Echinacoside keert myocardiale remodellering om en verbetert de hartfunctie

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Abstract

Myocardiale remodellering is een belangrijke pathologische basis van HF, mitochondriale oxidatieve stress is een promotor van myocardiale hypertrofie, fibrose en apoptose. ECH is het belangrijkste actieve bestanddeel van een traditioneel Chinees medicijn Cistanches Herba, tal van onderzoeken geven aan dat het een sterke antioxidantcapaciteit heeft in zenuwcellen en tumoren, het remt mitochondriale oxidatieve stress, beschermt de mitochondriale functie, maar het specifieke mechanisme is onduidelijk. SIRT1/FOXO3a/MnSOD is een belangrijke antioxidant-as, uit onderzoek blijkt dat ECH covalent bindt aan SIRT1 als een ligand en de expressie van SIRT1 in hersencellen opwaarts reguleert. We veronderstellen dat ECH myocardiale remodellering kan omkeren en de hartfunctie van HF kan verbeteren door de SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signaleringsas te reguleren en mitochondriale oxidatieve stress in cardiomyocyten te remmen. Hier induceren we eerst een cellulair model van oxidatieve stress door ISO met AC-16-cellen en behandelen we met ECH, het niveau van mitochondriale ROS, mtDNA oxidatieve schade, MMP, gecarbonyleerd eiwit, lipideperoxidatie, intracellulaire ROS en apoptose worden gedetecteerd, bevestigen het effect van ECH op mitochondriale oxidatieve stress en functioneren in vitro. Vervolgens stellen we een HF-ratmodel op, geïnduceerd door ISO en voorbehandeling met ECH. Indexen van hartfunctie, myocardiale remodellering, mitochondriale oxidatieve stress en functie, expressie van SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signaalas worden gemeten, de gegevens geven aan dat ECH de hartfunctie verbetert, myocardiale hypertrofie, fibrose en apoptose verhoogt de expressie van SIRT1/FOXO3a/ MnSOD-signaleringsas, vermindert de mitochondriale oxidatieve schade, beschermt de mitochondriale functie. We concluderen dat ECH de hermodellering van het myocard omkeert en de hartfunctie verbetert door de SIRT1/FOXO3a/MnSOD-as te verhogen en mitochondriale oxidatieve stress in HF-ratten te remmen.

KEYWORDSechinacoside, hartfalen, mitochondriale oxidatieve stress, myocardiale remodellering

verse kruiden cistanchetotmitochondriale oxidatieve stress

1|INVOERING

Hartfalen (HF) is de uiteindelijke uitkomst van de meeste hart- en vaatziekten met een hoge prevalentie en slechte prognose, en met de verergerende trend van een vergrijzende bevolking, namen de ziekenhuisopnames en mortaliteit als gevolg van chronisch hartfalen (CHF) wereldwijd sterk toe.1 In de afgelopen 20 jaar hebben medicamenteuze behandelingen voor HF grote vooruitgang geboekt, maar het effect is zeer beperkt, dus nieuwe medicijnen zijn dringend nodig. Myocardiale remodellering is een belangrijke pathologische basis van HF en wordt gekenmerkt door myocardiale hypertrofie, apoptose, interstitiële fibrose, de myocardiale cellen zijn gedesorganiseerd en leiden tot een vermindering van de ejectiefractie (LVEF), een toename van de einddiastolische en systolische afmetingen van het linkerventrikel (LVIDd en LVIDs), en afname van linkerventrikel fractionele verkorting (LVFS).2 Maar de onderliggende mechanismen werden nog steeds niet volledig begrepen. In de afgelopen jaren hebben talrijke onderzoeken bevestigd dat oxidatieve stress een belangrijke promotor is van myocardiale remodellering.3-7

Oxidatieve stress is een aandoening waarbij reactieve zuurstofsoorten (ROS) of vrije radicalen overmatig worden gegenereerd en leiden tot oxidatieve schade aan celcomponenten, wat op zijn beurt celdisfunctie veroorzaakt.8 Mitochondriën zijn de belangrijkste bron van intracellulaire ROS, als gevolg van lekkage uit de respiratoire elektronentransportketen en mitochondriën zijn de meest gevoelige positie voor de ROS-effecten.9 Studies in HF identificeerden verhoogde ROS-generatie van complex I van de respiratoire keten.8 Verhoogde ROS-productie valt eerst mitochondriale componenten aan en resulteert in overmatige oxidatieve stress , manifesteert zich als carbonylering van eiwitten, lipideperoxidatie en DNA-schade,10 en disfunctie van mitochondriën, wat bijgevolg leidt tot overmatige vorming van ROS,8 vormt een vicieuze cirkel. Het is aangetoond dat de aanhoudende oxidatieve stress myocardiale hypertrofie en myocardiale fibrose kan veroorzaken,11-13 en apoptose van myocardcellen kan veroorzaken door activering van mitochondria-afhankelijke apoptose als gevolg van carbonylering van mitochondriale membraaneiwitten en verlies van mitochondriaal membraanpotentieel.14 Dus , wordt aangenomen dat remming van mitochondriale oxidatieve stress een nieuwe strategie kan zijn om myocardiale remodellering en zelfs HF te voorkomen.15-17

