Effect van Runing II op de groei en metastase van getransplanteerde tumoren bij borstkankerdragende muizen en het mechanisme ervan

Objectief:

Om het effect te bestuderen van Runing II (een Chinees kruidenpreparaat voor borstkanker) op de groei en metastase van getransplanteerde tumoren van borstkanker MA-891-dragende TA2-muizen en het mechanisme ervan. Methoden: Het model van mammacarcinoom Een getransplanteerde tumor van een MA-891-celstam van TA2-muizen met longmetastasen werd ontwikkeld om het effect van Runing II op de groei en metastase van de getransplanteerde tumor te observeren. De immunohistochemische methode en beeldanalyse werden toegepast om de niveaus van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), vasculaire endotheliale groeifactorreceptor (VEGFR), microvatentelling (MVC) en microvatengebied (MVA) te detecteren.

Resultaten: In de Running II-groep waren het remmingspercentage van het tumorgewicht en het remmingspercentage van longmetastasen respectievelijk 37,3 procent en 65,4 procent, de tumorgroei en longmetastasen werden duidelijk geremd; En de niveaus van VEGF en VEGFR, MVC en MVA waren significant verlaagd in vergelijking met die in de tumordragende controlegroep (P<0.05). Conclusion: The Chinese herbal preparation Running II can inhibit the metastasis of tumors by inhibiting angiogenesis, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of VEGF and VEGFR expression.

Bovendien ontdekten we tegelijkertijd dat echinacea in Cistanche een antitumoreffect heeft. Voor de toepassing van echinacoside in antitumorgeneesmiddelen voegt de onderhavige uitvinding eerst MTH1, anorganische pyrofosfatase en dGTP toe aan de reactieoplossing (100mM pH8,0 Tris-azijnzuur, 40mM NaCl, 10mM magnesiumacetaat, 0,005 procent Tween20 en 1 mMDTT) Bij de methode werden het enzym en het substraat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en daarna werd 25 µl van de malachietgroene oplossing toegevoegd om de reactie te beëindigen. De absorptie werd gedetecteerd bij 630 nm met een BIO‑RAD iMark microplaatlezer. De resultaten toonden aan dat echinacoside een significant remmend effect had op de enzymactiviteit van MTH1; Ten tweede werd het effect van echinacoside op tumorcellen op cellulair niveau gedetecteerd door MTT-assay, en de resultaten toonden aan dat echinacoside de groei van SW480-darmkankercellen en U2OS menselijke osteosarcoomcellen aanzienlijk kon remmen, en de onderhavige uitvinding remde de groei van echinacoside. MTH1, een specifiek enzym dat de overleving in tumorcellen handhaaft, leidt tot de opname van geoxideerde nucleotiden in DNA, waardoor dodelijke DNA-dubbelstrengsbreuken in kankercellen worden veroorzaakt, waardoor antitumoreffecten worden geproduceerd. De nieuwe medische toepassing zal de basis leggen voor de ontwikkeling van nieuwe antitumorgeneesmiddelen in de toekomst.

Klik op het product met cistanche-effecten

Trefwoorden:

borsttumor; angiogenese; vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF); Running II (een Chinees kruidenpreparaat voor borstkanker)

Borstkanker is een kwaadaardige tumor die de gezondheid van vrouwen ernstig bedreigt en de incidentie van de ziekte staat op de eerste plaats onder de kwaadaardige tumoren bij vrouwen, met een tendens om jaar na jaar toe te nemen. Hoewel de therapeutische methoden enige vooruitgang hebben geboekt, is het overlevingspercentage op lange termijn voor de patiënt met borstkanker niet verhoogd vanwege de invasieve groei en metastase van tumoren. De angiogenese van tumoren is een basisvoorwaarde voor de groei, invasie en metastase van tumoren.

Daarom is remming van angiogenese van tumoren een effectieve manier om de productie en ontwikkeling van tumoren te voorkomen en het leven van de patiënt te verlengen.1 In de huidige studie, het mechanisme van het Chinese medicijn Running II met functies van het aanvullen van qi en het voeden van yin, het reguleren van doorgangs- en conceptievaten, het oplossen van massa en het ontgiften bij het remmen van tumor en anti-metastase werd bestudeerd aan de hand van angiogenese en zijn regulerende factoren in de getransplanteerde tumor van borstkanker MA-891 van TA2-muizen met longmetastase.

