Effect van cistanche fenylethanolglycoside darmbarrière en darmmicrobiota bij muizenalcoholische leverziekte

Abstract:

Objectief:Het muismodel vanalcoholische leverziekte(ALD) werd opgericht door Lieber-Decarli alcohol vloeibaar voer, en de effecten ervanCistanche fenylethanoïde glycosiden(CPhGs) over de darmbarrière en de samenstelling van de darmmicrobiota van ALD-muizen waren besproken.

Methode: De 36 vrouwelijke C57BL/6N-muizen werden willekeurig verdeeld in de normale groep, de normale CPhG-groep, de modelgroep en de CPhG-groepen met lage, gemiddelde en hoge dosis (175 mg·kg-1, 350 mg·kg{{6 }}en 700 mg·kg-1), met 6 muizen. Oprichting van een ALD-muismodel met behulp van vloeibaar Lieber-Decarli-alcoholvoer. De CPhGs-dosisgroep en de CPhGs-normale groep kregen dagelijks CPhGs via een maagsonde in de juiste doses. Een automatische biochemische analysator detecteerde serum-ALT-, AST-, TG- en TC-niveaus. Serum TNF-, IL-1, LPS, LBP, D-LA, DAO en LBP van de lever werden gedetecteerd met ELISA. De niveaus van TG en TC in leverhomogenaatmonsters werden gedetecteerd met colorimetrie. Leverweefsel werd gekleurd met olierode O- en HE-kleuring. De darmweefsels werden gekleurd met HE- en AB-PAS-kleuring en Muc2-immunohistochemie. De darminhoud van de normale groep, de normale CPhG-groep, de modelgroep en de CPhG-groep met hoge dosis werd verzameld en de darmmicrobiota werd gesequenced.

Resultaat: Het ALD-model werd met succes opgesteld. Vergeleken met de normale groep waren de niveaus van serum-ALT, AST en TG, en de niveaus van lever-TG en TC in de modelgroep aanzienlijk verhoogd (P<0.05). Histopathology showed that compared with the normal group, the liver cells in the model group showed obvious steatosis. Compared with the model group, the levels of serum TG liver TG, and TC in the CPhGs dose group decreased significantly (P<0.05). The serum ALT, AST, TNF-α, IL-1β, LPS, and LBP in the CPhGs high dose group were also significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the number of fatty liver cells in the CPhGs high dose group was significantly reduced, the microvilli structure of jejunum epithelial cells was intact, and the expression of Muc2 was reduced in the colon.Compared with the model group, the flora of the CPhGs high dose group changed significantly (P<0.05). Compared with the normal group, the Allobaculum was significantly up-regulated in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the abundance of Akkermansia in the CPhGs high dose group was significantly increased (P<0.01). Akkermansia was negatively correlated with Allobaculum (r = -0.701, P<0.01). 

Conclusie: CPhG's kunnen de schade aan de darmbarrière veroorzaakt door ALD verminderen, wat kanspelen een beschermende rol door de overvloed en structuur van Akkermansia en Allobaculum te regulerenen het beïnvloeden van de homeostase van de slijmlaag van de darmslijmvliesbarrière.

Trefwoorden:CPhG's; alcoholische leverziekte; darmbarrière; darmmicrobiota

NATUURLIJK BIOLOGISCH CISTANCHE-EXTRACT MET 40% ECHINACOSIDE EN 16% ACTEOSIDE VOOR

Ondersteunende service van Wecistanche, de grootste cistanche-exporteur in China:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Winkel voor meer specificaties:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Alcohol is een van de belangrijke risicofactoren gewordenchronische ziekten wereldwijd.Uit het ‘Global Report on Alcohol and Health 2018’, uitgegeven door de Wereldgezondheidsorganisatie, blijkt dat in 2016 wereldwijd ongeveer 3 miljoen mensen stierven als gevolg van overmatig alcoholgebruik, goed voor 5,3% van het totaal [1]. In ons land nemen de door alcohol veroorzaakte leverziekten jaar na jaar toe en zijn de op een na grootste oorzaak van levercirrose [2], wat een ernstig probleem voor de volksgezondheid is geworden. De mechanismen van het ontstaan ​​en de progressie van alcoholische leverziekte (ALD) zijn complex en talrijk, voornamelijk het leverbeschadigingsmechanisme van de ethanolmetaboliet acetaldehyde en reactieve zuurstofverbindingen [3]. Onder hen heeft de rol van de ‘darm-lever-as’ bij de progressie van ALD aanzienlijke aandacht getrokken [4-5]. De lever is de belangrijkste plaats voor het oxidatieve metabolisme van alcohol. Langdurig zwaar drinken kan de lever direct beschadigen, wat kan leiden tot het optreden van ALD [6]. Leversteatose is een vroege reactie na het drinken van alcohol. De menselijke darmmicrobiota (GM) wordt geschat op 10 biljoen [7]. Een micro-ecologisch evenwicht bestaande uit darmflora, virussen, schimmels en metabolieten.