Echinacoside (ECH), een natuurlijk fenylethanoïde glycoside, is het belangrijkste actieve bestanddeel van Cistanches Herba, de traditionele Chinese geneeskunde. In de afgelopen jaren is ECH uitgebreid bestudeerd in het zenuwstelsel en tumoren, en er is gemeld dat het een verscheidenheid aan farmacologische effecten bezit, zoals antioxiderende, ontstekingsremmende, anti-apoptose en anti-tumor eigenschappen.18,19In zenuwcellen, ECH verbetert de antioxidantcapaciteit aanzienlijk, vermindert de ROS-productie, verbetert het mitochondriaal membraanpotentieel (MMP) en verhoogt de levensvatbaarheid van de cellen, vertoont beschermende effecten op de mitochondriale functie en remt mitochondriale oxidatieve stress, het beschermt tegen oxidatieve schade en verbetert het geheugen, voorkomt uiteindelijk neurodegeneratie.21,22 ECH verhoogt ook de activiteit van SOD en speelt een beschermende rol in hersenweefsel en netvliesweefsel,19,23 maar het specifieke mechanisme voor het antioxiderende effect is onduidelijk.

SIRT1 is nauw verwant aan oxidatieve stress, en SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signaalas is de belangrijkste antioxidantas en is verantwoordelijk voor de onderdrukking van mitochondriale oxidatieve stress, MnSOD verspreidt zich wijd in mitochondriën en is primair verantwoordelijk voor het opruimen van mitochondriale ROS, dus remming van oxidatieve stress, verbindingen die deze antioxidant-as activeren, kunnen oxidatieve stress remmen.24,25 Recente onderzoeken hebben aangetoond dat ECH zijn farmacologische effecten uitoefent via het reguleren van meerdere signaalroutes, zoals p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads , en SIRT1-signaleringsroute. 26-29 een nieuwe studie vindt dat ECH covalent bindt aan SIRT1 als een ligand en de expressie van SIRT1 in hersencellen opwaarts reguleert.26Het suggereert dat ECH mitochondriale oxidatieve stress in cardiomyocyten kan remmen en myocard kan omkeren verbouwing. Onderzoek naar de effecten van ECH heeft zich echter gericht op het zenuwstelsel of de tumor, de effecten en mechanismen van ECH op mitochondriale oxidatieve stress in cardiomyocyten en myocardiale remodellering blijven onbekend. Hier induceren we eerst een cellulair model van oxidatieve stress door ISO en bevestigen we het effect van ECH op mitochondriale oxidatieve stress en functie in vitro. Vervolgens stellen we een HF-ratmodel op, geïnduceerd door ISO en demonstreren we dat ECH de myocardiale remodellering omkeert en de hartfunctie verbetert door de SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signaleringsas te verhogen en mitochondriale oxidatieve stress bij HF-ratten te remmen. De resultaten zijn bedoeld om experimenteel bewijs te leveren voor de ontwikkeling van nieuwe medicijnen om hartfalen te voorkomen.

2|MATERIALEN EN METHODES

2.1|Celkweek en behandeling

AC16-cellen worden gekocht bij Bena Culture Collection. De cellen worden bewaard in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium met hoog glucosegehalte (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, VS) aangevuld met 10 procent foetaal runderserum (10 procent FBS; Gibco) in T-75 kolven (Corning Glassworks, Corning, New York, VS). De omstandigheden worden op 37 graden gehouden in een bevochtigde atmosfeer die 5 procent CO2 bevat. Zodra de cellen 70 procent -80 procent samenvloeiing bereiken, worden ISO (Sigma, VS) groepscellen 24 uur geïncubeerd met een medium dat 10 uM ISO (Sigma, VS) bevat, ECH-groepscellen worden voorbehandeld met 50 uM ECH (MCE , VS) gedurende 30 minuten voorafgaande ISO-belichting. Controlecellen (Ctrl) worden niet behandeld.

cistanche te koopextract

2.2|Detectie van mitochondriaal ROS-niveau met behulp van luminol-chemiluminescentie

Mitochondriën worden geïsoleerd en gezuiverd uit AC-16-cellen met behulp van de Mitochondria Isolation Kit (Sigma, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Eiwitconcentraties worden bepaald door de BCA-eiwittestkit (Biotech). Mitochondriaal ROS-niveau wordt gedetecteerd door luminaal (3-aminoftaalhydrazide 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazinedion) met behulp van een Elisa-kit (GERMED SCIENTIFIC INC, VS), het reageert met ROS en veroorzaakt de emissie van fotonen, wat een bandspectrum is met een piek bij ongeveer 460 nm, en de Relative Light Unit (RLU) wordt gedetecteerd door een chemiluminescentie-meetinstrument en omgezet in RLU/ug mitochondriaal eiwit.

