Onderscheidende tolachtige receptoren, genexpressie en gliale respons in verschillende hersengebieden van natuurlijke scrapie, deel 1

Abstract:

Prionziekten zijn chronische en fatale neurodegeneratieve ziekten die worden gekenmerkt door de accumulatie van ziektespecifiek prioneiwit (PrPSc), spongiforme veranderingen, neuronaal verlies en gliose.

Prionziekte, ook bekend als tempelbeursziekte, wasetende ziekte, enz., is een acute virale infectie veroorzaakt door prionen. De ziekte wordt voornamelijk overgedragen door het eten van ongekookt voedsel dat prionen bevat. Eenmaal geïnfecteerd met prionen kan het hersenontsteking en schade aan het zenuwstelsel veroorzaken, en kunnen symptomen zoals hoofdpijn, braken en koorts optreden.

Wanneer we echter met een dergelijke situatie worden geconfronteerd, kunnen we het vertrouwen in ons geheugen niet verliezen vanwege het bestaan ​​van prionziekte. De meeste geïnfecteerde mensen kunnen na de behandeling herstellen en hun geheugen herstellen.

Natuurlijk kunnen we vanuit preventief perspectief proberen meer gekookt voedsel te eten om prioninfectie te voorkomen. Tegelijkertijd moet u, als u symptomen ervaart, zo snel mogelijk een arts raadplegen om te voorkomen dat de ziekte verergert.

In het dagelijks leven kunnen we een aantal eenvoudige geheugentrainingen proberen, zoals lezen, lijsten samenstellen, evenementen en informatie organiseren, enz. om ons geheugen te verbeteren. Deze trainingen vergen niet veel tijd en energie, maar zijn wel erg belangrijk voor het behoud van gezonde hersenen en een effectieve geheugenfunctie.

Kortom, als we te maken krijgen met ziekten zoals de prionziekte, moeten we deze positief onder ogen zien, professionele medische behandeling en preventieve maatregelen zoeken, en aandacht besteden aan dagelijkse geheugenoefeningen om onze lichamelijke gezondheid en efficiënt werk te garanderen. Het is duidelijk dat we het geheugen moeten verbeteren, en Cistanche kan het geheugen aanzienlijk verbeteren, omdat Cistanche een traditioneel Chinees medicinaal materiaal is met veel unieke effecten, waarvan er één het verbeteren van het geheugen is. Het effect van Cistanche komt van de verschillende actieve ingrediënten die het bevat, waaronder looizuur, polysachariden, flavonoïde glycosiden, enz. Deze ingrediënten kunnen op verschillende manieren de gezondheid van de hersenen bevorderen.

Klik op manieren kennen om de hersenfunctie te verbeteren

Steeds meer bewijsmateriaal toont aan dat de neuro-inflammatoire respons een sleutelcomponent is van prionziekten en bijdraagt ​​aan neurodegeneratie.

Toll-like receptoren (TLR's) zijn voorgesteld als belangrijke mediatoren van aangeboren immuunreacties die in het centrale zenuwstelsel worden geactiveerd bij andere menselijke neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en amyotrofische laterale sclerose.

Er is echter weinig bekend over de rol van TLR's bij prionziekten, en hun betrokkenheid bij de neuropathologie van natuurlijke scrapie is niet onderzocht. We hebben de genexpressie van TLR's van schapen in vier anatomisch verschillende hersengebieden bij met natuurlijke scrapie geïnfecteerde schapen beoordeeld en de mogelijke correlaties tussen genexpressie en de pathologische kenmerken van prionziekte geëvalueerd.

We hebben significante veranderingen waargenomen in de TLR-expressie bij met scrapie geïnfecteerde schapen die correleren met de mate van spongiose, PrPSc-afzetting en gliose in elk van de bestudeerde regio's.

Opmerkelijk genoeg was TLR4 het enige gen dat in alle regio's werd opgereguleerd, ongeacht de ernst van de neuropathologie. In de hippocampus hebben we mildere neuropathologie waargenomen geassocieerd met een duidelijk TLR-genexpressieprofiel en de aanwezigheid van een eigenaardige microgliale morfologie, genaamd rodmicroglia, die hier voor het eerst wordt beschreven in de hersenen van met scrapie geïnfecteerde schapen.

De samenloop van deze kenmerken suggereert een gedeeltelijke neuroprotectie van de hippocampus. Ten slotte bracht een vergelijking van de bevindingen bij natuurlijk geïnfecteerde schapen versus een te groot muismodel (tg338 muizen) duidelijke patronen van TLR-genexpressie aan het licht.

