Onderscheidende tolachtige receptoren, genexpressie en gliale respons in verschillende hersengebieden van natuurlijke scrapie, deel 3

We onderzochten de mogelijke correlaties tussen de neuropathologische kenmerken van prionziekte en TLR-genexpressie in vier verschillende hersengebieden van schapen die van nature met scrapie waren geïnfecteerd. In alle vier de hersengebieden hebben we significante verschillen waargenomen in PrPSc-afzetting, spongiose, astrogliose en microgliose bij de op natuurlijke wijze geïnfecteerde schapen en de controleschapen.

Prionziekte, ook bekend als tempelbeursziekte, wasetende ziekte, enz., is een acute virale infectie veroorzaakt door prionen. De ziekte wordt voornamelijk overgedragen door het eten van ongekookt voedsel dat prionen bevat. Eenmaal geïnfecteerd met prionen kan het hersenontsteking en schade aan het zenuwstelsel veroorzaken, en kunnen symptomen zoals hoofdpijn, braken en koorts optreden.

Wanneer we echter met een dergelijke situatie worden geconfronteerd, kunnen we het vertrouwen in ons geheugen niet verliezen vanwege het bestaan ​​van prionziekte. De meeste geïnfecteerde mensen kunnen na de behandeling herstellen en hun geheugen herstellen.

Natuurlijk kunnen we vanuit preventief perspectief proberen meer gekookt voedsel te eten om prioninfectie te voorkomen. Tegelijkertijd moet u, als u symptomen ervaart, zo snel mogelijk een arts raadplegen om te voorkomen dat de ziekte verergert.

In het dagelijks leven kunnen we een aantal eenvoudige geheugentrainingen proberen, zoals lezen, lijsten samenstellen, evenementen en informatie organiseren, enz. om ons geheugen te verbeteren. Deze trainingen vergen niet veel tijd en energie, maar zijn wel erg belangrijk voor het behoud van gezonde hersenen en een effectieve geheugenfunctie.

Kortom, als we te maken krijgen met ziekten zoals de prionziekte, moeten we deze positief onder ogen zien, professionele medische behandeling en preventieve maatregelen zoeken, en aandacht besteden aan dagelijkse geheugenoefeningen om onze lichamelijke gezondheid en efficiënt werk te garanderen. Het is duidelijk dat we het geheugen moeten verbeteren, en Cistanche kan het geheugen aanzienlijk verbeteren omdat het ook de balans van neurotransmitters kan reguleren, zoals het verhogen van de niveaus van acetylcholine en groeifactoren, die erg belangrijk zijn voor het geheugen en het leren. Bovendien kan Cistanche ook de bloedstroom verbeteren en de zuurstoftoevoer bevorderen, wat ervoor kan zorgen dat de hersenen voldoende voeding en energie krijgen, waardoor de vitaliteit en het uithoudingsvermogen van de hersenen worden verbeterd.

Klik op manieren kennen om de hersenfunctie te verbeteren

Deze verschillen waren het duidelijkst in de medulla oblongata, het meest caudale gebied. Daarentegen werden de mildste laesies waargenomen in de frontale cortex, het meest rostrale gebied. Dit opeenvolgende patroon komt overeen met de route van invasie en verspreiding van prionen door het centrale zenuwstelsel, beginnend bij de toegangspunten in het ruggenmerg en de obex en uiteindelijk tot de frontale cortex [1,5,51].

Onverwachts observeerden we, gezien hun anatomische nabijheid, een drastische afname in PrPSc-afzetting en vacuolisatie, en een significante afname in astrogliose, wanneer we van de thalamus naar de hippocampus gaan, zonder de geleidelijke caudo-rostrale progressie van de pathologie te volgen.

Een specifieke microgliamorfologie, bekend als staafmicroglia, werd waargenomen in de nabijheid van piramidale celneuronen bij CA3, maar was afwezig in alle andere bestudeerde neuroanatomische regio's.

Voor zover wij weten, is dit microgliale profiel tot nu toe niet in verband gebracht met neuro-inflammatie veroorzaakt door prionen, hoewel een recente studie de aanwezigheid van staafvormige microglia in het cerebellum van menselijke patiënten met CJD rapporteerde [52].

Hoewel weinig onderzocht sinds de eerste beschrijvingen in de twintigste eeuw, zijn staafmicroglia onlangs gerapporteerd bij neurologische aandoeningen zoals epilepsie, Lewy body dementie, de ziekte van Huntington en AD, met name in matig beschadigde gebieden van de hersenschors en de hippocampus [40,41,53]. De fenotypische expressie en functies van staafmicroglia zijn nog niet duidelijk.