MATERIALEN

Zestig SPF vrouwelijke TA2-muizen, met een gewicht van (20 ± 2) g, in de leeftijd van 6-8 weken, werden gekocht bij het Department of Laboratory Animals, Tianjin University of Medical Sciences. De MA{4}}-celstam van borstkanker van de muis werd geleverd door prof. Luo Liqin, het Pathologisch Laboratorium, Instituut voor Tumor, Chinese Academie voor Medische Wetenschappen.

Runing II is samengesteld uit Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Yi Yi Ren ( Semen Coicis), Yin Yang Huo (Herba Epimedii), Dang Gui (Radix Angelicae Sinensis), enz., met een dosisverhouding van 1,67: 1,67: 1,33: 1,33: 1,33: 1,33: 1,33: 1, die een afkooksel werden bereid door de Sectie Farmacie, Longhua Hospital, volgens een traditionele techniek, en voor gebruik op 4ć gehouden; Cyclofosfamide (CTX, 200 mg/ampul, filiaalnummer: 981104) en tamoxifen (TAM) werden geproduceerd door Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd.; Normale zoutoplossing werd geproduceerd door Shanghai Fumin Pharmaceutical Co.

Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) polyklonaal antilichaam (werkverdunningen 1:25–1:50), vasculaire endotheliale groeifactorreceptor (VEGFR, werkverdunningen 1:30–1:50) en FVIIIAg polyklonaal antilichaam (werkverdunning 1:50 ) werden gekocht van Santa Cruz Biotechnology Inc; EnVision tweede antilichaam, konijnen-anti-ratten VEGF-antilichaam, geiten-anti-konijnen FVIII Ag-antilichamen en geiten-anti-konijnen VEGFR-antilichamen, en EnVision Kit werden gekocht bij Dako Co., Denemarken; 3,3- Diaminobenzidine (DAB) is gekocht bij de Shanghai Huamei Bioengineering Factory.

METHODEN

Ontwikkelen van diermodel

Het diermodel is ontwikkeld met verwijzing naar de methoden van Luo en Gao, et al.2,3. In vitro gekweekte borstkanker MA-891-cellen van de muis in een logaritmische overlevingsfase werden geselecteerd en de concentratie van cellen werd gereguleerd als 1x107 /ml. Onder aseptische omstandigheden werden de kankercellen van zoogdieren geïnoculeerd in het subcutane deel van de rechter oksel van de TA2-muis (0,2 ml/muis, dwz 2 x 106 cellen/muis).

Groepering van dieren en wijze van toediening

Twee dagen na inoculatie werden de muizen willekeurig verdeeld in 4 groepen, 15 muizen in elke groep. 1) Tumordragende controlegroep: 0.4 ml normale zoutoplossing werd intragastrisch toegediend, eenmaal per dag, vijf keer per week. 2) Runing II-groep: Runing II werd verdund met normale zoutoplossing en 0.4 ml van deze verdunning overeenkomend met 48 g·kg{{10}}·d-1 die berekend volgens de bijgevoegde tabel "Conversion Table between Human and Animal Body Surface Areas" in "Methodology of Studies on pharmacology of Chinese Drugs"4 intragastrisch toegediend, eenmaal daags, vijfmaal per week. 3) CTX-controlegroep: Ongeveer de dosering gebruikt door Jiang Bo,5 CTX werd verdund met normale zoutoplossing en 0,4 ml overeenkomend met 50 mg·kg-1·d-1 werd intragastrisch toegediend, eenmaal per twee dagen, driemaal per week. 4) TAM-controlegroep: TAM werd verdund met normale zoutoplossing en 0,4 ml overeenkomend met 2,7 mg·kg-1·d-1 werd eenmaal daags, vijfmaal per week intragastrisch toegediend. De medicijnen werden in alle vier de groepen gedurende 3 weken gegeven.

Bemonstering

Op de 22e dag na toediening werden de muizen opgeofferd door ontwrichting van halswervels en gewogen. Vervolgens werden respectievelijk de tumormassa en de long genomen en gewogen. Het werkelijke lichaamsgewicht van de muis=het lichaamsgewicht gewogen – het tumorgewicht. Grijze knopen op het longoppervlak, dwz metastasefocussen, werden met het blote oog geteld. De tumormassa werd voor fixatie in een 10 procent neutrale formaldehyde-oplossing geplaatst, gevolgd door paraffine-inbedding, ultradunne coupes, immunohistochemische Envision tweestaps persing en bepaling van VEGF, VEGFR, microvatentelling (MVC) en microvatengebied (MVA).

