Echinacoside vertraagt ​​cellulaire veroudering van menselijke fibroblastische cellen MRC-5

Contactpersoon: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Het werkzame bestanddeel van Cistanche: Hoe gaat echinacoside veroudering tegen?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

In deze studie werden de effecten onderzocht van echinacoside, een van de fenylethanoïden geïsoleerd uit de stengels van Cistanches-salsa, een traditioneel Chinees kruidengeneesmiddel, op fibroblastische MRC-5-cellen van menselijke embryo's. De activiteit van celproliferatie werd geëvalueerd met Alamar Blue, wat aantoont dat behandeling met echinacoside de veroudering kan vertragen. Flowcytometrieresultaten tonen aan dat echinacoside cellen in de G1-fase zou kunnen triggeren om de S-fase en G2-fase binnen te gaan, en de ROS-afbraak zou kunnen verbeteren. De resultaten van de komeettest geven aan dat echinacoside cellen zou kunnen beschermen tegen DNA-schade, waardoor het mechanisme van de effecten gedeeltelijk wordt opgehelderd. Alle bovenstaande resultaten suggereren dat echinacoside potentiële anti-senescentie-activiteit heeft.

Cistanche deserticola heeft veel effecten, klik hier voor meer informatie

1. Inleiding

Normale in vitro gekweekte cellen prolifereren gedurende een beperkt aantal populatieverdubbelingen (de 'Hayflflick-limiet') en komen in een stadium van replicatieve veroudering. Senescente cellen ondergaan een celgroeistop in de G1-fase en een verandering in morfologie en metabolisme, waaronder cellulaire vergroting, verhoogde lysosoombiogenese en expressie van hogere galactosidase-activiteit bij pH 6 (senescentie-geassocieerde -galactosidase, SA- - -Gal ) (Hayflflick en Moorhead 1961; Dimri 1995). De accumulatie van senescente cellen voorspelt de leeftijdsgerelateerde afname vanzakdoek/orgaanfuncties. Om toegang te krijgen tot de manier om veroudering uit te stellen of om te keren, zijn de inspanningen om actieve anti-verouderingsstoffen te ontdekken nooit opgehouden.Echinacosideis een van de fenylethanoïden geïsoleerd uit stengels vanCistanches salsa, een traditioneel Chinees kruidengeneesmiddel, dat potentiële biologische activiteiten heeft, zowel als antiserum enanti vermoeidheidmiddel (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). Er is ook gemeld dat het zich in vitro gedraagt ​​als een potentvrijradicaalaaseter(Facino et al. 1995) en expositiesneuroprotectiefactiviteitenin vitro en in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Echinacoside kan een kandidaat zijn voor een anti-verouderingsstof en een anti-verouderingsactiviteit kan een van de biologische eigenschappen zijn. Dus behandelden we een verouderde menselijke embryo-longfibroblastische cellijn MRC-5 met echinacoside, in de verwachting dat het de veroudering zou kunnen vertragen of omkeren.

2. Onderzoeken en resultaten

Ten eerste hebben we echinacoside aan het kweekmedium toegevoegd om de invloed ervan op celgroei en celcycli te controleren. Er werd waargenomen dat de levensvatbaarheid van de cellen met 48 uur blootstelling aan echinacoside duidelijk toenam ten opzichte van de controle, naarmate de concentratie toenam (Fig. 1A), wat aangeeft dat echinacoside verouderde cellen hielp prolifereren. Het resultaat van SA-Gal-kleuring toonde aan dat het niveau van SA--Gal duidelijk afnam na behandeling met echinacoside (gegevens niet getoond), wat suggereert dat een deel van de senescente cellen was omgekeerd van senescentie. Om te bevestigen of senescente cellen inderdaad werden voortgestuwd om te prolifereren door echinacoside, werd collega-cytometrie geïntroduceerd om de celcyclusfaseverandering van de senescente MRC-5-cellen na behandeling met echinacoside te controleren. In onze studie zagen we dat met de toename van de concentratie Echinacoside, de verhouding van cellen in de G1-periode geleidelijk werd verminderd. Integendeel, er werden meer cellen gedreven om de S-fase en G2-fase binnen te gaan (figuur 1B). De accumulatie van senescentie-geassocieerde heterochromatin foci (SAHF) is een andere specifieke biomarker van senescente cellen (Shay en Wright 2001). Senescente cellen vertoonden onderbroken DNA-foci die werden gevisualiseerd door Hoechst-kleuring (figuur 1C). Daarentegen bleken MRC-5-cellen behandeld met echinacoside minder SAHF te hebben.

Het niveau van reactieve zuurstofsoorten (ROS) neemt toe naarmate cellen de Hayflflick-limiet naderen (Hutter et al. 2002). Continue behandeling van cellen met subletale niveaus van ROS verhoogt niet alleen het niveau van oxidatieve schadeproducten zoals lipofuscine (Sitte et al. 2001), maar veroorzaakt ook permanente groeistilstand vergezeld van de activering van de p53-groeiremmende route (Toussaint et al. 2000). Daarom speelt ROS op cellulair niveau een sleutelrol bij het induceren van senescentie. De FL-fluorescerende kleurstof DCFH-DA werd gebruikt om ROS-inhouden te meten met collega-cytometrie. Er werd aangetoond dat in vergelijking met de controle de ROS-inhoud duidelijk was afgenomen in cellen die waren geïncubeerd met echinacoside (Fig. 2A). Deze resultaten geven aan datechinacosidekan werken als een antioxidant, waardoor de ROS-productie wordt verlaagd of de ROS-verwijdering wordt versneld.

