Effect van Cistanche Tubulosa-extracten op de mannelijke voortplantingsfunctie bij door streptozotocine-nicotinamide geïnduceerde diabetische ratten-Ⅰ

1. Inleiding

Diabetes mellitus (DM) is een aandoening waarbij er sprake is van een verhoogd risicoglucose niveausin het bloed als gevolg van de inefficiëntie van de alvleesklier bij het produceren van voldoende insuline, of het onvermogen van het lichaam om deze effectief te gebruiken. Volgens de WHO is het aantal mensen met diabetes gestegen van 108 miljoen in 1980 naar 422 miljoen in 2014 [1]. Er zijn vier hoofdcategorieën: pre-diabetes (een stadium vóór diabetes), type 1 (waarbij de alvleesklier geen insuline produceert), type 2 (het lichaam gebruikt geen insuline) en zwangerschapsdiabetes (die optreedt tijdens de zwangerschap). Oxidatieve stress treedt op als gevolg van de onbalans tussen de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en antioxidanten [2], wat uiteindelijk leidt tot diabetes. De complicaties van diabetes zijn onder meer nierfalen, zenuwbeschadiging, blindheid, beroerte, hartaanval, foetale dood en onvruchtbaarheid. [1]. Studies tonen aan dat spermakernen, deoxyribonucleïnezuur (DNA) en mitochondriën aanzienlijk beschadigd waren bij mannelijke diabetespatiënten [3]. Oxidatieve stress tijdens het transport van sperma zal het proces van het mannelijke voortplantingssysteem veranderen [4,5].

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Het proces van spermatogenese wordt gecontroleerd door de hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG)-as. Het gonadotropine-releasing hormoon (GnRH), geproduceerd door de hypothalamus, stimuleert de productie van luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH). Leydig-cellen bevinden zich naast de tubulus seminiferi entestosteron producerenonder controle van LH. FSH activeert de productie van antigeenbindend eiwit (ABP) dat helpt het mannelijke hormoon door te geven. Onvruchtbaarheid en andere problemen ontstaan ​​dus voornamelijk als gevolg van de verstoringen die optreden in de HPG-as. Toediening van de combinatie van streptozotocine-nicotinamide induceert diabetes bij experimentele ratten. Streptozotocine is een chemische verbinding die giftig is voor insulineproducerende cellen in de pancreas en nicotinamide is een in water oplosbare vitamine die de cellen beschermt tegen volledige schade [6].

Cistanche tubulosa is een woestijnplantensoort die ook bekend staat als "Rou Cong-Rong" [7]. Het is een niet-chlorofylische parasitaire plant die voornamelijk groeit op de wortel van de Calotropis procera-boom en wijd verspreid is in het dorre land van Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolië, Iran en India. De algemene naam van Cistanche tubulosa is "Woestijnhyacint". Het wordt algemeen aanvaard in de traditionele Chinese geneeskunde en heeft de naam "Ginseng van de Woestijn" gekregen. Het wordt veel gebruikt op medisch gebied voor de behandeling van morbide leukorroe, overvloedige metrorragie, chronische nierziekten, constipatie, impotentie en onvruchtbaarheid. Chemische bestanddelen vanCistanche tubulosa bestaat uit niet-vluchtige fenylethanoïdeglycosiden(PHG's), iridoïden, lignanen, vluchtige oliën, alditolen, oligosachariden en polysachariden [8]. Studies tonen dat aanechinacosidevan dit kruid beschermt de beschadigde fibroblast door de ROS-niveaus te reguleren [9]. Deze verbinding produceert antioxiderende, vasorelaxerende en ontstekingsremmende activiteiten, samen met neuroprotectie en preventie van osteoporose [10,11].

Dit onderzoek had tot doel het effect vanCistanche tubulosa-extractmet ECH op de reproductieve disfunctie van de door streptozotocine-nicotinamide geïnduceerde diabetische rat.