Het feit dat dit morfologische kenmerk doorgaans samenvalt met de aanwezigheid van neuronale elementen die beschadigd zijn of kwetsbaar zijn voor schade suggereert echter een neuroprotectieve rol [42,54,55].

Er wordt niet aangenomen dat staafmicroglia geassocieerd zijn met ernstige laesies, omdat onder deze omstandigheden de progressie naar een ameboïde morfologie wordt verwacht [56]. De aanwezigheid van rodmicroglia in de hippocampus van met scrapie geïnfecteerde schapen, maar niet in andere hersengebieden, kan indicatief zijn voor een neuroprotectieve omgeving, in goede overeenstemming met het beperkte neuronale verlies dat in dit gebied wordt waargenomen.

Onze analyse van TLR-expressie onthult een directe correlatie tussen de ernst van de laesie en overexpressie van het TLR-gen die samenvalt met de eerder genoemde caudo-rostrale progressie van prion-neuropathologie.

Omgekeerd kwam TLR4 in alle gebieden tot overexpressie, ongeacht de ernst van de laesie. Overexpressie van TLR4 in gebieden met mildere neuronale schade (dwz de hippocampus en de frontale cortex) kan een weerspiegeling zijn van de aneuroprotectieve rol, zoals eerder beschreven voor fagocytische cellen zoals macrofagen en microglia [23,57]. De opregulatie van TLR7 is eerder gerapporteerd in muismodellen van prionziekte en menselijke patiënten [22,26,31].

We hebben alleen de opregulatie van TLR7 waargenomen in de medulla oblongata, het meest beschadigde gebied waar de hoogste niveaus van spongiose en PrPSc-afzetting werden gedetecteerd.

Neuronale dood via apoptose is eerder in verband gebracht met TLR7-stimulatie [58,59], en de overexpressie ervan in de medulla oblongata kan verband houden met dit mechanisme [60]. Hoewel de rol van TLR1 bij neurodegeneratieve ziekten nog niet duidelijk is, wordt de betrokkenheid van TLR2 bij microgliale activatie steeds vaker aangetoond bij amyotrofische laterale sclerose, MS en AD [61,62].

Hoewel de rol van TLR2 bij prionziekten nog niet volledig wordt begrepen, zijn er wel gunstige effecten voorgesteld: de overlevingstijd wordt verkort bij muizen die geen TLR2 tot expressie brengen na intracerebrale inenting met scrapie [22].

Overexpressie van TLR2 en MyD88 kan ook indicatief zijn voor een pro-inflammatoir microglia-fenotype, wat de toename in TNF- en IL-6 die we in de thalamus hebben waargenomen zou kunnen verklaren [8,63].

Interessant is dat experimenten met EOC 13.31-cellen, een onsterfelijk gemaakte microglia-achtige muiscellijn, een ontregeling van de ontstekingsreactie hebben aangetoond als reactie op TLR2-activering en een verband suggereerden tussen TLR2-expressie en de accumulatie van microglia in een toestand die niet optimaal is voor fagocytose [26]. .

Daarom suggereert de overexpressie van TLR2 in de medulla oblongata en de thalamus, de meest beschadigde gebieden waarin ook overmatige niveaus van fagocytische microglia werden gedetecteerd, dat de disfunctionele klaring van PrPSc kan leiden tot aanhoudende accumulatie van PrPSc en neuronale schade [9,17].

Onze bevindingen in de hippocampus van met scrapie geïnfecteerde schapen onthullen een tegengesteld patroon vergeleken met andere geanalyseerde hersengebieden, met de downregulatie van TLR1, TLR2 en MyD88 en geen cytokineveranderingen.

Dit kan erop wijzen dat microglia anders reageren in de hippocampus; Er is inderdaad aangetoond dat TLR2-deficiëntie in primaire microgliale celculturen, van neonatale muizen (0–3 dagen oud) en gestimuleerd met neurotoxisch peptide PrP106-126, microgliale activatie verschuift van een neurotoxisch naar een neuroprotectief fenotype [63 ].

De relevantie van het PrP106-126-peptide in de prionpathologie is echter in twijfel getrokken [64]. CD36 is een ander type patroonherkenningsreceptor, die in staat is om endogeen afgeleide liganden zoals amyloïdvormende peptiden te herkennen, en die een rol heeft gespeeld in de endocytische opname van die componenten [65,66]. Deze receptor is in verband gebracht met een pro-inflammatoire microgliale status [67].

In vitro resulteert stimulatie van BV-2-cellen, een soort onsterfelijk gemaakte microgliale cellen, met PrP106-126 in opregulering van CD36, waardoor pro-inflammatoire cytokines en iNOS- en NO-productie toenemen [68,69].