Trefwoorden: prion; schrapie; tolachtige receptoren; neuro-ontsteking; microglia; astrocyten.

1. Inleiding

Overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's), of prionziekten, zijn een groep dodelijke neurodegeneratieve aandoeningen waaronder de ziekte van Creutzfeldt-Jakob (CJD) bij mensen, scrapie bij schapen en geiten, boviene spongiforme encefalopathie (BSE) bij rundvee en chronische ziekte bij hertachtigen. CWD).

Deze TSE's worden gekenmerkt door de transformatie van het door de gastheer gecodeerde prioneiwit (PrPC) in een infectieuze isovorm, PrPSc, die zich bij voorkeur ophoopt in het zenuwstelsel en het lymforeticulaire systeem (LRS), en een inflammatoire immuunreactie in het centrale zenuwstelsel (CZS) [1 ,2].Prionziekten, zoals scrapie, kunnen op natuurlijke wijze worden verkregen door orale blootstelling aan PrPSc.

Nadat het de darmbarrière is gepasseerd en primaire replicatie in lymfoïde weefsels heeft ondergaan, bereikt PrPSc het centrale zenuwstelsel via een proces dat bekend staat als neuro-invasie. De infectie plant zich voort vanuit plaatsen in het maagdarmkanaal via de vagus- en splanchnische zenuwen naar respectievelijk de hersenstam en het ruggenmerg [3,4].

Bij het bereiken van het CZS verspreidt PrPSc zich vanuit de caudale torostrale gebieden, dwz via de rostrale hersenstam naar het cerebellum, het diencephalon en de frontalcortex [5]. De anatomisch stereotiepe accumulatie van PrPSc suggereert dat de verspreiding ervan wordt gemedieerd door de neuronale connectiviteit en/of selectieve kwetsbaarheid van verschillende hersengebieden.

Gastheerfactoren zoals het PrPSc-genotype, het ras en de leeftijd bij infectie dragen bij aan de omvang van de PrPSc-afzetting en de verspreiding van spongiforme laesies.

De moleculaire basis van de gastheer-prion-interacties die de selectieve targeting van PrPSc naar specifieke hersengebieden bepalen, blijft echter onbekend en vormt een van de meest intrigerende aspecten van het fenomeen van prionspanning.

Oorspronkelijk werd aangenomen dat het immuunsysteem niet reageerde op PrPSc als gevolg van natuurlijke tolerantie, maar tijdsverloopstudies lieten snelle activering en proliferatie van microglia en astrocyten zien, zelfs vóór het begin van klinische symptomen en neuronale degeneratie [6–8].

Deze vroege activering en proliferatie van microglia en astrocyten lijkt een centrale rol te spelen in de pathogenese van prionaandoeningen, hoewel de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij hun activering en de precieze rol van zowel reactieve astrocyten als microglia in de ziektepathogenese onduidelijk blijven [9,10].

Bovendien wordt algemeen aanvaard dat de distributie en het fenotype van microglia en astroglia variëren tussen hersengebieden en soorten [11-14], waardoor aan elke regio intrinsieke kenmerken worden toegeschreven die de kwetsbaarheid voor neurodegeneratie beïnvloeden [10,15,16].

Dit fenomeen is vooral duidelijk in de preklinische fase, waarin zowel microglia als astroglia op een regiospecifieke manier reageren op prioninfectie.

Naarmate de ziekte vordert, begint echter een vaker voorkomende neuro-inflammatoire respons de overhand te krijgen, waardoor de meeste regionale kenmerken vervagen [17,18]. De afgelopen jaren is de rol van Toll-like receptoren (TLR’s) bij microgliale en astrogliale reactiviteit gerapporteerd. bij verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, wat hun invloed op de progressie van deze ziekten onderstreept [19-21].

Gegevens over de rol van TLRsin-prionziekten zijn echter schaars. Er is een gedeeltelijk beschermende rol van TLR's beschreven in de prionpathologie. Specifiek is gerapporteerd dat het verlies van TLR2 [22] en TLR4 [23] de pathogenese van prionen versnelt, terwijl TLR9-stimulatie de ziekteprogressie in muismodellen vertraagt ​​[24,25].