2. materialen en methoden

2.1. Materialen

ECH en CTE werden gekocht bij Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's) werden gekocht bij Biovision (San Francisco, CA, VS). LC-540- en TM3-cellijnen werden gekocht bij het Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Vijf weken oude Sprague-Dawley (SD) mannelijke ratten werden gekocht bij het National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® werd gekocht bij PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) werd verkregen bij Sigma (St. Louis, MO, VS). Methanol en 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) werden ook gekocht bij Sigma. Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium/F12 en trypsine-EDTA werden verkregen van GIBCO (New York, NY, VS). 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT), dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA), dimethylsulfoxide (DMSO) en nitroblauwtetrazolium (NBT) werden gekocht bij Sigma. Glucose-enzymatische kits werden verkregen van Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japan. Insuline-ELISA-kits werden gekocht bij Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Zweden). T-PER Weefseleiwitextractiereagens werd verkregen van Thermo Scientific (Chicago, IL, VS). Anti-mens / muis / rat nucleaire factor-kappa B NF-KB polyklonale antilichamen werden gekocht bij Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, VS. Anti-muis/rattenreceptor voor geavanceerde glycatie-eindproducten (RAGE) polyklonale antilichamen, anti-mens/muis/rat StAR polyklonale antilichamen en anti-mens/muis/rat cytochroom P450 17A1 monoklonale antilichamen werden gekocht bij Gene Tex (Irvine, CA, VS). Polyklonale antilichamen tegen mens/muis/rat CYP11A1 werden verkregen van Cell Signaling Technology (Beverly, PA, VS). Easy-Blue-reagens werd gekocht bij Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, VS). Agarose en DNA-marker 100 bp werden verkregen van Promega, Corporation (Madison, WI, VS). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit werd gekocht bij QIAGEN, Hilden, Duitsland.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Methoden

2.2.1. In vitro-analyse

LC{0}} en TM3 celcultuur: De LC-540 cellijnen werden gekweekt bij 37 ◦C in Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) medium aangevuld met natriumbicarbonaat (1,5 g/l), L-glutamine (2 mM), niet-essentiële aminozuren (0.1 mM), natriumpyruvaat (1.0 mM) en foetaal runderserum (FBS) (10%) in een 5% CO2-incubator (CO2-incubator, Napco 5410, Taiwan). De TM3-cellijn werd gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM), aangevuld met glucose (4,5 g/l), natriumpyruvaat (0,5 mM), L-glutamine (2,5 mM), natriumbicarbonaat (1,2 g/l), {{ 28}}(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES, 15 mM) en foetaal kalfsserum (FCS, 10%) of paardenserum (5%) bij 37 ◦C in een 5% CO2-incubator.

Bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen vanEchinacoside (ECH): 3-(4, 5-dimethylthiazool-2-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT)-reagens werd gebruikt voor de bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen. De celconcentratie werd aangepast tot 2 x 105 cellen/ml in een 96-putjesplaat. Vervolgens werd 20 µl ECH (verdund in 2% medium) toegevoegd en 24 uur bij 37 °C geïncubeerd in een incubator met 5% CO2. Later werd 100 µl MTT-reagens toegevoegd en gedurende 4 uur bij 37 °C onder donkere omstandigheden geïncubeerd. De absorptie werd gemeten bij 570 nm (ELISA-lezer, Dynatech MR5000, Kloten, Zwitserland).

Relatieve levensvatbaarheid van de cellen (%)=[(Amonster bij 570 nm − Ablank bij 570 nm)]/[(Acontrole bij 570 − Ablank bij 570)] × 100.

Nitroblauwtetrazolium (NBT)-reductietest en 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-test: het aantal cellen werd aangepast naar 1× 1{{10}}6 cellen/ ml. Vervolgens werden 50 mg/ml ECH, resveratrol (RES) en geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's) (controle) toegevoegd en gedurende 18 uur samen gekweekt bij 37 ◦C. Vervolgens werd 0,3 ml NBT-oplossing (0,1 mg/ml NBT, 5% FBS en 3% dimethylsulfoxide (DMSO) opgelost in 10 ml DMEM) toegevoegd en 1 uur bij 37 °C in 5% CO2 geïncubeerd. Na centrifugatie (bij 800 x g gedurende 3 minuten) werd het supernatant verwijderd en werd 200 µl DMSO toegevoegd en gedurende 5 minuten geschud in een ultrasone oscillator (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). De absorptie werd gemeten bij 630 nm. Voor de DPPH-radicaaltest werd Trolox (in 95% alcohol) als standaard genomen. Vervolgens werd 75 µl van een 0,5 mM DPPH-oplossing gemengd met 25 µl monsters en 30 minuten op een donkere plaats bij kamertemperatuur laten reageren. Het mengsel werd geschud en de absorptie werd gemeten bij 517 nm.