Bovendien veroorzaakt de herkenning van -amyloïde peptide door CD36 de assemblage van een nieuw heterotrimeer complex CD36-TLR4-TLR6 dat de aangeboren immuunrespons activeert [70,71].

In onze studie vertoonden alle regio’s een significante opregulatie van CD36 behalve de hippocampus. De opregulering van CD36, TLR4 en TLR6 in de meest beschadigde gebieden, de medulla oblongata en obex, suggereert de betrokkenheid van deze triade bij het teweegbrengen van een pro-inflammatoire microgliale status als reactie op prioninfectie.

Omgekeerd suggereert de afwezigheid van overexpressie van CD36 en TLR6 in de hippocampus dat dit heterotrimeer niet wordt gevormd, wat opnieuw indicatief is voor een neuroprotectieve omgeving in dit hersengebied.

Er moet nog worden verklaard waarom microglia anders reageren in dit hersengebied. Hoewel prionstam-specifiek celtropisme het patroon van microgliose en astrogliose zou kunnen bepalen, suggereren recente bevindingen dat beide reacties voornamelijk worden beïnvloed door het hersengebied [18,72].

Noch microglia, noch astroglia reageren uniform over het centrale zenuwstelsel, en deze regiospecifieke respons zou kunnen resulteren in de selectieve kwetsbaarheid van sommige hersengebieden bij prionziekten [16,18].

In dit opzicht is gepostuleerd dat de ontstekingsreactie van microglia op prioninfectie wordt gereguleerd door de sialylatie van PrPSc [14,73-75] en dat PrPSc-sialylatie afhankelijk is van het hersengebied [18]. Specifiek wordt een hoger niveau van sialylering van PrPSc gevonden in de hippocampus en de cortex dan in de thalamus en de hersenstam, wat een mogelijke rol suggereert in de selectieve kwetsbaarheid van deze hersengebieden [18,73,75].

Het hoge niveau van PrPSc-sialylatie in de hippocampus kan in verband worden gebracht met vertraagde prionreplicatie, wat leidt tot de kenmerkende prion-geïnduceerde microgliale activering in deze regio, consistent met de verminderde gevoeligheid van deze regio die door onze bevindingen wordt geïmpliceerd.

Interessant genoeg suggereren eerdere bevindingen dat de hippocampus mogelijk beschermd is tegen prion-neurotoxiciteit bij natuurlijke CJD-infectie [76,77], en gedetailleerde neuropathologische studies van CJD-gevallen hebben mildere laesies in de hippocampus gemeld dan in andere hersengebieden [76].

In het bijzonder lijkt de archicortex, die voornamelijk de hippocampus omvat, relatief gespaard te blijven vergeleken met andere corticale gebieden bij CJD [77]. Deze milde betrokkenheid van de hippocampus, beschreven bij natuurlijke CJD, komt overeen met de huidige bevindingen bij schapen die van nature met scrapie zijn geïnfecteerd.

Interessant genoeg vindt deze gedeeltelijke bescherming tegen ten minste twee natuurlijke prionziekten plaats in de hippocampus, die fylogenetisch het oudste gebied van de hersenschors is en bestaat uit het meest basale type corticale weefsel.

Verder onderzoek zal nodig zijn om de relevantie van deze correlatie te onderzoeken. Samenvattend onthullen onze resultaten een bijzonder milde neuropathologie in de hippocampus van met natuurlijke scrapie geïnfecteerde schapen, gekenmerkt door lagere niveaus van spongiose, PrPSc-afzetting en astrogliose dan verwacht gezien de caudale -rostrale verspreiding van scrapielesies.

Bovendien onderscheidt de aanwezigheid in de hippocampus van een exclusieve microgliale morfologie, staafmicroglia, die een neuroprotectieve rol zou kunnen spelen [54], samen met een duidelijk patroonherkenningsreceptor (TLR-genen en CD36) genexpressieprofiel, dit hersengebied verder van de andere neuro-anatomische structuren. gebieden bij met natuurlijke scrapie geïnfecteerde schapen.

Deze bevindingen suggereren een mate van neuroprotectie tegen natuurlijke prioninfectie in de hippocampus die verder onderzoek verdient. Neurodegeneratieve ziekten veroorzaakt door het verkeerd vouwen van eiwitten brengen een vicieuze cirkel van ontsteking met zich mee die bestaat uit verkeerd gevouwen eiwitaccumulatie, gliale activering en het vrijkomen van gliale ontstekingsmediatoren, die de eiwitafzetting verergeren en neuro-ontsteking.