Evenwicht, dat wil zeggen de darmmicro-ecologie, is nauw verbonden met de progressie van ALD via de ‘darm-lever-as’, maar de relevante mechanismen zijn nog steeds onduidelijk [8-9]. De darmbarrière en flora domineren de ‘darm-lever-as’, en ontregeling van GM en overexpressie van ontstekingsfactoren spelen een belangrijke rol bij het optreden en de ontwikkeling van ALD [10-11].

Studies hebben aangetoond dat ernstige ontregeling van GM en overexpressie van ontstekingsfactoren optreden tijdens het optreden en de ontwikkeling van ALD [12]. Langdurige chronische inname of kortetermijninname van grote hoeveelheden alcohol zal de darmpermeabiliteit veranderen, waardoor darm-LPS in de portale circulatie terechtkomt, wat een ontstekingsreactie teweegbrengt en de leverschade verergert [12-13].

Cistanche, als een typisch Chinees medicinaal materiaal in Xinjiang, is opgenomen in Wu Pu's Materia Medica van de Wei- en Jin-dynastieën, "Compendium van Materia Medica" van de Song-dynastie, en "Compendium van Materia Medica" van de Ming-dynastie [14 ]. Uit modern farmacologisch onderzoek is gebleken dat Cistanche-fenylethanoïdeglycosiden (CPhG's) een belangrijke rol spelen bij ontstekingsremmende middelen en anti-hepatische fibrose [15-16]. Er is momenteel echter een gebrek aan onderzoek naar de vraag of CPhG's de darmbarrièrefunctie of de darmflora bij ALD kunnen reguleren en een hepatoprotectief effect kunnen uitoefenen.

In deze studie werd gebruik gemaakt van vloeibaar alcoholvoer van Lieber-Decarli om het kortetermijnmuismodel voor alcoholische leverbeschadiging van het National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA) [17] op te richten om het effect van CPhG's op de darmmicro-ecologie van ALD te onderzoeken. Invloed. Speciale aandacht werd besteed aan de effecten van CPhGs op de darmbarrièrefunctie en de homeostase van de darmmicrobiota bij ALD-modelmuizen. Dit helpt om het hepatoprotectieve mechanisme van CPhGs te onthullen vanuit het perspectief van de darmmicro-ecologie en biedt een experimentele referentie voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.

1. Materialen

1.1 Dieren

Vrouwelijke muizen van SPF-klasse C57BL/6N, 17-20 g, werden gekocht bij Beijing Vitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., certificaatnummer SCXK (Beijing) 2021-0006. Dieren werden grootgebracht en experimenten werden uitgevoerd in de SPF-omgeving van het Animal Experiment Center van de Xinjiang Medical University (SYXK (nieuw) 2022-0003). streng

Voldoen aan de dierenwelzijns- en ethische vereisten van de Experimental Animal Ethics Committee van de Xinjiang Medical University (IACUC-20220127-4).

1.2 Reagentia

Absolute ethanol, isopropylalcohol (respectievelijk Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, batchnummers 20230201 en 20190103); Lieber-Decarli vloeibare controlevoeding, Lieber-Decarli vloeibare alcoholvoeding (Daitz Biotechnology (Wuxi) Co., Ltd., batchnummers respectievelijk voor 710027 en 710260);

Paraformaldehyde-fixeermiddel, Carnoy's fixeermiddel en elektronenmicroscoopfixeermiddel (respectievelijk Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd., batchnummers CR2208028, CR2305094 en CR2210001); LBP-enzymgekoppelde immunosorbentassay (ELISA)-kit, TNF-ELISA-kit, IL-1

ELISA-kit, D-LA ELISA-kit, DAO ELISA-kit, TG colorimetrische testkit en TC colorimetrische testkit (Wuhan Yilerite Biotechnology Co., Ltd., batchnummers zijn CV072V649815, CV112VX05028, CV106T8F3303, GY00L4423397),

GY010XN08244, GY03P04Z5104 en GY02DHB82603); LPS ELISA-kit (Wuhan Fein Biotechnology Co., Ltd., batchnummer U3126I069T); ALT-testkit, AST-testkit, TG-testkit en TC-testkit (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. Co., Ltd., batchnummers zijn 140122014, 140223002, 141722001 en 141622017); HE-kleuringsoplossing, verzadigde Oil Red O-kleuringsoplossing, AB-PAS-kleuringsoplossing; Primair Muc2-antilichaam, secundair anti-muis-antilichaam van geit (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd., de batchnummers zijn respectievelijk G1005, G1015, G1049, GB11344 en GB23301).