Het remmingspercentage van het tumorgewicht

Het tumorremmingspercentage=(gemiddeld tumorgewicht van de controlegroep na behandeling – gemiddeld tumorgewicht van de medicatiegroep na behandeling)/gemiddeld tumorgewicht van de controlegroep na behandeling × 100 procent .

Het remmingspercentage van longmetastasen

Het remmingspercentage van longmetastase=(gemiddeld aantal longmetastaseklieren van de controlegroep – gemiddeld aantal longmetastaseknooppunten van de medicatiegroep)/gemiddeld aantal longmetastaseknooppunten van de controlegroep x 100 procent .

Immunohistochemisch Denk aan kleuring in twee stappen

De paraffinesectie van 4 μm werd genomen, gevolgd door routinematige deparaffine met xyleen, gradiëntdehydratie en wassen met PBS, 5 min x 3 keer; de sectie werd ondergedompeld in 0.01 mol/L, pH 6,0 citraatbuffer, gedurende 10 minuten in een magnetronoven van 98º geplaatst voor antigeenherstel en op natuurlijke wijze afgekoeld tot kamertemperatuur nadat het uit de magnetron; druppelen van het eerste antilichaam (respectievelijk bovengenoemde antilichaam en verdunning van overeenkomstig antilichaam), 37º, 90 min, wassen met PBS, 5 min x 3 keer; druppelen van het tweede antilichaam van Envasion, gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur, wassen met PBS, 5 min x 3 keer; druppelen van nieuw bereide DAB-kleurontwikkelingsoplossing, controle van de ontwikkelingskleur gedurende 3-10 minuten onder een microscoop, tegenkleuring gedurende 45 seconden met campeachy, spoelen met kraanwater, drogen met een blazer, aanbrengen met neutrale gom. De cel met het cytoplasma van bruingele of zwartbruine korrels werd als positief beschouwd. De bekende positieve sectie van borstkanker werd gebruikt als een positieve controle, en die waarin PBS-buffer het eerste antilichaam verving, werd gebruikt als een negatieve controle.

Foto analyse

ACE videocamera (oplossend vermogen 930 lijnen) en LEICAQ500W beeldanalysator en LEICA volautomatisch beeldanalysesysteem werden gebruikt. Onder een microscoop x 200 werden 2 zichtvelden in elke sectie willekeurig geselecteerd voor de bepaling van VEGF of 3 zichtvelden voor de bepaling van VEGFR en MVA, en het percentage positief gebied ten opzichte van het gehele gezichtsveld werd berekend in alle groepen . Voor bepaling van MVC werden 5 regio's met de rijkste bloedvaten geselecteerd in elke sectie onder een microscoop x 100, en vervolgens werden onder x 400 de microvaatjes in elk gezichtsveld van 5 niet-overlappende regio's geteld, en het gemiddelde werd gebruikt als een gemiddelde microvatenteller (MVC) van de tumor.

Statistische methode

Software SPSS8.0 werd gebruikt en de chi-kwadraattoets werd gebruikt voor de vergelijking tussen de percentages, en een t-toets of one-way ANOVA werd gebruikt voor de vergelijking van gemiddelden.

RESULTATEN

Tumorremmende en anti-metastase-effecten van Running II op de getransplanteerde tumor van borstkanker MA{2}}dragende TA2-muizen met longmetastasen

It was shown in Table 1 that the tumor weight inhibition rate was 37.3% in the Runing II group and 86.2% in the CTX control group, both tumor inhibition rates being >30 procent, met significant verschil (beide P<0.05) as compared with both tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor-inhibiting effect. And there was a significant difference (P<0.05) between the Runing II group and the CTX control group in the tumor inhibition rate, indicating that the tumor-inhibiting effect of Runing II was lower than that of CTX. The lung metastasis inhibition rate was 65.4% in the Runing II group and 43.9% in the CTX control group, with significant difference (both P<0.05) as compared with a tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor metastasis-inhibiting action. And there was a significant difference between the Runing II group and the CTX control group (P<0.05) in the lung metastasis inhibition rate, suggesting that the anti-metastasis action of Runing II is superior to that of CTX.