2.3|8-OHdG wordt gebruikt om de oxidatieve schade van mitochondriaal DNA te evalueren

De oxidatieve schade van mitochondriaal DNA wordt geëvalueerd door de inhoud van 8-Hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHG) te detecteren. Gezuiverde mitochondriën in cellen worden geïsoleerd met behulp van een mitochondria-isolatiekit zoals hierboven (Sigma). Eiwitconcentraties worden bepaald door de BCA-eiwittestkit (Biotech). Vervolgens worden ze gedissocieerd om het niveau van 8-OHdG te bepalen met behulp van een Elisa-kit (GERMED SCIENTIFIC INC, VS) volgens de instructies van de fabrikant. De absorptie van de kleurverandering wordt gemeten in een spectrofotometer bij de golflengte van 450 nm. De concentratie van 8-OHdG in de monsters wordt vervolgens bepaald door de OD van de monsters te vergelijken met de standaardcurve en omgerekend naar ng/ml.

2.4|Meting van MMP door JC-1

Mitochondriën worden geïsoleerd en gezuiverd van AC-16 en de eiwitconcentratie wordt bepaald zoals hierboven vermeld. Vervolgens worden de mitochondriën geresuspendeerd met een concentratie van 1 mg/ml, de MMP wordt gemeten met een JC-1-assaykit volgens de instructies van de fabrikant. De fluorescentie-intensiteit wordt gemeten bij excitatiegolflengte: 490nm, spleet 5nm, emissiegolflengte: 590 nm, spleet 5nm met een spectrofotometerinstrument,30 de resultaten worden weergegeven als FLU/ugP.

2,5|Detectie van apoptotische cellen door flowcytometrie in AC-16-cellen

Flowcytometrie wordt gebruikt om cellulaire apoptose te beoordelen. Een Annexin V-FITC/PI apoptose-detectiekit (CWBIO, China) wordt gebruikt om apoptotische en necrotische cellen te detecteren volgens de instructies van de leverancier. Apoptose in een vroeg stadium, apoptose of necrose in een laat stadium, celafval en levensvatbare cellen worden geïdentificeerd als annexine V (plus)/PI (−), annexine V (plus)/PI (plus), annexine V (−)/PI ( plus ) en annexine V (−)/PI (−), respectievelijk. Fluorescentie-intensiteiten worden geanalyseerd met behulp van een flowcytometer (BD FACVerse ™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, VS). Elk experiment wordt 3 keer herhaald.

2.6|De intracellulaire ROS beoordeeld door flowcytometer

Na behandeling worden cellen getrypsiniseerd, tweemaal gewassen met PBS. De cellen worden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS, gekleurd met DCFH-DA (Beyotime, China) bij de eindconcentratie van 1 M en 1 uur bij 37 graden geïncubeerd in een incubator met CO2, en vervolgens getest in een flowcytometer bij 488 nm excitatie . De fluorescentie-intensiteit vertegenwoordigt het niveau van intracellulaire ROS.

2.7|Test het carbonylproteïnegehalte in mitochondriën van AC-16-cellen

Na behandeling worden gezuiverde mitochondriën geïsoleerd en gesoniceerd op ijs en behandeld met 1 procent streptomycinesulfaat om mitochondriale nucleïnezuren neer te slaan, de eiwitconcentratie wordt bepaald. Het carbonyleiwitgehalte wordt getest met een Elisa-kit (GERMED SCIENTIFIC INC, VS) op basis van derivatisering van de carbonylgroep met dinitrofenylhydrazine (DNPH), volgens de instructies van de kit, wordt de OD gemeten door een microplaatlezer en omgezet in nmol/ mg eiwit door te vergelijken met de standaardcurve.

2.8|Bepaling van het lipideperoxidatieniveau in mitochondriën van AC-16-cellen

Na behandeling worden cellen verzameld en gelyseerd, mitochondriën worden geïsoleerd en gezuiverd en gekraakt met ultrageluid, eiwitconcentratie wordt bepaald door de BCA-eiwittestkit (Biotech), lipideperoxidatie wordt bepaald door het niveau van malondialdehyde (MDA) via de TBARS-test , met behulp van een kit (Nan jing Jian cheng, China) en het MDA-niveau wordt gemeten volgens het protocol van de fabrikant. OD wordt gedetecteerd bij 586 nm door een microplaatlezer en omgezet in mol/g eiwit door te vergelijken met de standaardcurve.

2.9|Dieren en behandeling

Jonge mannelijke Sprague-Dawley-ratten met een gewicht van 120-140g zijn verkregen van het Xi'an Jiao tong University Laboratorial Animal Centre (Shaanxi, China). Het onderzoek is in overeenstemming met The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, gepubliceerd door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH-publicatie nr. 85-23, herzien in 1996), en de experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de lokale autoriteiten ( Biomedische Ethische Commissie van de medische afdeling van Xi 'a Jiao Tong University). Het rattenmodel van HF is vastgesteld zoals eerder door ons beschreven.31 Kort samengevat wordt Isoproterenol (10 mg/kg) eenmaal daags toegediend via intraperitoneale injectie gedurende 2 weken (gedefinieerd als HF-groep), ECH wordt toegediend met 20 ug/g eenmaal daags door intraperitoneale injectie 30 minuten voordat ISO wordt behandeld (gedefinieerd als ECH-groep), en de toediening duurt 2 weken. Controledieren krijgen 0,9 procent NaCl toegediend (gedefinieerd als Ctrl-groep). Echocardiografische metingen worden uitgevoerd om de hartfunctie te evalueren.