Het doorbreken van deze vicieuze cirkel door zich te richten op de activering van microglia met behulp van specifieke TLR-remmers in een specifiek ziektestadium kan een veelbelovende aanpak zijn om verdere neuro-inflammatie te beperken. Onze bevindingen benadrukken TLR2-downregulatie als een potentieel doelwit voor een dergelijke aanpak, omdat dit een verschuiving in microglia kan veroorzaken van een neurotoxisch naar aneuroprotectief fenotype [63].

Hoewel er grote vooruitgang is geboekt bij het karakteriseren van de diversiteit van gliafenotypes met behulp van muismodellen van neurodegeneratieve ziekten, is de vraag of muismodellen de belangrijkste aspecten van prionziekten getrouw weerspiegelen een kwestie van enige discussie [78,79].

Onze resultaten in het tg338-transgene model reproduceerden de algemene pathologische tekenen van prioninfectie, waaronder duidelijke PrPSc-afzetting, neuropil spongiose, astrogliose en microgliose.

Geïnfecteerde muizen vertoonden echter een significante overexpressie van TLR1 en TLR2 en een neiging tot overexpressie van TLR7. Hoewel de opregulatie van deze genen eerder is beschreven in andere muismodellen die zijn geïnfecteerd met scrapie [22,26], staat dit patroon in contrast met onze bevindingen in de hersenen van schapen. Opmerkelijk genoeg hebben we in de hersenen van muizen geen veranderingen waargenomen in de expressie van TLR4, het gen waarvoor de grootste veranderingen in expressie werden waargenomen in de schapenmonsters.

Deze tegenstrijdige bevindingen kunnen een gevolg zijn van de verschillende infectieroutes en/of de prioneiwitexpressieniveaus bij tg338-muizen [80,81]. Niettemin geven onze resultaten uiteindelijk aan dat de intracerebralinoculatie van scrapie bij te grote tg338-muizen niet de immuunrespons reproduceert die wordt waargenomen bij natuurlijke scrapie-infectie.

4. Materialen en methoden

4.1. Met scrapie geïnfecteerde schapen en controleschapen

Eenentwintig vrouwelijke Rasa Aragonesa-schapen (in de leeftijd van 2 tot 6 jaar) werden in het huidige onderzoek opgenomen. Alle werden gegenotypeerd voor PRNP-polymorfismen, zoals eerder gerapporteerd [82], en er werd gevonden dat ze een ARQ/ARQ-genotype vertoonden. Controledieren (n=8) werden geselecteerd uit een koppel waarin geen gevallen van scrapie waren gemeld.

Met scrapie geïnfecteerde dieren (n=13) werden verkregen van door scrapie getroffen koppels en waren gediagnosticeerd door immunohistochemie (IHC) van biopsieën van het rectumslijmvlies. Infectie werd bevestigd door post-mortem immunodetectie van PrPSc in de obex volgens gepubliceerde criteria [83].

De dieren werden geëuthanaseerd door een intraveneuze overdosis barbituraten en leegbloeden.

Ten tijde van de euthanasie vertoonden alle met scrapie geïnfecteerde schapen klinische verschijnselen van uiteenlopende ernst: sommige dieren vertoonden beginnende verschijnselen zoals jeuk aan de rug en flanken na digitale stimulatie en milde vermindering van de lichaamsconditie, terwijl andere gevorderde klinische verschijnselen vertoonden zoals spontaan krabben aan de huid. staartwortel, lendengebied en ledematen, neurologische symptomen waaronder ataxie en hoofdtrillingen, en tandenknarsen, wolverlies en intens gewichtsverlies [84].

4.2. Infectie van Tg338-muis

Om TLR-genexpressies in de hersenen van een muizenmodel van scrapie te evalueren, zijn tien weken oude tg338-muizen (n=8) (die de schapen-VRQ/VRQ PrPC tot overexpressie brengen 8- tot 10-fold [ 85]) werden in het klinische stadium ingeënt met een hersenpool van een natuurlijk met scrapie geïnfecteerd Rasa Aragonesa-schaap.

De muizen werden geïnoculeerd met 20 µl van het scrapie-inoculum (2% w/v verdund in PBS) in de rechter hersenhelft onder isofluraananesthesie. Intracerebraline-injecties werden uitgevoerd met behulp van een injectiespuit van 50 µl en een 25G-naald. Na inenting kregen de muizen een subcutane injectie van buprenorfine (0,3 mg/kg) om analgesie te induceren.