Inhoudsanalyse van reactieve zuurstofsoorten (ROS): Het aantal cellen werd aangepast tot 2 x 105 cellen/ml in een 12-putjesplaat met 2% FBS. Vervolgens werd 50 µl/ml ECH, RES en AGE's aan de plaat toegevoegd en 24 uur bij 37 °C geïncubeerd. Na 24 uur werd 20 uur 70 -dichloorfluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) toegevoegd en 30 minuten bij 37 ◦C geïncubeerd. Na centrifugeren (400 x g, 5 minuten) werd het supernatant verwijderd en werden de cellen tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Daarna werden de cellen gesuspendeerd in 1 ml PBS en werden de ROS-niveaus bepaald met behulp van een flowcytometer (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, VS).

Identificatie en kwantitatieve analyse van eiwitten: Eiwitten werden geëxtraheerd met behulp van een eiwitextractiereagens (T-PER). De celdichtheid werd aangepast tot 2 x 105 cellen/ml in een 12-putjesplaat en 50 µl/ml ECH, RES en een receptor voor de antagonist van het geavanceerde glycatie-eindproduct (RAGE), en AGE's werden toegevoegd en geïncubeerd. bij 37 ◦C in een incubator met 5% CO2 gedurende 24 uur. Daarna werd 400 µl T-PER toegevoegd, van de cellen geschraapt en 20 minuten bij 125,000× g (4 ◦C) gecentrifugeerd. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij -80 ◦C (-80 ◦C vriezer, Nuaire, Plymouth, MN, VS) voor verdere analyse. Voor de kwantificering van eiwitten werd een bicinchoninezuur (BCA)-kit gebruikt. Vervolgens werden 10 µl standaard celoplossing en 200 µl BCA-reagens toegevoegd aan 8-putjesplaten en gedurende 30 minuten bij 37 ◦C geïncubeerd in een incubator met 5% CO2. De absorptie werd gemeten bij 562 nm. Eiwitidentificatieanalyse werd uitgevoerd door elektroforese op natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamidegel (SDS-PAGE). Er werden monsters bereid door eiwitlysaat toe te voegen aan een eiwitlaadbuffer en Western-blot-analyse werd uitgevoerd om de specifieke eiwitten te detecteren.

2.2.2. In vivo analyse

Ontwerp van diermodellen: Zestig mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten van {{0}} weken oud werden gekocht bij het National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Elke rat werd individueel gehuisvest in desinfecterende roestvrijstalen kooien onder gecontroleerde temperatuur (23 ± 1 ◦C) en vochtigheid (40-60%) met een licht/12 uur donkercyclus van 12 uur. Voedsel en water werden ad libitum verstrekt. Elke rat werd in de eerste week gedomesticeerd en kreeg laboratoriumknaagdierdieet 5001 als hoofddieet. Alle procedures volgden de standaard van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Approval No. 101026) van de National Taiwan Ocean University, Taiwan. Na de domesticatie werden ratten in twee groepen verdeeld: de controlegroep (Con) die laboratoriumdieet 5001 kreeg, en de diabetesgroep die gedurende het hele experiment een vetrijk dieet (HFD, 40%) kreeg. Nadat ze gedurende 4 weken met de HFD waren gevoerd, werden de ratten uit de diabetische groep geïnjecteerd met streptozotocine (65 mg/kg) (STZ) om diabetes mellitus (DM) te induceren. Binnen 15 minuten na het injecteren van STZ werd nicotinamide (230 mg/kg lichaamsgewicht) geïnjecteerd. Een week na de injectie werd een orale glucosetolerantietest (OGTT) uitgevoerd om de succesvolle inductie van diabetes mellitus (DM) te bepalen. Daarna werden de dieren in zes groepen verdeeld: de controle (gevoed met laboratoriumdieet 5001); DM-groep (DM + 45% HFD); DMR-groep (DM + rosiglitazon: 0,571 mg/kg lichaamsgewicht) + 45% HFD; DME1-groep (DM + CTE: 80 mg/kg lichaamsgewicht) + 45% HFD; DME2-groep (DM + CTE: 160 mg/kg lichaamsgewicht) + 45% HFD; en DME4-groep (DM + CTE: 320 mg/kg lichaamsgewicht) + 45% HFD. Rosiglitazon (RSG) werd als positieve controle genomen. Er werden drie doses CTE (80, 160 en 320 mg/kg) gebruikt volgens de aanbeveling van de Taiwan Food and Drug Administration (TFDA) functionele evaluatierichtlijnen voor gezondheidsvoeding. Behandelingen werden gegeven tot het einde van het experiment. Alle experimentele ratten werden na 6 weken opgeofferd. Het bloed dat van de ratten werd verzameld, werd 15 minuten bij 4 °C bij 3000 rpm gecentrifugeerd. Het supernatant werd onderzocht voor de volgende analyse:

Bepaling van totale glucose, triglyceriden en cholesterol: De glucosebepaling werd uitgevoerd met behulp van glucose-enzymatische kits. Vervolgens werd 20 µl bloedplasmamonsters aan de reagentia toegevoegd en gedurende 5 minuten op 37 °C gehouden. De totale triglyceriden- en totale cholesterolconcentratie werden bepaald met behulp van enzymatische kits voor triglyceriden en cholesterol. Vervolgens werd 10 µl bloedplasma aan de reagentia toegevoegd en werd het experiment uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De absorptie werd gemeten bij 510 nm.

Totaal glucose/triglyceride/cholesterol in plasma (mg/dl)=(Amonster − ABlank)/(Astandaard − ABlank) × 200.

Asample: Absorptiewaarde van bloedmonsters, ABlank: Absorptiewaarde van kits zonder monster, Astandaard: Absorptiewaarde van het standaardreagens, 200: standaardreagentia bij een concentratie van 200 mg/dL.

Insuline-, leptine- en homeostatische modelbeoordeling – bepaling van insulineresistentie (HOMA-IR):Het insulineniveau werd bepaald door insuline-ELISA-kits. Hier, 25µEr werd 1 liter bloedplasma aan de vloeistof toegevoegdreagentia, en de absorptie werd gemeten bij 450 nm. Het totale leptinegehalte werd bepaald met behulp van aleptine-enzym immunometrische testkit.Dan, 100µL plasma werd geanalyseerd en de absorptiewerd gemeten bij 450 nm met behulp van een ELISA-lezer. Het hele experiment werd uitgevoerd volgensde instructies van de fabrikant. De HOMA-IR-waarde werd bepaald op basis van het homeostasemodelbeoordelingsvergelijking=Nuchtere plasma-insulineconcentratie (mg/ml)× nuchtere plasmaglucoseconcentraties (mmol/L)/22,5.

Plasmalipidenperoxidatie: Hier werd {{0}},5 ml bloedplasma gemengd met 1 ml reagens (15%, w/v trichloorazijnzuur in 0,25 N zoutzuur (HCl ) en 0,375%, w/v thiobarbituurzuur in 0,25 N HCl) en gedurende 15 minuten in een waterbad (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Zwitserland) bij 100 ◦C geplaatst. Na afkoelen werd 1 ml n-butanol toegevoegd, krachtig geschud en 10 minuten bij 1500 x g gecentrifugeerd. Het supernatant werd verzameld en de absorptie werd gemeten bij 532 nm [12].

Concentratie malondialdehyde (MDA) (nM/ml)=[(Een monster bij 532 nm − Ablank bij 532 nm)/ (Een standaard bij 532 nm − Ablank bij 532 nm)] × 5.

standaard bij 532 nm − Ablank bij 532 nm)] × 5. Bepaling van plasmatestosteron- en luteïniserend hormoon (LH)-niveaus: De testosteron-ELISA-kit werd gebruikt om het testosteronniveau in het bloedplasma te meten. Om de LH-concentratie te bepalen werd een RIA-kit gebruikt. Vervolgens werd 50 µl plasma toegevoegd en werden de berekeningen gebaseerd op de concentratie van het hormoon LH-RP-3 (standaard). De verdere stappen werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.