2.10|Echocardiografische metingen

Dieren worden verdoofd door een intraperitoneale injectie van 300 mg/kg chloraalhydraat. Het SONOS-2500 ultrasone systeem met een ultrasone transducer van 7,5 MHz (HP, VS) wordt gebruikt om echocardiografische onderzoeken uit te voeren. De linker ventriculaire ejectiefractie (LVEF), linker ventriculaire fractionele verkorting (LVFS), linker ventriculaire eind-diastolische afmetingen (LVIDd), linker ventriculaire eind-systolische afmetingen (LVIDs), hartslag (HR), interventriculaire septum dikte in diastole (IVSTd ), worden de dikte van de linkerventrikelachterwand in diastole (LVPWTd) gemeten zoals eerder door ons beschreven.32

AFBEELDING 1 50μmol ECH remt effectief mitochondriale oxidatieve stress van AC-16-cellen, geïnduceerd door 10μmol/L ISO en beschermt de mitochondriale functie en vermindert apoptose.

2.11|Hartgewicht-lichaamsgewichtverhouding (HW/BW) wordt gemeten

Rat wordt gewogen voor verdoving, het verse hart wordt geïsoleerd en het bloed wordt weggespoeld met 0.1mol/L PBS, bloedvaten en ander overtollig weefsel worden weggesneden en het hart wordt gewogen, vervolgens wordt HW/BW (mg/100g) berekend.

2.12|histologische kleuring

De harten van ratten worden ontleed en gefixeerd in 4 procent paraformaldehyde, ingebed in paraffine en in plakjes van 5 m dik gesneden. Hematoxyline-Eosine (HE) kleuring wordt gebruikt om de pathologische veranderingen waar te nemen en Masson's trichroom wordt gebruikt om collageenvezels van myocardweefsel van ratten te evalueren. De cardiale collageenvolumefractie (CVF) en het dwarsdoorsnede-oppervlak van hartspiercellen wordt gemeten met Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, VS).

2.13|TUNEL-kleuring

Myocardiaal weefsel van de linker hartkamer wordt verzameld en de TUNEL-assay wordt uitgevoerd zoals eerder door ons beschreven

2.14|Transmissie elektronenmicroscoop

Vers hartweefsel wordt gefixeerd in 2,5 procent glutaaraldehyde bij 4 graden, weefsel wordt vervolgens gesneden in een volume van 1 mm3 en opnieuw gefixeerd in 2,5 procent glutaaraldehyde bij 4 graden gedurende 2 uur, vervolgens gewassen met 0.1mol/L PBS, gefixeerd in 1 procent osmische zuur, gedehydrateerd met aceton, ingebed met epoxyhars, worden ultradunne plakjes gemaakt die ongeveer 800 nm dun zijn, gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat, en vervolgens bekeken onder een transmissie-elektronenmicroscoop (H{ {13}}, Hitachi Limited, Japan). Om het beschermende effect van ECH in mitochondriale morfologie te kwantificeren, worden de gemiddelde mitochondriale omtrek, het gemiddelde mitochondriale dwarsdoorsnede-oppervlak, het percentage degeneratie en het percentage vacuolisatie in mitochondriën statistisch geanalyseerd met Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, VS).

2.15|Kwantitatieve PCR

Totaal RNA wordt bereid uit linkerventrikelweefsel met Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, VS). cDNA wordt gesynthetiseerd met behulp van de TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan). Specifieke primersequenties van collageen I die voor real-time PCR worden gebruikt, zijn als volgt: vooruit: 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, omkeren: 5'-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH forward 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', reverse 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Realtime kwantitatieve PCR (qPCR) wordt uitgevoerd met SYBRPremix Ex Taq (perfecte realtime) (Takara, Japan). Het relatieve mRNA-niveau wordt berekend door te normaliseren naar GAPDH, volgens de 2-ΔΔCT-methode.

2.16|Western-blot-analyse van SIRT1, FOXO3a, MnSOD-eiwitexpressie

Totaal eiwit van linkerventrikelweefsel wordt op ijs geëxtraheerd met behulp van koude RIPA-buffer (BioRad, VS) met proteaseremmercocktail (Sigma-Aldrich). De concentratie wordt bepaald door de BCA-methode. Procedures van Western blot zijn eerder beschreven.33 In het kort wordt het eiwitmonster gefractioneerd op 15 procent natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegels, overgebracht naar PVDF-membranen (BioRad, VS), geblokkeerd door 5 procent magere melk en geïncubeerd met MYH-antilichaam van muizen (verdund 1:200, Santa Cruz, VS). Vervolgens geïncubeerd met een met mierikswortelperoxidase geconjugeerd geitenmuis-antilichaam (verdund 1: 2, 000, Santa Cruz, VS). Het relatieve eiwitniveau wordt berekend door de gemiddelde straalwaarde te normaliseren tot -actine. Eiwitbanden worden gedetecteerd door een chemiluminescentiesysteem (ChemiDoc XRS, BioRad).