Als controles werden tg338-muizen (n=8) geïnoculeerd met hersenhomogenaat van een scrapie-negatief schaap volgens dezelfde procedure als hierboven beschreven. De muizen werden gecontroleerd op de ontwikkeling van klinische symptomen en geëuthanaseerd door cervicale dislocatie toen terminale tekenen van de ziekte zoals ernstige ataxie en onvermogen om te voeden verschenen.

Muizen geïnfecteerd met het scrapie-positieve inoculum vertoonden een gemiddelde overlevingstijd van 187 ± 26 dpi.

4.3. Weefselverzameling

Monsters van het CZS werden verzameld en sagittaal in twee helften verdeeld; één werd gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline voor histopathologische en immunohistochemische analyse, en de andere werd direct ingevroren en op -80 ◦C gehouden voor eiwitanalyse of gestabiliseerd in RNAlaterTM Solution (InvitrogenTM, Waltham, MA, VS) voor RNA-extractie en vervolgens ingevroren en opgeslagen bij −80 ◦C.

4.4. PRNP-sequencing

DNA werd uit bloedmonsters geëxtraheerd met Speedtools Tissue DNA Extraction kit (Biotools, Madrid, Spanje) volgens de instructies van de fabrikant. PCR-amplificatie en sequencing werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [82].

4.5. Immunohistochemie

Met formaline gefixeerde weefsels werden verwerkt volgens standaard histopathologische procedures. Weefselcoupes werden in paraffine ingebed, in secties van 4 µm dik gesneden en gekleurd met hematoxyline-eosine (HE) voor de evaluatie van vacuolatie en neuropil spongiose.

IHC voor PrPSc-detectie werd uitgevoerd met behulp van het monoklonale primaire muizenantilichaam L42 bij schapen (1:500 verdunning bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten) (R-Biopharm, Darmstadt, Duitsland) en polyklonaal konijnenantilichaam R486 bij muizen (1: 8000 verdunning, overnacht bij 4 ◦C) (R. Jackman, niet gepubliceerd) zoals eerder beschreven [86,87].

Secties werden ook onderworpen aan conventionele immunokleuring voor het astrocytenmarker gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, Denemarken) en de microglia-marker geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond). , VA, VS), volgens gepubliceerde protocollen [88]. Alle histologische en IHC-evaluaties werden uitgevoerd door twee veterinaire pathologen die blind waren voor de klinische gegevens.

Beoordelingen van spongiose en PrPSc-kleuringsintensiteit werden semi-kwantitatief uitgevoerd en aangepast volgens de criteria beschreven in eerdere onderzoeken: vacuolatie van de neuropil en de perikarya werd gescoord van 0 (afwezig) tot 5 (zeer talrijk en samenvloeiend) [51], het PrPSc-signaal werd gekwantificeerd op basis van de mate van immunokleuring van 0 (geen labeling) tot 5 (intense uniforme labeling) zoals eerder gerapporteerd [89], en de mate van GFAP- en Iba1-immunolabeling werd gescoord op een schaal variërend van {{ 8}} tot 5 (0=zwakke kleuring; 5=substantiële immunolabeling in de hele regio) zoals beschreven [88]. Vier hersengebieden werden geëvalueerd: frontale cortex (Fc), thalamus (Th), hippocampusformatie (Hc) en medulla oblongata (Mo), en elk gebied werd globaal geanalyseerd voor de score en grafisch weergegeven als gemiddelde ± standaardfout.

4.6. Westerse vlek

100 mg hersenweefsel van elk hersengebied (Fc, Th, Hc en Mo) van 13 met scrapie geïnfecteerde schapen, 8 met gevorderde klinische symptomen en 5 met beginnende klinische symptomen, werden gehomogeniseerd in 1 ml lysisbuffer.

Hemiencephalons van de 8 geïnfecteerde en 8 controlemuizen werden gehomogeniseerd met 10% (w/v) in lysisbuffer. Weefselmonsters werden gehomogeniseerde maalbuisjes (Bio-Rad, Hercules, CA, VS) met behulp van een TeSeEPrecess 48 TM-homogenisator (Bio-Rad, Hercules, CA, VS), en de eiwitconcentratie werd gemeten met behulp van de PierceTM BCA Protein Assay-kit (ThermoScientificTM, Waltham, MA, VS) volgens de instructies van de fabrikant.

Voor de PrPres-analyse werden gelijke hoeveelheden eiwit uit weefselhomogenaten gedurende 10 minuten bij 37 ◦C geïncubeerd met proteïnase K-oplossing, zoals eerder beschreven [90].

De resulterende monsters werden onderworpen aan elektroforese in 12% CriterionTM XT Bis-Tris Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, VS) en overgebracht naar PVDF-membranen die gedurende 1 uur werden geblokkeerd met 2% magere droge melk in TBST (Tris- gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween20).