Bepaling van de tumornecrosefactor (TNF)- en interleukine-6 (IL-6)-concentratie: het gevangen antilichaam werd 250 keer verdund in coatingbuffer, toegevoegd aan een 96- wellplaat (100 µl/well), en gedurende de nacht op 4 ◦C gehouden. Het supernatant werd afgezogen en vijf keer gewassen met wasbuffer (1 keer PBS, 0,05% Tween 20). Na incubatie (1 uur) met 200 µg testverdunningsmiddel werden de cellen 5 keer gewassen met wasbuffer en werd 100 µl TNF-standaardoplossing of testmonsters aan elk putje toegevoegd en gedurende 2 uur geïncubeerd. Na het wassen werd 100 µl IL-6-gedetecteerde antilichamen toegevoegd en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het supernatant werd afgezogen en vijfmaal gewassen. Vervolgens werd 480 µl enzym avidine-mierikswortelperoxidase (HRP) toegevoegd en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het supernatant werd afgezogen en vijf keer gewassen met een wasbuffer. Vervolgens werd 100 µl substraatoplossing toegevoegd en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Later werd aan elk putje 50 µl stopoplossing (1M fosforzuur) toegevoegd en de absorptie werd gemeten bij 450 nm.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET HERSTELLEN VAN SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analyse van sperma- en testisparameters

Spermamonsterafname: De spermamonsterafname werd uitgevoerd volgens de methode die eerder werd gerapporteerd in [13]. Het sperma werd uit het supernatant verzameld en voor verdere analyse gebruikt.

Het aantal spermacellen, de beweeglijkheid van het sperma en het abnormale sperma: Het aantal spermacellen werd berekend met behulp van de hemocytometer en de trypaanblauwoplossing. Vervolgens werd 100 µl spermavloeistof gemengd met trypaanblauwoplossing en werden het aantal spermacellen, de beweeglijkheid en het abnormale sperma berekend met behulp van een hemocytometer en een microscoop [14].

Nitroblauw Tetrazolium NBT-reductie en lipidenperoxidatie van sperma en testis: De lipidenperoxidatie en NBT-reductie werden geanalyseerd volgens dezelfde procedure als plasmaanalyse.

Bepaling van superoxide-dismutase (SOD) en katalase-activiteit: Superoxide-dismutase (SOD)-activiteit werd geanalyseerd met behulp van de RANSEL-kit. Hier werd {0}}.05 ml testiculaire homogenaten toegevoegd aan 1,7 ml reactieoplossing (0,05 mM xanthine, 0,025 mM 2-({ {9}}joodfenyl)- 3-(4-nitrofenol)-5-fenyltetrazoliumchloride (INT)). Na het mengen werd 0,25 ml xanthine-oxidase (80 U/l) toegevoegd en gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur gereageerd. De absorptie werd gemeten bij 505 nm. De eiwitconcentratie van het testiculaire homogenaat werd bepaald met behulp van de Bio-Rad DC-eiwittestkit en de specifieke activiteit ervan (E/mg eiwit) werd berekend. De catalase (CAT)-activiteit werd bepaald volgens een eerder gerapporteerde methode [15].

H&E (hematoxyline en eosine) kleuring

De testis werd 24 uur in 10% formaline gedrenkt en bij 4 ◦C bewaard. De weefsels hadden een microformaat en waren aan het objectglaasje bevestigd. Na fixatie (95% methanol + 5% azijnzuur) werden de objectglaasjes 3 minuten ondergedompeld in hematoxyline, 5 minuten gewassen met stromend water en vervolgens gedrenkt in 50%, 70% en 90% alcohol voor een minuut. Daarna werden de objectglaasjes gedurende 10 seconden met eosine gekleurd en gedurende één minuut in 100% alcohol gedrenkt totdat deze vervaagde. Tenslotte werd het objectglaasje gedurende één minuut in xyleen geweekt. Later werd het objectglaasje aan de lucht gedroogd en verzegeld. De gekleurde buis werd in een omgekeerde fasecontrastmicroscoop geplaatst (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Japan) om de morfologie te observeren.