2.17|Meting van mitochondriale oxidatieve stress in het myocardium van de rat

Gezuiverde mitochondriën van rattenmyocardium worden geïsoleerd met behulp van Mitochondria Isolation Kit (Sigma, VS) volgens de instructies van de fabrikant, mitochondriale ROS, MMP, oxidatieve schade van mtDNA, gecarbonyleerd eiwitgehalte en lipideperoxidatieniveau in mitochondriën worden allemaal gedetecteerd met behulp van dezelfde methoden als hierboven beschreven celexperimenten. Merk op dat ROS in myocardweefsel wordt gedetecteerd met DCFH-DA fluorescerende sondes, fluorescentie-intensiteit wordt gedetecteerd met het meetinstrument voor enzymlabeling, de resultaten worden weergegeven als RLU/ug mitochondriaal eiwit.

2.18|statistische analyse

Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± SEM. One-way ANOVA wordt gebruikt om verschillen tussen meerdere groepen te vergelijken, gevolgd door de Tukey post hoc-test voor significantie. Alle statistieken worden bepaald met behulp van SPSS15.0-software (SPSS Inc, IL, VS). Een waarschijnlijkheidswaarde van P < .05="" wordt="" als="" significant="">

3|RESULTATEN

3.1|50 μM ECH remt effectief mitochondriale oxidatieve schade en apoptose in AC-16-cellen

Onbehandelde cellen worden ingesteld als een Ctrl-groep. Ten eerste, zoals figuur 1A laat zien, remt ECH mitochondriale ROS geïnduceerd door ISO. Met ISO behandelde cellen vertonen een significante toename in mitochondriale ROS in vergelijking met Ctrl en deze toename wordt aanzienlijk verzwakt door voorbehandeling met 50 μM ECH. Ten tweede kan ECH oxidatieve schade van mtDNA geïnduceerd door ISO remmen. 8-OHdG wordt beschouwd als een van de meest voorkomende DNA-laesies als gevolg van oxidatieve stress en is een biomarker voor oxidatieve DNA-schade en reparatie. Zoals figuur 1B laat zien, wordt het gehalte aan 8-OHdG in gezuiverde mitochondriën van AC-16-cellen gedetecteerd, de resultaten laten zien dat het niveau van 8-OHdG in mitochondriën van met ISO behandelde cellen dramatisch toenam, maar de verandering werd teruggedraaid door 50 M ECH. Ten derde is ECH effectief om de MMP te beschermen, die wordt aangetast door ISO. De fluorescentie-intensiteit is significant verlaagd in cellen die zijn behandeld met ISO in vergelijking met Ctrl-cellen, terwijl voorbehandeling met 50 μM ECH de reductie van MMP opmerkelijk verzwakt, zoals figuur 1C laat zien. Ten vierde beschermt ECH tegen oxidatieve schade van mitochondriaal eiwit in AC-16-cellen. Zoals figuur 1D laat zien, is het carbonyl-eiwitgehalte in mitochondriën van ISO-behandelingscellen aanzienlijk verhoogd en verzwakt ECH het effect. Ten vijfde remt ECH ook de door ISO geïnduceerde mitochondriale lipideperoxidatie in AC-16-cellen. Zoals figuur 1E laat zien, is het niveau van lipideperoxiden in mitochondriën van ISO-cellen duidelijk hoger dan dat van Ctrl-cellen, terwijl deze toename aanzienlijk wordt verminderd door 50 μM ECH-voorbehandeling. Uiteindelijk remt ECH de accumulatie van intracellulaire ROS. Zoals figuur 1F laat zien, is het niveau van intracellulaire ROS in ISO-cellen aanzienlijk verhoogd en aanzienlijk verlaagd in voorbehandelde ECH-cellen. Figuur 1G laat zien dat de apoptosesnelheid van AC -16-cellen significant verhoogd is na 24 uur incubaties met 10 M ISO, vergeleken met de Ctrl-cellen, terwijl voorbehandelingscellen met 50 μM ECH de ISO-geïnduceerde apoptose aanzienlijk verminderen.

FIGUUR 2 Harthypertrofie van HF-ratten geïnduceerd door ISO wordt verlicht en de hartfunctie wordt significant verbeterd door ECH-behandeling.