Voor immunoblotting werden de membranen overnacht bij 4 °C geïncubeerd met Sha31primair antilichaam (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Frankrijk) in een concentratie van 1 µg/ml, gevolgd door 1 uur incubatie bij kamertemperatuur (RT) met mierikswortelperoxidase. geconjugeerd anti-muis IgG secundair antilichaam (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, VS).

Immunoreactiviteit werd gedetecteerd met behulp van het chemiluminescerende substraat Immobilon Crescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, Duitsland). De TLR4-eiwitexpressie werd geanalyseerd uit de weefselhomogenaten gemengd met 2 x Laemmli-monsterbuffer (Bio-Rad, Hercules, CA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. .

Veertig microgram totaal eiwit werd per putje geladen, in 7,5% CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, VS) gelopen en overgebracht naar PVDF-membranen, die vervolgens gedurende 2 uur werden geblokkeerd met 4% runderserumalbumine (BSA) (Merck, Darmstadt, Duitsland) in TBST bij RT. De membranen werden een nacht bij 4 °C geïncubeerd met polyklonaal anti-TLR4-antilichaam van konijn (Novus Biological, Minneapolis, MN, VS) bij een concentratie van 0,5 µg/ml, en vervolgens gewassen en geïncubeerd met anti-konijn-IgG van geit ( H + L) HRP secundair antilichaam (ThermoScientificTM, Waltham, MA, VS) om 1:20,000 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.

Blots werden gevisualiseerd zoals hierboven beschreven. Vervolgens werden de membranen gedurende 15 minuten bij 37 °C gestript met RestoreTM Western Blot Stripping buffer (ThermoScientificTM, Waltham, MA, VS), gewassen en opnieuw geblokkeerd.

Vervolgens werden de membranen een nacht bij 4 ° C geïncubeerd met monoklonaal actine-primair antilichaam van muizen (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, VS) om 1:1000, gewassen en geïncubeerd met anti-muis m-IgGкBP-HRP secundair antilichaam (Santa Cruz Biotechnologie, Dallas, TX, VS) gedurende 1 uur. Na het wassen werden de blots ontwikkeld zoals hierboven beschreven.

Densitometrieën werden uitgevoerd met ImageJ-software en de waarden werden genormaliseerd met behulp van -actine. De genormaliseerde waarden werden weergegeven met GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, VS).

De statistische analyses om de geïnfecteerde en controlegroepen te vergelijken werden uitgevoerd met een Student's t-test, en de gelijkheid van varianties werd bepaald door Levene'stest met behulp van de SPSS-software (SPSS Statistics for Windows, versie 17.0, Chicago, IL, VS). Verschillen tussen groepen werden op * p. als statistisch significant beschouwd<0.05.

4.7. RNA-extractie, cDNA-synthese en genexpressie

Totaal RNA van schapen werd geëxtraheerd uit 90 mg weefselmonsters van de frontale cortex, thalamus, hippocampus en medulla oblongata. De hersenen van muizen werden op de middellijn verdeeld en er werd totaal RNA uit geëxtraheerd<90 mg obtained from the thalamic area. 

Weefsels werden gehomogeniseerd met behulp van een TeSeEPrecess 48TM-homogenisator (Bio-Rad) met RNeasy LipidTissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) gecombineerd met TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, VS) om mogelijke genomische DNA-verontreiniging te verwijderen. De RNA-concentratie werd spectrofotometrisch bepaald met een NanoDrop-spectrofotometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, VS), en voor elk monster werden de verhoudingen 260/280 en 260/230 geanalyseerd om de zuiverheid van het monster te verifiëren.

Eén microgram complementair DNA (cDNA) werd gesynthetiseerd met behulp van qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Bovendien werd de effectiviteit van de DNase-behandeling beoordeeld in RT-negatieve monsters. Na omgekeerde transcriptie werd dezelfde batch verdund cDNA onderworpen aan qPCR om TLR's te amplificeren.

Twee veelgebruikte huishoudgenen (HK) werden geselecteerd om de expressie van de doelgenen te normaliseren: glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) enactine-bèta (ACT) [91]. De stabiliteit van dit HK-gen werd geverifieerd onder onze experimentele omstandigheden. De expressie van boodschapper-RNA (mRNA) werd bepaald door qPCR voor 1 tot 10 schapen-TLR-genen, 1 tot 9 muizen-TLR-genen en het MyD88-gen voor beide soorten.

