Effect van Shenkang op nierfibrose en activering van renale interstitiële fibroblasten via de JAK2 / STAT3-route

edmund.chen@wecistanche.com

Achtergrond

Chronische nierziekte (CKD) is het gevolg van een verscheidenheid aan verschillende ziekten die de nier onomkeerbaar beschadigen en verschillende soorten complicaties bij patiënten veroorzaken [1]. Voor patiënten die dialyse ondergaan, wordt de kwaliteit van leven sterk beïnvloed en zijn de medische kosten erg hoog [2]. Het primaire pathologische proces vannierbeschadigingleidt tot normaalnierparenchymvernietiging en progressieve vorming van littekenweefsel, wat uiteindelijk leidt tot fibrose. nierfibrose omvat tubulaire interstitiële fibrose en glomerulosclerose [3], wat leidt tot de vernietiging vanrenaal weefsel en functieverlies.niertubulo-interstitiële fibrose is de typische route voor de progressieve ontwikkeling van bijna alle CKD's en de belangrijkste pathologische basis voor eindstadiumnierziekte,die wordt gekenmerkt door tubulaire epitheelcelatrofie, infiltratie van ontstekingscellen, afwijkende activering en groei vannierfibroblasten en overmatige accumulatie van extracellulaire matrix (ECM) [4, 5]. De effectorcellen, -gladde spieractine (-SMA)-positieve myofibroblasten, synthetiseren en scheiden ECM af. De activering van interstitiële fibroblasten in myofibroblasten kan helpen om beschadigd weefsel te herstellen. Wanneer dit herstelproces echter abnormaal is en overmatige ECM wordt uitgescheiden, resulteert dit in onomkeerbare nierschade. Dienovereenkomstig kan de signaalroute die myofibroblastactivering medieert een doelwit zijn voor het verlichten van het proces vannierfibrose.

CISTANCHE ZAL NIER/NIIERZIEKTE VERBETEREN

De Janus kinase/signaaltransducer en activator van transcriptie (JAK/STAT)-route is een pleiotrope signaalcascade voor meerdere groeifactoren en cytokinen [6] die een verscheidenheid aan cellulaire functies bemiddelt, waaronder celoverleving en -proliferatie [7]. STAT3 wordt geactiveerd door tyrosine (Tyr) fosforylering op Tyr705 via Janus kinase als reactie op een verscheidenheid aan groeifactoren en cytokinen, waaronder transformerende groeifactor (TGF-) [8]. Gefosforyleerd STAT3 vormt dimeren, die vervolgens worden overgebracht naar de kern, waar ze direct binden aan de DNA-sequentie en de expressie van doelgenen reguleren [9]. De activering van STAT3 en JAK2 is verhoogd in fibrogene renale interstitiële fibroblasten die worden geïnduceerd door unilaterale ureterale obstructie (UUO) [10, 11]. Een toename in STAT3-fosforylering is ook waargenomen in met TGF- -behandelde NRK-49F-cellen [12].

De huidige veelgebruikte behandelingen voor CKD gaan vaak gepaard met minder dan bevredigende effecten [13] en vaak voorkomende bijwerkingen. Het is dus van groot belang om effectieve behandelingsmaatregelen te onderzoeken en te identificeren om het optreden en de ontwikkeling van CKD te voorkomen en te beheersen om de prognose van patiënten te verbeteren. Shenkang (SK) is een veelgebruikte kruidenformule die rabarber (Rheum palmatum L. of R. tanguticum Maxim. ex Balf.), rode salie (Salvia miltiorrhiza Bunge), saffloer (Carthamus tinctorius L.) en astragalus (Astragalus mongholicus) bevat bungee). Sinds de jaren negentig wordt SK in China gebruikt voor de behandeling van CKD en aanverwante ziekten, waaronder diabetische nefropathie (DN), chronischenierfalen, glomerulonefritis, chronische nefritis ennierinsufficiëntie. Met zijn duidelijke therapeutische effecten en weinig bijwerkingen, kan SK de progressie vannierdisfunctie bij CKD. In een klinische proef met 2200 mensen, de werkzaamheid van SK bij de bescherming tegen chronischenierfalen en symptomen geassocieerd met CKD na behandeling met traditionele Chinese geneeskunde was respectievelijk 73,05 en 98,{3}} procent. Bovendien bleven de creatinineklaring en het serumcreatinine (SCr)-niveau stabiel, wat aantoont dat SK een goede werkzaamheid heeft en veilig is voor de behandeling van CKD [14]. Er is geverifieerd dat SK CKD kan verlichten ennierfibrose door fibrose, ontsteking [15] en apoptose [16] te verminderen. De meeste van de bestaande onderzoeken over dit onderwerp waren echter niet voldoende uitgebreid en waren voornamelijk gericht op TGF- en verwante routes. Het UUO-model wordt erkend als een experimenteel model voor het onderzoeken van nierfibrose. In de huidige studie hebben we de effecten van SK op NRK-49F-fibroblastcelactivering en nierfibrose bij UUO-muizen bestudeerd. We hebben verder aangetoond dat deze genezende effecten van SK mogelijk zijn bereikt door zich te richten op de JAK2/STAT3-route in gekweekte NRK-49F-cellen en een UUO-muismodel.

trefwoorden:Shenkang, chronische nierziekte, nierfibrose, UUO, activering van nierfibroblasten, JAK2/STAT3-route

Methoden:

Chemicaliën en reagentia SK werd gekocht bij Shijishenkang Pharmaceutical Company, Ltd. (Xi'an, China). Kaliumlosartantabletten werden gekocht bij Merck Sharp & Dohme Pharmaceutical Company, Ltd. (Hangzhou, China).