3.2|ECH keert myocardiale remodellering om en verbetert de hartfunctie van ISO-geïnduceerde HF-ratten

Zoals weergegeven in figuur 2A, zijn harten in HF-ratten duidelijke hypertrofie en worden ze omgekeerd door behandeling met ECH. Zoals de figuren 2B-D en L laten zien, vermindert ECH de HW/BW. Echocardiografische resultaten laten zien dat LVEF en LVFS significant verlaagd zijn in de HF-groep, LVIDd, LVIDs en IVSTd significant verhoogd in de HF-groep. ECH verlaagt echter significant LVIDd, LVIDs, IVSTd en verbetert LVEF en LVFS, er is geen significant verschil in HR tussen de drie groepen, LVPWTd is verhoogd in HF, maar geen verschil tussen ECH en Ctrl, of tussen ECH en HF, allemaal zoals Figuur 2E-K toont. Resultaten van HE-kleuring geven aan dat de myocardiale hypertrofie, geordende stoornis of degeneratienecrose, infiltratie van inflammatoire cellen en interstitiële hyperemie en oedeem bij HF-ratten, en ECH deze schade aanzienlijk verlicht, myocardiale hypertrofie en gearrangeerde stoornis zijn verlicht, de degeneratienecrose en ontstekingsinfiltraat worden verminderd, zoals weergegeven in figuur 3A. Het dwarsdoorsnede-oppervlak van de cardiomyocyt wordt gemeten, het wordt aanzienlijk verhoogd na ISO en wordt verlaagd in de met ECH behandelde groep, zoals figuur 3E laat zien. Beoordelingen van collageenafzetting door Masson-kleuring onthullen dat het linkerventrikelcollageengehalte in HF-ratten duidelijk is toegenomen en blijkbaar is afgenomen na behandeling met ECH, wat duidelijk CVF verlaagt. Real-time PCR-analyse onthult dat transcripten van procollageen type Ⅰ omhoog worden gereguleerd in ISO-ratten en neerwaarts worden gereguleerd in ECH-ratten, deze resultaten zijn consistent met elkaar, zoals figuren 3B en FG laten zien, de gegevens geven aan dat ECH de collageenafzetting effectief vermindert . Het aantal TUNEL-positieve cellen in cardiomyocyten is significant verhoogd bij HF-ratten vergeleken met Ctrl, ECH vermindert de apoptose van myocardcellen aanzienlijk, en Figuur 3C-D toont het representatieve beeld van TUNEL-positieve cellen in respectievelijk lage en hoge vermogensvelden, en figuur 3H toont de apoptosesnelheid van myocardiale cellen. Deze resultaten geven aan dat ECH myocardiale hypertrofie, myocardiale interstitiële fibrose en apoptose effectief omkeert en de hartfunctie verbetert bij HF-ratten geïnduceerd door ISO.

FIGUUR 3 Resultaten van histologische kleuring tonen aan dat ECH linkerventrikelremodellering van HF-ratten geïnduceerd door ISO omkeert.

3.3|ECH beschermt de myocardiale ultrastructuur bij HF-ratten

Transmissie-elektronenmicrofoto's laten zien dat de schade aan de myocardiale ultrastructuur kan worden verzwakt door ECH, zoals figuur 4A-B laat zien. Myofibrillen zijn verticaal gerangschikt, de sarcomeerstructuur is duidelijk, de myofilamenten zijn netjes gerangschikt en de Z-lijn is duidelijk. Mitochondriën zijn netjes gerangschikt en de structuur is duidelijk bij Ctrl-ratten. Myofibrillen zijn echter ongeorganiseerd, gescheurd en opgelost, de sarcomeerstructuur is wazig, de afwezigheid van de Z-lijn, de myocardiale contractiezone is zichtbaar, het aantal en het volume van de mitochondriën zijn toegenomen, de mitochondriën hebben verschillende vormen en maten, gerangschikt in wanorde, de structuur is onduidelijk, zwelling en crista-fragmentatie, ineenstorting of klontering en opgelost in vacuole bij HF-ratten. ECH verzacht deze veranderingen duidelijk, de meerderheid van de hartspiervezels is netjes gerangschikt en de myocardiale filamenten zijn duidelijk, de Z-lijn bestaat, hoewel enige ontbinding van de filamenten duidelijk is, de sarcomeerstructuur is duidelijk, de dichtheid van de mitochondriale is verminderd, de vormen en afmetingen zijn verlicht, netter gerangschikt, mitochondriën zwelling en crista fragmentatie, ineenstorting of klontering, en vacuolisatie worden duidelijk verminderd door ECH vergeleken met HF. Mitochondriën zwelling en crista fragmentatie, collaps of klonteren, en gedeeltelijke vacuolisatie worden geïdentificeerd als mitochondriale degeneratie. De resultaten tonen aan dat ECH de myocardiale ultrastructuur effectief beschermt, en vooral de mitochondriale morfologie in HF-ratten beschermt, zoals figuur 4C-F laat zien.

FIGUUR 4 ECH beschermt de ultrastructuur van cardiomyocyten en mitochondriale morfologie van HF-ratten geïnduceerd door ISO.

3.4|ECH reguleert eiwitexpressie van SIRT1, FOXO3a en MnSOD

Western Blot-analyse toont aan dat het eiwitexpressieniveau van SIRT1, FOXO3a en MnSOD significant naar beneden wordt gereguleerd in HF-ratten, maar ECH reguleert duidelijk de verlaagde eiwitexpressie. De representatieve eiwitbanden van immunoblotting en statistische analyseresultaten worden weergegeven in figuur 5. Het deel van de gegevens geeft aan dat ECH de eiwitexpressie van SIRT1, FOXO3a en MnSOD verhoogt.