Geaccumuleerde reactieve zuurstofsoorten (ROS) veroorzaken de opmerkelijke verslechtering van macromoleculen in cellen, waaronder eiwitten, DNA en telomeren (Kovtun et al. 2007). Oxidatieve DNA-schade veroorzaakt p53-afhankelijke G1-groeistop, na de expressie van p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) en celveroudering in normale menselijke fibroblasten. We gebruikten een komeettest om de DNA-schade en het herstel ervan te meten. De grootte van DNA-fragmenten en het aantal breuken bepalen de migratie en het patroon van de geziene komeet. Staart-DNA-gehalte (product van staartlengte en staart-DNA-gehalte) neemt toe met schade. Onze resultaten laten zien dat voorbehandeling met echinacoside het herstel van DNA-schade gedeeltelijk kan bevorderen, in ieder geval de cellen kan beschermen tegen DNA-laesies veroorzaakt door H2O2 (Fig. 2B). Op basis van deze feiten concluderen we dat echinacoside anti-senescentie-activiteit heeft, in ieder geval in MRC-5-cellen. De resultaten van onze studie laten zien dat echinacoside de accumulatie van ROS kan verminderen, cellen kan beschermen tegen DNA-schade, MRC-5-cellen van de G1-fase naar de S- en G2-fasen kan bevorderen en zo de proliferatie van de cellen kan verbeteren. Over het algemeen kunnen de effecten van echinacoside op MRC-5-cellen worden onderverdeeld in twee aspecten: het bevorderen van celproliferatie en het verminderen van ROS-accumulatie. Hoewel het precieze mechanisme van celveroudering nog onbekend is en het netwerk van celcyclusregulatie controversieel blijft, hebben we aangetoond dat echinacoside cellen kan beschermen tegen oxidatieve schade. We speculeren daarom datechinacosidezou een goede kandidaat kunnen zijn voor het reguleren van veroudering, hoewel het precieze onderliggende mechanisme een open vraag blijft en verdere studies aan de gang zijn.

3. Experimenteel

3.1. Celkweek en behandeling

Menselijke embryonale longfibroblastische cellijn MRC{{0}} (Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, CAS) werd in gemodificeerd minimaal essentieel medium (Gibco/BRL) gehouden en aangevuld met 10 procent foetaal runderserum. MRC-5-cellen ondergaan replicatieve veroudering na meerdere celpassages, beoordeeld aan de hand van de vertraging van het metabolisme en de stopzetting van de deling binnen 7 dagen. Alle kweken werden uitgezaaid bij een celdichtheid van 104/cm2, tenzij anders vermeld, en men liet ze 7 dagen ongestoord prolifereren. Verschillende concentraties echinacoside werden 48 uur voor onderzoek toegevoegd met oplosmiddel als controle, tenzij anders vermeld. De concentratie DMSO in kweken was minder dan 0,3 procent (v/v). Voor H202-behandeling werden cellen gedurende 12 uur geïnduceerd met 250 M H202.

3.2. Overlevingspercentage test

Cellen werden gekweekt en behandeld met echinacoside op platen met 96 putjes. Vóór detectie werd 10 procent Alamar BlueTM aan het medium toegevoegd en gedurende 4 uur geïncubeerd. De absorptie werd gemeten met een spectrofotometer.

3.3. Flowcytometrie-analyse

Flowcytometrie werd geïntroduceerd om de DNA-inhoud en intracellulaire ROS-niveaus te meten met respectievelijk propidiumjodide en DCFH-DA. Cellen werden uitgeplaat met een dichtheid van 105 cellen/10 ml celoplossing in schalen met een diameter van 100 mm en aangevuld met echinacoside gedurende 48 uur na het uitzaaien van de cellen. Na 48 uur behandeling werden de cellen geoogst en gewassen in PBS na centrifugatie, daarna opnieuw gesuspendeerd in PBS-oplossing met 0,1 procent RNase en 50 g/ml propidiumjodide of kweekmedium dat 10 M DCFH-DA bevatte gedurende 30 minuten. DNA- of ROS-gehalten werden vervolgens bepaald door FL-fluorescentie-geactiveerde celsortering op een Beckman Coulter Flow Cytometry System. De gegevens zijn geanalyseerd door MultiCycle-software.

3.4. Hoechst-kleuring

Cellen werden gekweekt en behandeld met echinacoside gedurende 48 uur op een plaat met 96 putjes. Het medium werd verwijderd, de cellen werden gewassen met PBS, vervolgens gefixeerd met 4% formaldehyde in PBS gedurende 20 minuten, gevolgd door eenmaal wassen met PBS en gekleurd met Hoechst-kleurstof gedurende 10 minuten. Er werden foto's gemaakt.

3.5. Eencellige gelelektroforese (komeettest)

Comet-assay werd uitgevoerd zoals gerapporteerd (Olive en Banath 2006). Individuele komeetbeelden werden geanalyseerd met CometScore-software. Erkenning: Dit werk werd financieel ondersteund door het National Basic Research Program (973 Project) van China (nr. 2007CB507406), de National Natural Science Foundation of China (nr. 30572341) en het Tsinghua-Yue-Yuen Medical Sciences Fund (THYY20070008 ).