalyseerd met FlowJo v9.9.5-software.

Statistische analyse

Tweezijdige gepaarde t-test werd gebruikt om de significantie tussen de twee groepen te evalueren. Eenrichtings- of tweerichtings-ANOVA met post-hoc Tukey's eerlijk significant verschil (HSD)-test werd gebruikt voor het vergelijken van meerdere groepen. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van Prism v6-software (GraphPad). P-waarden < 0.05 werden als significant beschouwd.

DANKBETUIGINGEN.

We danken leden van de afdeling Dermatologie, Graduate School of Medicine, Osaka University voor het verzamelen van patiëntmonsters; en K. Teshima, T. Shimizu en N. Mizoguchi voor technische assistentie. Fc-ontworpen CTLA{1}}-antilichamen tegen mensen en muizen werden gegenereerd en geleverd door Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Deze studie werd ondersteund door Grant-in-Aid for Specially Promoted Research 16H06295 (aan SS), Grants-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek (A) 26253030 (naar SS), en (B) 26290054 (naar HN), Grantin-Aid voor uitdagend verkennend onderzoek 26670581 (naar HN), en Grant-inAid voor jonge wetenschappers (B) 26860331 en 17K15723 (naar A. Tanaka) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan; en Core Research for Evolutional Science and Technology van Japan Science and Technology Agency (SS). Deze studie werd gedeeltelijk uitgevoerd als een onderzoeksprogramma van het Project for Development of Innovative Research on Cancer Therapeutics (P-DIRECT), en Practical Research for Innovative Cancer Control, en Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) door de Japanse Agentschap voor medisch onderzoek en ontwikkeling.

1. Sakaguchi S (2004) Natuurlijk ontstane CD4 plus regulerende T-cellen voor immunologische zelftolerantie en negatieve controle van immuunresponsen. Annu Rev. Immunol 22:531-562.

2. Zou W (2006) Regulerende T-cellen, tumorimmuniteit en immunotherapie. Nat Rev Immunol 6: 295-307.

3. Tanaka A, Sakaguchi S (2017) Regulerende T-cellen bij immunotherapie bij kanker. Celresolutie 27: 109-118.

4. Quezada SA, Peggs KS, Curran MA, Allison JP (2006) CTLA4-blokkade en GM-CSF-combinatie-immunotherapie verandert de intratumorbalans van effector- en regulerende T-cellen. J Clin Invest 116: 1935-1945.

5. Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S (1999) Inductie van tumorimmuniteit door CD25 plus CD4 plus T-cellen te verwijderen: een gemeenschappelijke basis tussen tumorimmuniteit en auto-immuniteit. J. Immunol 163:5211-5218.

6. Wolf AM, et al. (2003) Toename van regulerende T-cellen in het perifere bloed van kankerpatiënten. Clin Kanker Onderzoek 9:606-612.

7. Curiel TJ, et al. (2004) Specifieke rekrutering van regulerende T-cellen bij ovariumcarcinoom bevordert het immuunsysteem en voorspelt een verminderde overleving. Nat Med 10:942-949.

8. Petersen RP, et al. (2006) Tumor-infiltrerende Foxp3 plus regulatoire T-cellen worden geassocieerd met recidief bij pathologische stadium I NSCLC-patiënten. Kanker 107: 2866-2872.

9. Shang B, Liu Y, Jiang SJ, Liu Y (2015) Prognostische waarde van tumor-infiltrerende FoxP3 plus regulerende T-cellen bij kanker: een systematische review en meta-analyse. Wetenschappelijk Rep. 5:15179.

10. Miyara M, et al. (2009) Functionele afbakening en differentiatiedynamiek van menselijke CD4 plus T-cellen die de FoxP3-transcriptiefactor tot expressie brengen. Immuniteit 30: 899-911.

11. Vleugel JB, et al. (2017) Een aparte subpopulatie van CD25-T-folliculaire regulerende cellen lokaliseert zich in de kiemcentra. Proc Natl Acad Sci VS 114:E6400–E6409.

12. Saito T, et al. (2016) Twee FOXP3(plus)CD4(plus) T-celsubpopulaties bepalen duidelijk de prognose van colorectale kankers. Nat Med 22:679-684.

13. Sugiyama D, et al. (2013) Anti-CCR4 mAb put selectief effector-type FoxP3 plus CD4 plus regulerende T-cellen uit, wat antitumor immuunresponsen bij mensen oproept. Proc Natl Acad Sci VS 110:17945-17950.

14. Shevach EM (2009) Mechanismen van foxp3 plus T-regulerende celgemedieerde onderdrukking. Immuniteit 30: 636-645.

15. Vleugel K, et al. (2008) CTLA-4 controle over Foxp3 plus regulerende T-celfunctie. Wetenschap 322: 271-275.

16. Qureshi OS, et al. (2011) Trans-endocytose van CD80 en CD86: een moleculaire basis voor de cel-extrinsieke functie van CTLA-4. Wetenschap 332: 600-603.

17. Hodi FS, et al. (2010) Verbeterde overleving met ipilimumab bij patiënten met gemetastaseerd melanoom. N Engl J Med 363: 711-723.