3.5|ECH remt mitochondriale oxidatieve stress in linkerventrikel myocardweefsel

In dit deel worden mitochondriale ROS, MMP, oxidatieve schade van mitochondriaal DNA, carbonylproteïnegehalte en lipideperoxidatieniveau in mitochondriën in linkerventrikel myocardweefsel van ratten allemaal gemeten, en de resultaten zijn consistent met celexperimenten, dat wil zeggen, ECH verlaagt mitochondriale ROS, beschermt MMP, verlicht de mate van schade aan mtDNA, vermindert het carbonyl-eiwitgehalte en lipideperoxidatie in mitochondriale, zoals figuur 6 laat zien.

FIGUUR 5 ECH reguleert het eiwitexpressieniveau van SIRT1, FOXO3a en MnSOD dat in HF-ratten naar beneden wordt gereguleerd.

4|DISCUSSIE

Deze studie toont aan dat ECH een effectieve rol speelt bij het voorkomen van myocardiale hermodellering en verbetering van de hartfunctie via het opreguleren van de SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signaleringsas en het remmen van mitochondriale oxidatieve stress.

Mitochondriën zijn de belangrijkste plaats voor het genereren van ROS als bijproduct van oxidatieve fosforylering, door hun nabijheid tot ROS, wordt aangenomen dat mitochondriale eiwitten, lipiden en mtDNA primaire doelen zijn van oxidatieve schade na overmatige emissie van mitochondriale ROS,34,35 deze schade stimuleert de verdere productie van ROS, de vicieuze cirkel gaat door, ROS en oxidatieve stress kunnen leiden tot myocardiale hypertrofie, apoptose, interstitiële fibrose en HF door activering van meerdere signaalroutes.35 Het lijkt er dus op dat geneesmiddelen die gericht zijn op remming van mitochondriale oxidatieve stress zijn effectief voor het voorkomen van myocardiale remodellering. ECH is een natuurlijk fenylethanoïde glycoside, een bestanddeel van het traditionele Chinese kruid Cistanche tubulosa. het is wijdverbreid bestudeerd en het is bewezen dat het de laatste jaren allerlei farmacologische activiteiten bezit, zoals anti-tumor, anti-apoptose, anti-veroudering, neuroprotectieve werking, enzovoort. Studies hebben aangetoond dat de farmacologische werking van ECH voornamelijk afhankelijk is van zijn eigenschap van antioxiderende en ontstekingsremmende activiteit,18,21 en ECH verlaagt de mitochondriale ROS en beschermt de mitochondriale functie tegen oxidatieve schade in zenuwcellen.20,22 Hier hebben we eerst aangetoond dat ECH verlaagt de mitochondriale ROS van cardiomyocyten, waardoor MMP wordt verbeterd, oxidatieve schade aan mtDNA, eiwitten en lipiden wordt verminderd, mitochondriale oxidatieve schade effectief wordt geremd en apoptose in vitro en in vivo wordt verminderd, dus keert het myocardiale hermodellering om en verbetert de hartfunctie. Het betekent dat ECH een potentieel nieuw medicijn is voor de preventie van myocardiale remodellering en HF.

Onder normale omstandigheden wordt mitochondriale ROS voornamelijk geklaard door MnSOD, dat zich in de mitochondriën verspreidt en beschermt tegen mitochondriale oxidatieve schade. Ang II vermindert de MnSOD-expressie van cardiomyocyten significant en induceert myocardiale hypertrofie, maar resveratrol zou de expressie van MnSOD kunnen verhogen en myocardiale hypertrofie geïnduceerd door Ang II kunnen remmen.36 In HF is de activiteit van MnSOD significant verminderd en is de aanmaak van mitochondriale ROS verhoogd .37,38 Bij hartspecifieke MnSOD-gen-knockout-muizen kon de mitochondriale ROS niet worden geklaard en is de ROS verhoogd in cardiomyocyten, wat leidde tot mitochondriale disfunctie en progressieve hartvergroting, wat uiteindelijk leidde tot hartfalen.39 In de huidige studie bevestigen we dat de expressie van MnSOD aanzienlijk is verminderd, wat wordt verzwakt door ECH-behandeling, en dus wordt mitochondriale ROS verminderd en wordt mitochondriale oxidatieve stress geremd. Het betekent dat ECH cardiomyocyten beschermt tegen oxidatieve schade door opregulatie van de expressie van MnSOD, we onderzoeken verder de moleculaire mechanismen die aan deze effecten ten grondslag liggen.