1.3 Geneesmiddelen

Cistanche-extract werd gekocht vanXinjiang Hotan Dichen Farmaceutisch en Biologisch Co., Ltd. (echinaceaside Groter dan of gelijk aan 40%, verbascoside Groter dan of gelijk aan 16%, fenylethanoïdeglycoside Groter dan of gelijk aan 85%, batchnummer 20230103).

1.4 Instrumenten

BS-240VET automatische biochemische analysator (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.); HT7800 transmissie-elektronenmicroscoop (Hitachi Manufacturing Co., Ltd., Japan).

2. Methode

2.1 Groepering en vaststelling van diermodellen

36 muizen werden willekeurig verdeeld in normale groep, normale toedieningsgroep, modelgroep en CPhG's lage, gemiddelde en hoge dosisgroepen (175 mg·kg-1, 350 mg·kg-1 en 700 mg·kg{{ 6}}), elke groep van 6. Alle muizen kregen eerst vloeibaar Lieber-Decarli-controlevoer en werden aangepast aan voedsel gedurende 3 dagen. normaal

De controlegroep en de normale doseringsgroep kregen vloeibare controlevoeding van Lieber-Decarli; de modelgroep en de CPhG-groepen met lage, gemiddelde en hoge dosis kregen vloeibaar LieberDecarli-alcoholvoer. Vanaf de vierde dag van het experiment verhoogden de modelgroep en de CPhG's lage, gemiddelde en hoge dosisgroepen geleidelijk de alcoholconcentratie van de alcoholvoeding van 0% naar 5%, en handhaafden de alcoholconcentratie van 5% totdat het einde van het experiment, en 9 uur ingedrukt voordat de materialen werden verzameld. 0,2 ml·10 g-1 werd met 30% ethanol in de maag toegediend.

Al het voer wordt nu bereid en gebruikt, en vers voer wordt elke dag vervangen van 17:00 tot 19:00. Observeer elke dag het eten, de activiteit en de mentale toestand van de muizen. Wanneer de muizen in de modelgroep in een dronken toestand verschijnen, zoals lusteloosheid, verminderde activiteit en verminderde voedselinname, geeft dit aan dat de modellering succesvol is [17]. Toen de groepen met een lage, gemiddelde en hoge dosis CPhG en de groep met normale toediening begonnen met het voeren van alcoholisch voer, werd de CPhG-oplossing met de overeenkomstige concentratie in totaal 14 dagen elke dag toegediend, en de rest werd een normale zoutoplossing toegediend.

2.2 Algemene observatie

Het eten, de activiteit, de mentale toestand en de uitscheiding van de muizen werden elke dag geobserveerd; tijdens het modelleren en de toediening van medicijnen werden de sterftesituatie en het gewicht van de muizen geregistreerd. Orgaancoëfficiënt=orgaanmassa/(lichaamsmassa/100)×100%.

2.3 Selectie van proefdieren

Nadat ze gedurende 12 uur geen voedsel en water hadden gekregen, werden de muizen verdoofd, werden hun oogbollen verwijderd en werd bloed verzameld voordat ze werden opgeofferd. Het leverweefsel van de grootste kwab werd gefixeerd in een paraformaldehyde-oplossing. Het jejunale weefsel werd snel gescheiden op ijs en gefixeerd in een fixeermiddel met een elektronenmicroscoop; 3 cm jejunaal- en colonweefsel (zonder de inhoud door te spoelen) werd gescheiden en gefixeerd in Carnoy's fixeermiddel. Nog eens 3 cm van het jejunum- en colonweefsel (inhoud gespoeld met fysiologische zoutoplossing) werd gefixeerd in een paraformaldehyde-oplossing. De inhoud van alle darmsegmenten werd verzameld in steriele enzymvrije cryovials, snel ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens overgebracht naar een koelkast van -80 graden voor opslag.