Tot op heden zijn de meeste onderzoeken naar TLR's bij prionziekten in vitro of met behulp van muismodellen uitgevoerd [8,22,26-29], en hun rol bij natuurlijk geïnfecteerde dieren en mensen blijft onzeker. Voor zover wij weten, werd één onderzoek uitgevoerd bij pasgeboren lammeren die oraal waren geïnoculeerd met scrapie (dwz met behulp van een natuurlijke, maar niet natuurlijk geïnfecteerde gastheer) en werd overexpressie van TLR2 en TLR4 in bloed gerapporteerd in klinische ziektestadia [30].

Twee onderzoeken hebben gewijzigde TLR-genexpressie gerapporteerd bij mensen met sporadische CJD(sCJD) [31,32]. De ontregeling van genen die betrokken zijn bij de immuunrespons omvatte de overexpressie van TLR4- en TLR7-mRNA in het cerebellum en de frontale cortex van sCJD MM1-patiënten en van TLR7 in het cerebellum van sCJD VV2-patiënten.

Bovendien heeft Areskeviciuteet al. [32] heeft TLR4 opgenomen in de top 40 van upstream-regulatoren waarvan wordt voorspeld dat ze differentiële expressie vertonen in sCJD versus controle-hersenmonsters. We onderzochten hoe natuurlijke scrapie-infectie de transcriptieniveaus van schaap-TLR's en sommige cytokines in vier hersengebieden met verschillende graden van priongevoeligheid beïnvloedt, gebaseerd op eerdere resultaten [18].

Kwantitatieve PCR (qPCR)-analyse onthulde veranderingen in de genexpressie in de met scrapie geïnfecteerde groep versus de controlegroep en een hersenregio-afhankelijke respons.

Interessant genoeg vertoonde de hippocampus het meest onderscheidende laesieprofiel, met specifieke reactieve microglia-morfologie en TLR-transcriptiepatroon. Gezien het gebrek aan experimentele gegevens over TLR-genexpressie bij muizen die schapen-PrP tot overexpressie brachten, hebben we ook experimenten uitgevoerd met behulp van tg338-muizen die intracerebraal waren geïnoculeerd met scrapie.

Onze resultaten laten enkele overeenkomsten zien met eerdere onderzoeken met wildtype muizen, maar significante verschillen wat betreft de bevindingen bij natuurlijke scrapie.

2. Resultaten

2.1. Scrapie-neuropathologie van natuurlijk geïnfecteerde schapen

We bevestigden eerst de scrapie-neuropathie bij de natuurlijk geïnfecteerde schapen die in dit onderzoek waren opgenomen, zoals eerder beschreven [33-36]. Spongiose, PrPSc-afzetting en reactiveglia werden onderzocht in vier regio's van de geïnfecteerde en controle-schapenhersenen: de medullaoblongata (Mo), thalamus (Th), hippocampus (Hc) en frontale cortex (Fc).

Alle natuurlijk geïnfecteerde dieren bevonden zich in het klinische stadium van de ziekte. De klinische status, gebaseerd op de frequentie en ernst van de klinische symptomen, varieerde echter tussen schapen, variërend van beginnende tot gevorderde klinische stadia (Tabel 1).

Figuur 1 toont representatieve microfoto's voor de beoordeling van vacuolatie en immuunkleuring voor PrPSc, GFAP en Iba1, genomen in elk van de geselecteerde regio's bij geïnfecteerde en controledieren.

Zoals verwacht werd er geen bewijs van vacuolatie of PrPSc-afzetting gedetecteerd in weefselcoupes van de controleschapen. Omgekeerd vertoonden alle neuroanatomische gebieden bij de met scrapie geïnfecteerde schapen spongiose, PrPSc-afzetting en reactieve glia (p < 0.05).

De intensiteit van vacuolatie, PrPSc-afzetting en gliosis namen af ​​van de medulla oblongata naar de frontale cortex. Interessant genoeg werden er, ondanks de nabijheid van de thalamus en de hippocampus, significante verschillen in de scores voor alle pathologische markers waargenomen.

De grootste mate van spongiose werd waargenomen in de medulla oblongata en de thalamus, in tegenstelling tot de zeer verspreide vacuolatie die werd aangetroffen in de hippocampus en de frontale cortex.

Intraneuronale vacuolatie was overvloedig aanwezig in de kernen van de medulla oblongata, zoals blijkt uit de dorsale motorische kern van de nervus vagus, terwijl neuropil spongiose de overhand had in de thalamus en de frontale cortex (Figuur 1A). Er werden zeer weinig vacuolen gevonden in de neuropil van de hippocampus.