De expressie van MnSOD wordt gereguleerd door FOXO3a, een transcriptiefactor die bindt in het genpromotergebied van MnSOD en leidt tot de bevordering van gentranscriptie.40 SIRT1 is een stroomopwaartse moleculaire stof van FOXO3a en kan FOXO3a activeren door deacetylering. SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signaalas speelt een centrale rol bij de bescherming tegen oxidatieve stress in soorten celtypen, activering van de signaalas door estradiol remt oxidatieve stress en oefent de cardiale bescherming uit24; Activering van de signaalas door resveratrol remt door oxidatieve stress geïnduceerde celdood40; Anders remt angiotensine II de SIRT1/FoxO3a/MnSOD-route en induceert het mitochondriale oxidatieve stress, mtDNA-schade in osteoblasten,41 type 5 adenylylcyclase verhoogt de oxidatieve stress door remming van de expressie van MnSOD via de Sirt1/FoxO3a-route.42 Uit de huidige studie blijkt dat de expressie van SIRT1, FoxO3a en MnSOD zijn allemaal significant verminderd in HF-ratten en de mitochondriale ROS is verhoogd en oxidatieve stress is verbeterd, maar de veranderingen worden teruggedraaid door ECH. Nieuw onderzoek geeft aan dat ECH SIRT1 direct bindt als een ligand en een complex vormt met 9 covalente bindingen en de expressie van SIRT1 in zenuwcellen opwaarts reguleert.26 In overeenstemming met deze studie toont de huidige studie aan dat ECH ook de expressie van SIRT1 in cardiomyocyten, het reguleert vervolgens de genexpressie van MnSOD via FoxO3a en remt mitochondriale ROS en oxidatieve stress.

Langdurige chronische ischemie kan myocardiale winterslaap veroorzaken, deze overwinterende myocardcellen vertonen typisch een verlies van contractiele filamenten, er zijn overtollige glycogeenkorrels in het cytosol, sarcoplasmatisch reticulum en transversale tubuli gaan verloren,43 ook zijn er afwijkingen in mitochondriale grootte en vorm , reactieve myocardiale hypertrofie en interstitiële fibrose, die secundair zijn aan het verlies van myocyten.44 We hebben ook de bovenstaande veranderingen waargenomen bij HF-ratten in onze studie, terwijl ECH deze veranderingen significant verlicht, aangezien de laatste studie meldde dat herstel van de hartfunctie na ischemische stress een kenmerk van de myocardiale winterslaap,45 het myocardiale glycogeenniveau ook wordt gemeten, geven de resultaten aan dat er geen significant verschil is tussen de drie groepen, zoals weergegeven in figuur 7J.

De vorige studie detecteerde ook de myocardiale winterslaap in een niet-ischemisch hartfalen-varkensmodel door de LV-vrije wand met hoge frequentie te laten pacen,46 omdat microvasculaire obstructie een belangrijke rol speelt in de myocardiale winterslaap en de resulterende contractiele disfunctie, en dat wordt aanzienlijk verbeterd wanneer de microvasculaire obstructie wordt omgekeerd door een medicijn.47 Op dit moment concluderen sommige onderzoeken dat revascularisatietherapie effectief is bij het overwinteren van het myocard,43 door gebruik te maken van HE- en Masson-kleuring, zien we dat de capillaire en arteriolaire dichtheid van het hart duidelijk verminderd zijn bij HF-ratten en aanzienlijk wordt verlicht door ECH, zoals weergegeven in figuur 7A-H. Eerdere studies hebben aangetoond dat andere natuurlijke verbindingen, zoals bèta-glucaan van gerst, cardioprotectieve effecten uitoefenen door de expressie van MnSOD te verhogen,48,49, en de stijging van MnSOD is gerelateerd aan de verhoogde myocardiale capillaire dichtheid en VEGF-expressie. We hebben RT-PCR uitgevoerd om de expressie van VEGF te detecteren, de gegevens komen overeen met de bevinding van histologische kleuring, wat betekent dat ECH angiogenese kan bevorderen en de capillaire dichtheid van het myocard kan verhogen via het reguleren van VEGF-expressie, zoals weergegeven in figuur 7I. De huidige studie constateert dat ECH de capillaire en arteriolaire hartspier kan beschermen en verhogen via de opwaartse regulering van de SIRTI/FOXO3a/MnSOD-route en de expressie van VEGF, waardoor het myocard in winterslaap wordt onderdrukt en bijdraagt ​​aan het verbeteren van de hartfunctie.

Cistanche draagt ​​bijtothartfunctie verbeteren.

Voor meer informatie, klik hier.

Merk op dat apoptose van cardiomyocyten algemeen bekend is als een belangrijke pathologische verandering bij hartfalen, en de huidige studie bevestigt inderdaad dat een grote hoeveelheid apoptotische cellen in HF-ratten en ECH de apoptose significant vermindert via het reguleren van de SIRTI/FOXO3a/MnSOD-route en het remmen van mitochondriale oxidatieve stress, zoals hierboven vermeld.

Bovenal keert ECH de hermodellering van het myocard om en verbetert het de hartfunctie door de SIRT1/FoxO3a/MnSOD-signaleringsas te verhogen, waardoor mitochondriale oxidatieve stress wordt geremd en het myocard in winterslaap wordt verminderd. Er wordt dus gesuggereerd dat ECH een potentieel medicijn is voor de preventie of behandeling van myocardiale remodellering en HF.