Analyse van de hypothalamus

De muis KISS1, G-proteïne gekoppelde receptor (GPR) 54, suppressor van cytokine signalering 3 (SOCS-3) en sirtuin 1 (SIRT1) gensequenties werden geïdentificeerd uit de NCBI (National Center for Biotechnology Information) genendatabase en er werd een specifieke primer ontworpen met behulp van Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, VS.). De primers die in het experiment zijn gebruikt, staan ​​vermeld in Tabel 1.

Extractie van ribonucleïnezuur (RNA) uit de hypothalamus. De extractie van RNA uit de hypothalamus van de hersenen werd uitgevoerd met behulp van de RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. De verkregen mRNA's werden kwantitatief gemeten door middel van reverse transcriptie (RT) en polymerasekettingreactie (PCR). Het compliment-DNA verkregen uit RT-analyse werd bewaard bij −20 ◦C voor later gebruik. Het geëxtraheerde DNA werd onderworpen aan analyse van de polymerasekettingreactie (PCR) met behulp van Taq-polymerase. Vervolgens werd 5-10 µl van het PCR-product genomen en geanalyseerd door middel van elektroforese op een 1,5% agarcolloïde. De afbeelding is gemaakt met een UVP BioDoc-It-beeldvormingssysteem. Omgekeerd getranscribeerd complementair deoxyribonucleïnezuur (cDNA) werd genomen en PCR werd uitgevoerd met behulp van de IQ SYBR Green Supermix Kit. Later werd het geanalyseerd met iQTM 5 Optical System Software. Eiwitten werden geëxtraheerd met behulp van een eiwitextractiereagens (T-PER). Vervolgens werd 20 mg testiculair homogenaat toegevoegd aan 400 µl T-PER en gecentrifugeerd (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Duitsland) bij 4 ◦C (125,000× g ) gedurende 20 minuten. De volgende methode was vergelijkbaar met "identificatie- en kwantificeringsanalyse van eiwitten" bij in vitro analyse.

2.3. Statistische analyse

De experimentele resultaten werden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardafwijking (gemiddelde ± SD) en de gegevens werden geanalyseerd met behulp van Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 software, IBM, Armonk, New York, NY, VS. De verschillen tussen de groepen werden geanalyseerd door middel van eenwegsvariantieanalyse (ANOVA). Meerdere vergelijkingen van verschillende groepen werden geanalyseerd door de test van Duncan met de waarde p < 0.05 als significant niveau.

3. Resultaten

3.1. In vitro-analyse

3.1.1. Vergelijking van antioxiderende activiteiten van ECH, CTE en RES

Lange termijn hHoge oxidatieve stress en chronische ontstekingen zijn de belangrijkste oorzaken van diabetescomplicaties [16]. CTE's bevatten verschillendefenylethanoïdeglycosiden zoals echinacoside(ECH) en acteoside, met het potentieel voor antioxiderende activiteit [17]. DPPH radicalen opruimenEr werd een test uitgevoerd om de antioxiderende activiteit van ECH te evalueren. Trolox en resveratrol(3,5,4'-trihydroxystilbeen, RES) werden respectievelijk als standaard en positieve controle genomen. Zoals getoondin figuur1toonde ECH een betere radicaalvangende activiteit en de activiteit was aanzienlijk hogerdan die van de positieve controle (RES).

3.1.2. Levensvatbaarheid van cellen van ECH op LC-540- en TM3 Leydig-cellen

Er werd een MTT-test uitgevoerd om de cellevensvatbaarheid van verschillende concentraties ECH te evalueren. LC-540 Leydig-cellen en TM3 Leydig-cellen vertoonden een levensvatbaarheid van meer dan 80% na behandeling met ECH (Figuur 2). Vergeleken met de andere concentraties vertoonde een concentratie van 100-μM (verdunningen van 100 µM in 2% FBS) van ECH een betere cellevensvatbaarheid in TM3 Leydig-cellen. Het resultaat gaf aan dat de verhoogde concentratie ECH geen significante toxiciteit voor de cellen veroorzaakt.