Figuur 1. Representatieve neuropathologie en immunohistochemische beoordeling van spongiose, PrPSc-depositie, microgliose en astrogliose in het CZS van controle- en met scrapie geïnfecteerde schapen in themadulla oblongata (Mo), thalamus (Th), hippocampus (Hc) en frontale cortex (Fc) .

Grafieken tonen semi-kwantitatieve beoordelingswaarden voor elke geanalyseerde parameter. (A) Hematoxyline-eosinekleuring toonde spongioseveranderingen in het CZS bij met scrapie geïnfecteerde schapen, en de afwezigheid van spongiose bij controleschapen. (B) Detectie van PrPSc met L42-antilichaam in met scrapie geïnfecteerde hersengebieden van schapen.

Bij de controlegroep werd geen immunolabeling gedetecteerd. (C) Immunokleuring van het geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul-1(Iba1) liet een verhoogde microgliale reactiviteit zien bij met scrapie geïnfecteerde schapen versus controleschapen.

(D) Gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) immunokleuring die verhoogde reactieve astrogliose vertoont bij met scrapie geïnfecteerde schapen vergeleken met controleschapen. (E) Statistische vergelijkingen van spongiose, PrPScdeposition, Iba1 en GFAP-intensiteit tussen hersengebieden.

Scores variëren van 0 (negatief) tot 5 (maximale intensiteit). Significante verschillen in spongiose, PrPSc, Iba1 en GFAP werden bepaald met behulp van Student's t-test of Mann-Whitney U-test voor respectievelijk normaal en niet-normaal verdeelde gegevens.

Statistische verschillen tussen hersengebieden werden bepaald met behulp van eenzijdige variantieanalyse (ANOVA) of de Kruskal-Wallis-test voor respectievelijk normaal en niet-normaal verdeelde gegevens. * p < 0.05, ** p < 0,01. Schaalbalk=200 µm.

Alle met scrapie geïnfecteerde schapen vertoonden wijdverspreide PrPSc-accumulatie in de vier geanalyseerde CZS-regio's, behalve drie schapen die beginnende klinische symptomen vertoonden en PrPSc-negatief waren volgens bevindingen uit immunohistochemie (IHC) en Western blot (WB) in de frontale cortex (Tabel 1).

De intensiteit van de PrPSc-immunokleuring onthulde een afname van caudaal tot rostraal, vergelijkbaar met die waargenomen bij spongiose, met maximale intensiteit in de medullaoblongata en thalamus, de twee regio's met de grootste mate van vacuolatie, en een lagere intensiteit in de hippocampus en de frontale cortex (Figuur 1B).

In de hippocampus vertoonde PrPSc-immunokleuring een focale en ongelijkmatige verdeling, in tegenstelling tot het homogene, verspreide puntvormige patroon waargenomen in de frontale cortexsecties.

We hebben vier belangrijke morfologische patronen van PrPSc-afzetting waargenomen, zoals eerder beschreven [36]: twee intracellulaire patronen, waaronder intraneuronale en intragliale (inclusief intra-astrocytische en intramicrogliale) afzetting, en twee celmembraan/extracellulaire patronen, waaronder neuropil-geassocieerde en gliale cel-afzettingen. bijbehorende afzetting (Figuur S1).

De intraneuronale en neuropil-geassocieerde patronen overheersten in alle hersengebieden. Opmerkelijk genoeg waren de diepgang- en gliale patronen drastisch verminderd of zelfs afwezig in de frontale cortex en hippocampus vergeleken met de medulla oblongata en thalamus. Parallel met IHC analyseerden we de aanwezigheid van protease-resistente prionen (PrPres) door WB.

De hersenmonsters van met scrapie geïnfecteerde schapen vertoonden het klassieke driebandige PrPres-patroon geassocieerd met klassieke scrapie, met een molecuulmassa van het niet-geglycosyleerde fragment van ongeveer 19 kDa (Figuur 2).

Ondanks een zekere mate van variabiliteit nam het PrPres-signaal toe met de ernst van de klinische symptomen in alle hersengebieden en was het overvloediger in caudale hersengebieden.

De WB voor PrPres was positief in de medulla oblongata en thalamus bij alle met scrapie geïnfecteerde schapen. Daarentegen waren de monsters van de hippocampus en de frontale cortex niet bij alle geïnfecteerde dieren positief voor PrPres.

Hoewel de IHC positief was voor PrPres in de hippocampus van alle geïnfecteerde schapen, waren 4/13 negatief voor WB. In de frontale cortex was 3/13 van de schapen PrPres-negatief volgens IHC, en 4/13 was PrPres-negatief volgens WB.