Twee pro-inflammatoire (TNF- en IL-6) en twee ontstekingsremmende (IL-10 en TGF-) cytokines werden ook bestudeerd in de thalamus en de hippocampus van schapen. Primersequenties en efficiënties waren eerder gepubliceerd of ontworpen met behulp van de Primer3Plus-tool [92] (tabel 2).

We hebben de efficiëntie van elk gen geverifieerd door een standaardcurve te genereren door 1:2 seriële verdunningen van controle-cDNA te amplificeren en vervolgens te controleren op lineariteit tussen de initiële sjabloonconcentratie en de cyclusdrempelwaarden (Ct). Alle genen vertoonden een correlatiecoëfficiënt tussen 0.9 en 0.99, met een hellingswaarde van de standaardcurven in het bereik van −3,2 tot −3,5 en een qPCR-efficiëntie van 90–110%.

De qPCR-reacties werden uitgevoerd met behulp van het Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR-systeem, 96-well met universele amplificatieomstandigheden: een initiële activerings- en cDNA-denaturatiestap van 10 minuten bij 95 ◦C, gevolgd door 40 cycli van 3 seconden bij 95 ◦C en 30 za 60 ◦C.

Om de aanwezigheid van niet-specifieke PCR-amplicons of hoge niveaus van primerdimeren te identificeren, voerden we na elke qPCR-reactie een dissociatiecurveprotocol uit. Elk monster werd in drievoud geanalyseerd in een totaal reactievolume van 10 µl, bestaande uit 15 ng cDNA, 5 µl Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, VS), en de vereiste hoeveelheid voorwaartse en achterwaartse primers (Tabel 2).

Nucleasevrij water werd toegevoegd tot een eindvolume van 10 µl. De niveaus van genexpressie werden bepaald met behulp van de vergelijkende Ct-methode. De resultaten werden weergegeven als fold-change en de verschillen in genexpressie ten opzichte van het gemiddelde niveau van de controlegroep werden opgeschaald naar 1.

4.8. Gegevensanalyse en statistieken

Alle verzamelde kwantitatieve gegevens werden op normaliteit getest met de Shapiro-Wilk Wtest. Histologische en immunohistochemische verschillen tussen de geïnfecteerde en controlegroepen werden geëvalueerd met behulp van een Student's t-test of Mann-Whitney U-test, afhankelijk van de parametrische of niet-parametrische gegevensverdeling.

Statistische verschillen tussen de vier verschillende hersengebieden bij met scrapie geïnfecteerde schapen werden bepaald met behulp van eenzijdige variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door een Bonferroni post hoc-test of Kruskal-Wallis-test, afhankelijk van de parametrische of niet-parametrische gegevensverdeling. Statistische analyses van de qPCR-gegevens werden uitgevoerd op basis van de gemiddelde ∆Ct-waarden voor elk gen.

Voor de statistische vergelijking van geïnfecteerde en controlegroepen werd een Student's t-test of Mann-Whitney U-test uitgevoerd, afhankelijk van de normale verdeling van elk gen, en de gelijkheid van varianties werd bepaald door een Levene's-test. Verschillen in expressie werden als significant beschouwd bij p < 0.05.

De volgende notaties werden gebruikt om p-waarden in de figuren aan te duiden: * p < 0.05; ** p Kleiner dan of gelijk aan 0.01; # p < 0.1. Voor de statistische analyses werd SPSS-software (SPSS Statistics for Windows, versie 17.0, Chicago, IL, VS) gebruikt. Grafieken zijn gegenereerd met GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, VS) en de gegevens in de figuren vertegenwoordigen het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde (gemiddelde ± SEM).

5. Conclusies

Voor zover wij weten is de huidige studie de eerste die de expressieniveaus van TLR-genen in verschillende hersengebieden van natuurlijke met scrapie geïnfecteerde schapen en te grote tg338-muizen beschrijft die experimenteel met scrapie zijn geïnfecteerd.

Uit ons onderzoek blijkt duidelijk dat TLR’s, en vooral TLR4 bij schapen en TLR1 en TLR2 bij muizen, betrokken zijn bij de pathogenese van scrapie. Bovendien is, in tegenstelling tot alle andere bestudeerde regio’s, het kenmerkende profiel van TLR-genexpressie, samen met de unieke microgliale morfologie, en milde neuropathologie waargenomen in de hippocampus, suggereert een hersengebiedspecifieke immuunrespons bij natuurlijke scrapie-infectie.

Er zullen echter verdere studies nodig zijn om TLR-expressie in microglia, astroglia en neuronen bij scrapie-infectie te karakteriseren om de precieze bijdrage van elk celtype aan neuro-inflammatie te begrijpen. Bovendien moet nog worden bepaald of TLR-activering een directe reactie is op priontoxiciteit of secundair plaatsvindt aan andere ontstekingsmechanismen.