Effecten van Running II op VEGF- en VEGFR-expressies in de getransplanteerde tumor van MA-891--dragende TA2-muizen

Zoals weergegeven in tabel 2, waren de expressies van VEGF en VEGFR in zowel de Running II-groep als de CTX-controlegroep significant lager dan die in de tumordragende controlegroep (P<0.05), with a significant difference between the two. In the Running II group, the VEGF and VEGFR expressions were not significantly different from those in the CTX control group (P>0.05), was de VEGF-expressie significant lager dan die in de TAM-controlegroep (P<0.05), and the VEGFR expression was similar to that in the TAM control group (P>0.05). In the CTX control group, the VEGF and VEGFR expression was lower than those in the TAM control group. In the TAM control group, the VEGF expressions were similar to that in the tumor-bearing control group (P>0.05), en de VEGFR-expressie was lager dan die in de tumordragende controlegroep (P<0.05).

Effect van Running II op MVA en MVC van de getransplanteerde tumor in MA{0}}dragende TA2-muizen

Zoals weergegeven in tabel 3, waren de niveaus van MVA en MVC in de getransplanteerde kanker in de medicatiegroepen significant lager dan die in de tumordragende controlegroep (P<0.05); in the Running II group, the levels of MVA and MVC were significantly higher than those in the CTX control group (P<0.05), the level of MVC was lower than that in the TAM control group (P<0.05), and the MVA level was similar to that in the TAM control group (P>0.05).

DISCUSSIE

De traditionele Chinese geneeskunde stelt dat het ontstaan ​​en de ontwikkeling van een tumor het gevolg is van de alomvattende effecten van idiopathische en empathische factoren, maar met de nadruk op de eerste. In een eerder klinisch onderzoek stelden prof. Lu en Tang dat vitale qi-deficiëntie in het inwendige en disharmonie van doorgangs- en conceptievaten de belangrijkste oorzaken zijn van het ontstaan ​​van tumoren, en interne invasie, verplaatsing en verspreiding van kankerpathogenen de belangrijkste voorwaarden zijn van groei en uitzaaiing van borstkanker.6 Daarom pleiten ze bij de behandeling voor het voeden van vitale qi en het verwijderen van massa's. Running II is een Chinese kruidenformule die is samengevat door de klinische praktijk van vele jaren volgens het behandelprincipe om eerst de weerstand van het lichaam te versterken en vervolgens pathogene factoren te elimineren. In de formule zijn Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), Yin Yang Huo (Herba Epimedii) soevereine ingrediënten, met effecten van het aanvullen van qi en het voeden van yin, het reguleren doorgangs- en bevruchtingsvaten, wat overeenkomt met algemeen geziene kenmerken van borstkanker, zoals zowel qi- als yin-deficiëntie en disharmonie van doorgangs- en bevruchtingsvaten. Klinisch bereikt deze formule het voor de hand liggende effect van het verlengen van de overlevingstijd, het verhogen van de kwaliteit van leven, het stabiliseren van de tumorfocus en het voorkomen van uitzaaiingen van kanker.

De huidige studie vestigde het model van borstkanker MA -891 celstam getransplanteerde tumor van TA2-muizen met longmetastase en observeerde het effect van Running II op solide tumorgroei en longmetastase, en vond dat er significante verschillen waren in de tumor remmingspercentage en het remmingspercentage van longmetastase tussen de Running II-groep en de tumordragende groep, en tussen de Running II-groep en de CTX-controlegroep, wat aantoont dat Running II duidelijke functies heeft voor het remmen van tumorgroei en anti-metastase. Bovendien heeft tamoxifen (TAM) niet de voor de hand liggende functie om tumorgroei en anti-metastase in de modelmuizen te remmen, omdat het vergelijkbaar is met het resultaat dat borstkanker MA-891 ER-celstam is en het rapport over directe actie van lage concentratie van TAM in het buitenland.7