Naast vacuolatie en PrPSc-afzetting is de activering van gliacellen uitgebreid gedocumenteerd als een vroege gebeurtenis in de pathogenese van ziekten die verkeerd vouwen.

Om de reactieve glia te karakteriseren, werden alle hersengebieden onderworpen aan IHC met behulp van anti-GFAP-antilichamen om astrocyten te detecteren en anti-Iba1-antilichamen om microglia te detecteren.

Iba1-immunokleuring, die zowel rustende als geactiveerde microglia detecteert [37], was significant verhoogd in alle hersengebieden bij met scrapie geïnfecteerde versus controleschapen en onthulde duidelijke verschillen in de microgliale morfologie tussen hersengebieden bij geïnfecteerde dieren (Figuur 1C).

De activeringsstatus van de microgliale cellen wordt gedefinieerd op basis van drie hoofdmorfologieën: vertakte, hypertrofische en ameboïde [38,39]. Microgliale cellen in de 'toezichthoudende' of relatief inactieve toestand hebben een vertakte morfologie, gekenmerkt door een klein cellichaam met veel fijne processen, zoals waargenomen bij onze controledieren.

De actieve toestand wordt gekenmerkt door een ameboïde morfologie, die gewoonlijk wordt geassocieerd met de fagocytische toestand [38] en bestaat uit bolvormige, niet-vertakte cellichamen. De hypertrofische morfologie wordt gekenmerkt door microglia met een groter cellichaam en kortere, dikke uitlopers, en wordt geassocieerd met de productie en afgifte van ontstekingsmediatoren [40,41].

De ameboïde morfologie was de meest voorkomende in de medulla oblongata van met scrapie geïnfecteerde schapen. In de thalamus werd de ameboïde morfologie waargenomen, maar deze overheerste niet: een verscheidenheid aan grote en dunne processen vermengd met schaarse, dikke processen die voortkomen uit langwerpige cellichamen, overeenkomend met hypertrofische microglia.

De morfologie van de proliferatieve microglia in de frontale cortex en de hippocampus verschilde aanzienlijk van die van de medulla oblongata en de thalamus. In beide regio's overheersten hypertrofische microglia en waren ameboïde microglia vrijwel afwezig.

Opmerkelijk genoeg vertoonde het Cornu Ammonis 3 (CA3)-gebied van de hippocampus de grootste verschillen in de morfologie van microglia, waarbij een microgliaal patroon werd vertoond dat bekend staat als staafmicroglia en dat in geen enkel ander hersengebied werd waargenomen.

Deze opmerkelijke verschillen die werden waargenomen bij de beoordeling van de hippocampus waren voor ons aanleiding om een ​​gedetailleerd onderzoek uit te voeren van de subvelden CA1, 3, 4 en het stratum lacunose-moleculair (SLM).

Figuur 2. Western blot-detectie van PrPres in het CZS van controle- en natuurlijke met scrapie geïnfecteerde schapen. Gelijke eiwithoeveelheden werden geladen voor adequate vergelijking, en immunoblots werden uitgevoerd met behulp van SHA31 monoklonaal antilichaam voor analyse van monsters van de (A) medulla oblongata, (B ) thalamus, (C) hippocampus en (D) frontale cortex van met scrapie geïnfecteerde schapen met beginnende klinische symptomen (monsters 1–5) en met gevorderde klinische symptomen (monsters 6–13). Regel 14 toont de negatieve controle en regel 15 een monster van niet-geïnfecteerde schapenhersenhomogenaat dat niet is onderworpen aan pK-digestie.

GFAP-immunokleuring onthulde duidelijke astrogliose bij met scrapie geïnfecteerde versus controleschapen (Figuur 1D). Morfologisch vertoonden de astrocyten van geïnfecteerde schapen consequent hypertrofische cellichamen en -processen, wat de aanwezigheid van reactieve astrogliose bevestigde, terwijl controleschapen de typische stermorfologie van de niet-geactiveerde toestand vertoonden.

In de medulla oblongata en thalamus was de GFAP-immunokleuring intenser, met het verschijnen van astrocytennetwerken als gevolg van overlappende processen. In de hippocampus en de frontale cortex waren de astrocyten gelijkmatig verdeeld, met de aanwezigheid van geïsoleerde hypertrofische sterlichamen.

For more information:1950477648nn@gmail.com