TLR's vormen een veelbelovend doelwit voor therapeutische benaderingen van prionziekten, en daarom zal een beter begrip van TLR-gereguleerde neuro-inflammatoire reacties nodig zijn om verdere vooruitgang op dit gebied te garanderen.

Aanvullende materialen: Het volgende is online beschikbaar ophttps://www.mdpi.com-eeltje/10.3390/ijms23073579/s1.

Bijdragen van auteurs: Conceptualisering, onderzoek en datacuratie, MCG en LMC; schrijven-originele conceptvoorbereiding, MG-M., MCG en LMC; experimentele methodologie, MG-M.; schrijven-recensie en redactie, MG-M., MCG, LMC en AO; in vivo methodologie, MB; financieringsacquisitie, RB en JJB; moleculaire methodologie, BS-P.; supervisie, MCG en JJB Alle auteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en ermee ingestemd.

Financiering: Dit onderzoek werd gefinancierd door "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (regering van Aragon) via het project "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes".

Verklaring van de Institutional Review Board: Alle procedures waarbij dieren betrokken waren, hielden zich aan de richtlijnen die zijn opgenomen in de Spaanse wet voor dierenbescherming RD53/2013 en de Richtlijn 2010/63 van de Europese Unie over de bescherming van dieren die voor experimentele doeleinden worden gebruikt. Het protocol werd goedgekeurd door de Commissie voor de Ethiek van Dierproeven van de Universiteit van Zaragoza (Vergunningnummer:PI38/159 oktober 2015 en PI19/14 11 april 2014).

Verklaring van geïnformeerde toestemming: Niet van toepassing.

Verklaring over beschikbaarheid van gegevens: De gegevens die in dit onderzoek worden gepresenteerd, zijn beschikbaar in de artikeltekst, figuren en aanvullend materiaal.

Dankbetuiging: Wij danken Olivier Andreoletti (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) en VincentBeringue (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) voor het ter beschikking stellen van de tg338-muizen die voor deze experimenten zijn gebruikt.

Belangenverstrengeling: De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling. De financiers speelden geen rol bij de opzet van het onderzoek; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript, of bij de beslissing om de resultaten te publiceren. De afbeeldingen en figuren in dit manuscript zijn originele gegevens.

Referenties

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Sarradin, P.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Vroege accumulatie van PrP(Sc) in darm-geassocieerde lymfoïde en zenuwweefsels van gevoelige schapen uit een Romanov-kudde met naturalscrapie. J. Generaal Virol. 2000, 81 Pt 12, 3115-3126. [Kruisref] [PubMed]

2. Prusiner, SB Prionziekten en de BSE-crisis. Wetenschap 1997, 278, 245–251. [Kruisref] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Vroege verspreiding van scrapie van het maagdarmkanaal naar het centrale zenuwstelsel omvat autonome vezels van de splanchnische en vaguszenuwen.J. Virol. 2001, 75, 9320-9327. [Kruisref]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prions en hun dodelijke reis naar de hersenen. Nat. Rev. Microbiol. 2006, 4, 201–211. [Kruisref]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A.; Wemheuer, WIJ; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc-verspreidingspatronen in de hersenen van schapen gekoppeld aan verschillende priontypen. Dierenarts. Res. 2011, 42, 32. [Kruisref]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Bewijs voor een vroege ontstekingsreactie in het centrale zenuwstelsel van muizen met scrapie. Neurowetenschappen 1996, 74, 1–5. [Kruisref]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sharps, B.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner,S.; Wadsworth, JD; et al. Prion-neuropathologie volgt de accumulatie van alternatieve prioneiwit-isovormen nadat de infectieuze titer zijn hoogtepunt heeft bereikt. Nat. Gemeenschappelijk. 2014, 5, 4347. [Kruisref]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, K.; McColl, BW; Cancellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Het definiëren van de Microglia-respons tijdens het tijdsverloop van chronische neurodegeneratie. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [Kruisref]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Microglia bij prionziekten. J. Clin. Onderzoek. 2017, 127, 3230–3239. [Kruisref]

10. Obst, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. De rol van Microglia bij prionziekten: een paradigma van functionele diversiteit.Front. Verouderende neurowetenschappen. 9, 2017, 207. [Kruisref]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Heterogeniteit in de distributie en morfologie van microglia in de normale hersenen van volwassen muizen. Neurowetenschappen 1990, 39, 151–170. [Kruisref]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Heterogeniteit in de morfologie en fysiologie van astrocyten. Hersenonderzoek. Herz. 2010, 63, 2–10. [Kruisref][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com