De tumor is een typische bloedvatafhankelijke ziekte en de groei, infiltratie en metastase zijn afhankelijk van angiogenese. Tegelijkertijd levert de neovascularisatie weer een metastasekanaal voor tumorcellen, waardoor gunstige omstandigheden worden gecreëerd voor groei, metastase en diffusie van de tumor. 8, 9 VEGF is een pro-angiogene factor met de sterkste, unieke en specifieke werking op vasculaire endotheelcellen, en veel tumorcellen kunnen VEGF afscheiden, wat de vasculaire permeabiliteit verhoogt en direct inwerkt op vasculaire endotheelcellen door binding aan de VEGF-receptor, het stimuleren van de deling en proliferatie, het induceren van angiogenese van de tumor en het beïnvloeden van het aantal microvaten, om de groei en metastase van de tumor te bevorderen.10,11 De meeste tumorcellen hebben een hoge VEGF-expressie, terwijl in de normale weefsels slechts een klein aantal organen zoals de nieren, eierstokken enz. hebben een hogere VEGF-expressie. Daarom zijn sommige geleerden van mening dat VEGF kan worden gebruikt als markers van tumormetabolisme en metastase12 en een meer ideaal doelwit is voor het blokkeren van neoangiogenese in tumoren,13 en het interfereren met vasculaire regulerende factoren van tumoren en de werkende link, het reguleren van de expressie van angiogenesefactoren, en het remmen van angiogenese kan mogelijk de groei en metastase van de tumor beheersen.

De resultaten in de huidige studie geven aan dat Runing II expressies van VEGF en VEGFR kan neerwaarts reguleren om mogelijk de signaalgeleiding van door VEGF geïnduceerde migratie en proliferatie van endotheelcellen te blokkeren en angiogenese in tumoren verder te remmen, waardoor antineoplastische en anti-metastaserende effecten worden uitgeoefend. .

Eerdere studies toonden aan dat in het groeiverloop van kwaadaardige tumoren een te snelle groei van het weefsel onvermijdelijk ernstige anoxie van lokaal weefsel induceerde en dat anoxie de synthese van VEGF-mRNA zou kunnen stimuleren en de afbraak van VEGF-mRNA zou kunnen vertragen om het ontstaan ​​van een groot aantal lokale nieuwe capillaire vaten.14,15 Bij observatie van immunohistochemisch positief kleurende cellen vonden de auteurs duidelijke VEGF-expressie in het cytoplasma van stervende necrotische tumorcellen, integendeel, minder of geen expressie van VEGF in tumorcellen met actieve proliferatie , wat mogelijk verband houdt met een hoger niveau van anoxie-inducerende factor in tumorcellen, conform het rapport van Talks KL, et al.16 Running II bevat Dang Gui (ᔧᔦ Radix Angelicae Sinensis), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Sheng Yi Yi Ren (Semen Coicis), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae), enz., die de bloedcirculatie activeren, slijm oplossen en troebelheid verwijderen. Ze remmen de synthese en uitscheiding van VEGF, mogelijk door de lokale microcirculatie van de tumor te verbeteren, de zuurstoftoevoer naar de tumorcellen te vergroten, waardoor de groei van de tumor wordt geremd om metastase tegen te gaan.

REFERENTIES

1.Folkman J. Angiogenese en borstkanker. J. Clin Oncol 1994; 12: 441-443.

2. Folkman J. Angiogenese-onderzoek: van laboratorium tot kliniek. Forum (Genua) 1999; 9: 59-62.

3. Potgens AJ. Vasculaire permeabiliteitsfactorexpressie beïnvloedt tumorangiogenese in menselijke melanoomlijnen die xenograft zijn op naakte muizen. Am J Pathol 1995; 5: 775-782.

4.Sauter ER, Nesbit M, Watson JC, et al. De vasculaire endotheliale groeifactor is een markt van tumorinvasie en metastase in plaveiselcelcarcinomen van het hoofd en de nek. Clin Kankeronderzoek 1999; 5: 775-782.

5. Warren RS, Yuan H, Matli MR, et al. Regulatie door vasculaire endotheliale groeifactor door hypoxie. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

6. Levy AP, Levy NS, Goldberg MA. Post-transcriptionele regulatie van vasculaire endotheliale groeifactor door hypoxie. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

7. Talks KL, Turley H, Gatter KC, et al. De expressie en distributie van de hypoxie-induceerbare factoren HIF-1 alfa en HIF-2 alfa in normale menselijke weefsels, kankers en tumor-geassocieerde macrofagen. Am J Pathol 2000; 157: 411-421.

For more information:1950477648nn@gmail.com