18. Robert C, et al. (2011) Ipilimumab plus dacarbazine voor niet eerder behandeld gemetastaseerd melanoom. N Engl J Med 364: 2517-2526.

19. Bulliard Y, et al. (2013) Het activeren van Fc-receptoren draagt ​​bij aan de antitumoractiviteiten van immunoregulerende receptorgerichte antilichamen. J Exp Med 210: 1685-1693.

20. Simpson TR, et al. (2013) Fc-afhankelijke depletie van tumor-infiltrerende regulatoire T-cellen bepaalt mede de werkzaamheid van anti-CTLA-4-therapie tegen melanoom. J Exp Med 210: 1695-1710.

21. Selby MJ, et al. (2013) Anti-CTLA-4-antilichamen van het IgG2a-isotype versterken de antitumoractiviteit door reductie van intratumorale regulerende T-cellen. Kanker Immunol Onderzoek 1: 32-42.

22. Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) Fcgamma-receptoren als regulatoren van immuunresponsen. Nat Rev Immunol 8:34-47.

23. Mimoto F, et al. (2013) Nieuwe asymmetrisch ontworpen antilichaam-Fc-variant met superieure FcR-bindingsaffiniteit en -specificiteit vergeleken met gefucosyleerde Fc-variant. MAbs 5:229-236.

24. Maeda Y, et al. (2014) Detectie van zelfreactieve CD8 plus T-cellen met een anergisch fenotype bij gezonde personen. Wetenschap 346: 1536-1540.

25. Gnjatic S, et al. (2006) NY-ESO-1: Overzicht van een immunogeen tumorantigeen. Adv Kanker Onderzoek 95:1-30.

26. Arce Vargas F, et al.; Melanoom TRACERx Consortium; Renaal TRACERx-consortium; Lung TRACERx Consortium (2017) Fc-geoptimaliseerde anti-CD25 put tumor-infiltrerende regulatoire T-cellen uit en werkt samen met PD-1-blokkade om gevestigde tumoren uit te roeien. Immuniteit 46: 577-586.

27. Arce Vargas F, et al.; TRACERx Melanoom; TRACERx Nier; TRACERx Lung consortia (2018) Fc-effectorfunctie draagt ​​bij aan de activiteit van menselijke anti-CTLA{3}}-antilichamen. Kankercel 33:649–663.e4.

28. Bulliard Y, et al. (2014) OX40 engagement depletes intratumoral Tregs via activating Fc Rs, leading to antitumor efficacy. Immunol Cell Biol 92:475–480.

29. Romano E, et al. (2015) Ipilimumab-afhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit van regulerende T-cellen ex vivo door niet-klassieke monocyten bij melanoompatiënten. Proc Natl Acad Sci VS 112:6140–6145.

30. Walker LSK, Sansom DM (2011) De opkomende rol van CTLA4 als een cel-extrinsieke regulator van T-celresponsen. Nat Rev Immunol 11:852–863.

31. Linsley PS, et al. (1996) Intracellulaire handel in CTLA-4 en focale lokalisatie naar sites van TCR-betrokkenheid. Immuniteit 4: 535-543.

32. Egen JG, Allison JP (2002) Ophoping van cytotoxisch T-lymfocytantigeen-4 in de immunologische synaps wordt gereguleerd door de TCR-signaalsterkte. Immuniteit 16:23-35.

33. Ko K, et al. (2005) Behandeling van gevorderde tumoren met agonistisch anti-GITR mAb en de effecten ervan op tumor-infiltrerende Foxp3 plus CD25 plus CD4 plus regulerende T-cellen. J Exp Med 202: 885-891.

34. Prieto PA, et al. (2012) CTLA-4 blokkade met ipilimumab: langdurige follow-up van 177 patiënten met gemetastaseerd melanoom. Clin Kanker Onderzoek 18:2039-2047.

35. Mei HE, Leipold MD, Schulz AR, Chester C, Maecker HT (2015) Barcodering van levende mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed voor gemultiplexte massacytometrie. J. Immunol 194:2022-2031.

Danbee Haa,b, Atsushi Tanakaa, Tatsuya Kibayashia,c, Atsushi Tanemurad, Daisuke Sugiyamaa,1, James Badger Winga, Ee Lyn Lima, Karen Wei Weng Tenge, Dennis Adeegbea,2, Evan W. Newelle, Ichiro Katayamad, Hiroyoshi Nishikawaa, 1,3, en Shimon Sakaguchia,b,4.

een Experimental Immunology, Immunology Frontier Research Center, Osaka University, 565-0871 Osaka, Japan; b Laboratorium voor Experimentele Immunologie, Department of Regeneration Science and Engineering, Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 606-8507 Kyoto, Japan; c Research Division, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 247-8530 Kanagawa, Japan; d Afdeling Dermatologie, Graduate School of Medicine, Universiteit van Osaka, 565-0871 Osaka, Japan; en e Agency for Science, Technology and Research, Singapore Immunology Network, 138632 Singapore.

Bijgedragen door Shimon Sakaguchi, 23 november 2018 (ter beoordeling verzonden 19 juli 2018; beoordeeld door Miyuki Azuma en Sergio A. Quezada).

For more information:1950477648nn@gmail.com