3.1.3. Effect van ECH op door AGE geïnduceerde superoxideproductie door NBT-test in LC-540- en TM3 Leydig-cellen

AGE's veroorzaken oxidatieve schade in het lichaam als gevolg van de oxidatie van glucose en de vorming van vrije radicalen zoals O2-, hydroxylradicalen en carbonylgroepen [18]. Na te zijn gestimuleerd met 50 ug / ml AGE's, werden de LC-540 (Figuur 3a) en TM3 (Figuur 3b) cellen behandeld met ECH en RES (elk 5 μM en 10 μM). De resultaten toonden aan dat de productie van superoxide-anion was toegenomen in de controlegroep (gestimuleerde AGE’s), maar de productie van superoxide-anion was afgenomen na de controlegroep (gestimuleerde AGE’s), maar de productie van superoxide-anion daalde na de productie van superoxide en beschermde de cellen tegen oxidatieve schade. In het geval van LC-540-cellen vertoonde 10 µM ECH vrijwel vergelijkbare activiteit als de normale groep. De superoxideproductie in beide cellen nam af bij een toename van de concentratie van zowel ECH als RES.

NATUURLIJKE CISTANCHE TUBULOSA VOOR HET VERBETEREN VAN DE SEKSUELE FUNCTIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Effect van ECH op de H2O2-productie in AGE-gestimuleerde LC-540 Leydig-cellen

DCFH-DA-test werd uitgevoerd om de aanwezigheid van oxidatieve soorten te detecteren. Na het binnendringen in de cellen wordt de fluorescerende kleurstof DCFH-DA geoxideerd door intracellulair H2O2 en vormt dichloorfluoresceïne (DCF). Zoals weergegeven in Figuur 4 was er een significante toename in de intracellulaire H2O2-productie in de AGE-gestimuleerde groep (controle), terwijl de toevoeging van 10 µM ECH en RES de H2O2-productie in de cellen aanzienlijk verminderde. Toediening van 10 µM ECH resulteerde in slechts ongeveer 47,1% van de H2O2-productie, aanzienlijk lager dan in de controlegroep.

3.1.5. Effect van ECH op RAGE- en NF-KB-eiwitexpressieniveaus in AGE-gestimuleerde LC-540 Leydig-cellen

Western blot-analyse werd uitgevoerd om de aanwezigheid van RAGE in LC-540 Leydig-cellen te bevestigen. Het effect van ECH op de eiwitexpressieniveaus van RAGE (Figuur 5a) en NF-KB (Figuur 5b) in door AGEs gestimuleerde Leydig-cellen werd getoond in Figuur 5. De resultaten toonden aan dat een concentratie van AGEs van 50 µg/ml hogere RAGE- en NF-cellen induceerde. KB-expressie in LC-540 Leydig-cellen en een concentratie van 10 µM ECH en RES verminderden de expressie van RAGE en NF-KB aanzienlijk. De expressie van NF-KB was significant lager in RES en ECH dan in RAGE-antagonisten. De resultaten bevestigden dus dat de ECH het ontstekingsniveau verlaagde door het niveau van RAGE en NF-KB te verlagen.

3.1.6. Effect van ECH op de testosteronsyntheseroute in AGE-gestimuleerde LC-540 Leydig-cellen.

Het proces van spermatogenese en mannelijke onvruchtbaarheid hangt af van de aanwezigheid van testosteron. Zoals weergegeven in Figuur 6 waren de expressies van StAR (Figuur 6a), CYP11A1 (Figuur 6b), CYP17A1 (Figuur 6c) en HSD17 3 (Figuur 6d) eiwitten significant verlaagd in AGE-gestimuleerde LC{{11 }} Leydig-cellen (controlegroep). De expressies van StAR-, CYP11A1-, CYP17A1- en HSD17 3-eiwitten waren significant verhoogd toen de RAGE-antagonist, RES en ECH werden toegevoegd. De verhoogde expressie van StAR- en CYP11A1-eiwitten werd waargenomen in zowel de met ECH als met RES behandelde groepen. Het expressieniveau van CYP17A1 was vrijwel vergelijkbaar in de RES- en ECH-groepen. De expressies van het HSD17 3-eiwit in met ECH behandelde Leydig-cellen waren veel hoger dan die van de met RES en RAGE-antagonist behandelde cellen. Verhoogde expressie van StAR-, CYP11A1-, CYP17A1- en HSD17 3-eiwitten duidde op de normale productie van testosteron.