2.4 ELISA en colorimetrische detectie van homogenaatindicatoren van serum en leverweefsel

Het automatische biochemische instrument werd gebruikt om serum-ALT-, AST-, TG- en TC-niveaus te detecteren; de ELISA-methode werd gebruikt om serum-TNF-, IL-1-, LPS-, LBP-, DAO- en D-LA-niveaus en lever-LBP-niveaus te detecteren. Werk volgens de instructies. Om leverweefsel te homogeniseren, neem je 0,05~1.00 g vers leverweefsel, voeg isopropylalcohol toe in een temperatuur van 2~8 graden, afhankelijk van de verhouding tussen gewicht (g): volume (ml) { {9}}:9, maal tot homogenaat en centrifugeer bij 20.000 g·min-1 15 min, neem het supernatant en plaats het op ijs om te testen, en werk volgens de instructies. Colorimetrische detectie van TG- en TC-niveaus in leverweefselhomogenaatmonsters.

2.5 HE- en Oil Red O-kleuring om pathologie van leverweefsel te detecteren

Voor hematoxyline-eosinekleuring (HE) werd het gefixeerde leverweefsel verwijderd, in paraffine gesneden, met HE gekleurd en gedehydrateerd en gemonteerd. Het gefixeerde leverweefsel werd eruit gehaald, in plakjes gesneden, gewassen met isopropylalcohol, gekleurd met Oil Red O, afgesloten en onder een lichtmicroscoop bekeken.

2.6 HE- en AB-PSA-kleuring om pathologische observatie van darmweefsel te detecteren

Jejunaalweefsel werd verwijderd en gefixeerd in paraformaldehyde-oplossing voor HE-kleuring; colonweefsel werd verwijderd en gefixeerd in Carnoy's fixeermiddel voor AB-PAS-kleuring. Immunohistochemische stappen: Paraffinesecties dehydrateren, antigeen ophalen, endogene peroxidase blokkeren, serumblokkering toevoegen, primair antilichaam toevoegen, secundair antilichaam toevoegen, celkernen tegenkleuren na kleurontwikkeling, uitdrogen en monteren, en observeren onder een lichtmicroscoop. Het jejunale weefsel werd verwijderd, in kleine stukjes van 1 mm x 1 mm x 1 mm gesneden, premenstrueel gefixeerd, achteraf gefixeerd, gedehydrateerd, ingebed, gepolymeriseerd en in ultradunne plakjes gesneden. De microvilli-veranderingen van jejunale epitheelcellen in elke groep werden waargenomen onder een transmissie-elektronenmicroscoop.

2.7 Sequencing en analyse van darmflora met behulp van de 16S-methode

Darminhoud van de normale groep, normale doseringsgroep, modelgroep en CPhG's hoge dosisgroep, gebaseerd op V3-V4 regio 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') en 806R (5'-GGACTACNNNGGGTATCTAAT -3'), met behulp van 16S rDNA high-throughput sequencing-technologie voor sequencing van bacteriële gemeenschappen. Het sequencing-experiment in dit onderzoek werd voltooid door Shenzhen Microtech Technology Group Co., Ltd. De sequentiegegevens van de darmmicrobiota in dit onderzoek zijn geüpload naar het National Center for Biotechnology Information onder projectnummer PRJNA1006676.

Op basis van de analyseresultaten van ampliconsequentievarianten (ASV's) worden alfadiversiteit, bètadiversiteitsanalyse, annotatie van soortclassificatie en verschilanalyse uitgevoerd. Onder hen omvat de Alpha-diversiteitsindex voornamelijk de Shannon-index en de Chao1-index, en de statistische test maakt gebruik van de Wilcoxon-test; PCoA

Hoofdcoördinatenanalyse (PCoA) werd uitgevoerd met behulp van Anosim om verschillen tussen groepen te analyseren; LEfSe werd gebruikt om LEfSe te analyseren) om soorten te verkrijgen met significante verschillen tussen groepen. Bio-informatica-analyse werd uitgevoerd met behulp van Microtech Alliance's Bioincloud Platform (https://www.bioincloud.tech) tools.

2.8 Statistische analyse

Alle meetgegevens worden beschreven als igh̅± 𝑠. Voor gegevens die aan de normale verdeling voldoen en voldoen aan de homogeniteits-van-variantietest, wordt variantieanalyse met één factor gebruikt. Anders wordt de niet-parametrische test gebruikt. De gegevens worden statistisch geanalyseerd met behulp van SPSS 24.0. P<0.05 means the difference is statistically significant.