Cel cultuur

De rattennierfibroblastcellijn (NRK -49F) werd verkregen van de American Type Cell Collection (ATCC, Manassas, VA, VS). NRK-49F-cellen werden gekweekt in compleet medium, dwz Dulbecco's gemodificeerde Eagle's-medium (Invitrogen, CA, VS) dat 5 procent foetaal runderserum, 1 procent penicilline en streptomycine bevat in een atmosfeer van 5 procent CO 2 en 95 procent lucht op 37 graden. Vervolgens werden de cellen behandeld met of zonder TGF- 1 (10 ng/ml) (Novoprotein, Shanghai, China), een angiotensinereceptorblokker (ARB) (1 mg/ml) en gradiëntconcentraties van SK na therapietrouw, en levensvatbaarheid van de cellen werd geëvalueerd.

Testen van de levensvatbaarheid van cellen

De levensvatbaarheid van NRK-49F-cellen werd bepaald met behulp van de Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kyushu, Japan) volgens de instructies van de kit. NRK-49F-cellen werden uitgeplaat met een dichtheid van 5 x10 4 cellen per putje in 96-putjesplaten. Er waren 5 herhalingen voor elke behandeling. Na 24 uur of 48 uur kweken werd het medium in elk putje vervangen door 100 L serumvrij medium dat CCK-8 (10:1) bevatte en werden de cellen nog 2 uur in een incubator geïncubeerd. De absorptie werd gemeten bij een golflengte van 450 nm. Het effect van de behandeling werd berekend als het percentage levende cellen ten opzichte van levende controlecellen die alleen met vehiculum waren behandeld.

Dieren

De experimentele procedures die in deze studie werden gebruikt, zijn goedgekeurd door de Animal Care and Ethics Committee van de Beijing University of Traditional Chinese Medicine (nr. BUCM{{{{30}}}},018,{ {39}}60,419-2023) en voldoet aan internationaal erkende principes voor het gebruik en de verzorging van proefdieren. Zesendertig 8- weken oude C57BL/6 mannelijke muizen werden gekocht bij Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (SYXK (Jing), 2017–0{ {51}}33). De muizen werden in een speciaal pathogeenvrij dierlaboratorium geplaatst in een ruimte met airconditioning (licht: 12-u licht/donker cyclus; kamertemperatuur: 25±1 graad; relatieve vochtigheid: 50± 10 procent) en willekeurig verdeeld in de volgende zes groepen: de schijngroep, de UUO-groep, de ARB-groep en de SK-groepen met een hoge, matige en lage dosis. UUO werd geïnduceerd in de muizen in de UUO-groep, de ARB-groep en de SK-groepen met een hoge, matige en lage dosis volgens een eerder vastgestelde procedure. Anesthesie werd geïnduceerd met 2 procent isofluraan en onderhouden met 1,5 procent isofluraan. Een longitudinale incisie van 1- tot 2- cm werd gemaakt in de linker middenbuik, en de linker ureter werd bot gescheiden, op twee plaatsen afgebonden en vervolgens tussen de twee afbindingen doorgesneden. Daarna werd de buikholte gesloten, waarna gedurende 3 dagen analgesie werd gegeven. De muizen in de schijngroep ondergingen vergelijkbare chirurgische procedures, waaronder pre- en postoperatieve anesthesie, laparotomie en botte scheiding van de urineleider, zonder ureterligatie en snijden. Vanaf de tweede dag na obstructie werd losartan intragastrisch toegediend aan de muizen in de ARB-groep in een dosis van 0,13 mg/10 g (0,15 ml/10 g). SK in een hoge dosis van 0,08 g/10 g (0,13 ml/10 g), een matige dosis van 0,04 g/10 g (0,13 ml/10 g) of een lage dosis van 0,02 g/10 g (0,13 ml/10 g) werd gegeven aan muizen in de SK-groep via de staartader gedurende 14 dagen na ureterligatie. Zoutoplossing (0,13 ml/10 g) werd via de staartader toegediend aan de muizen in de sham-, UUO- en ARB-groepen, en zoutoplossing (0,15 ml/10 g) werd via sondevoeding toegediend aan de muizen in de sham-, UUO- en SK-groepen om vooroordeel. Na MRI werd bloed van de muizen verzameld door hartpunctie na opoffering onder diepe anesthesie (geïnduceerd en onderhouden met 2 procent isofluraan) op de 14e dag, en nierweefsels werden verzameld. Serum werd verkregen uit volbloed door 10 minuten te centrifugeren bij 1000 (x g) (4 graden). Serum bloedureumstikstof (BUN), SCr en cystatine C (Cys-C) niveaus werden gemeten met de colorimetrische methode. Hematoxyline en eosine (HE) kleuring en Sirius rood kleuring werden uitgevoerd voor de detectie van respectievelijk histopathologie en collageen in stromale structuren van de aangetaste nier. Voor HE-kleuring werden de plakjes gedrenkt in gedestilleerd water na het ontparaffineren, gedrenkt in hematoxyline-kleuroplossing (Solarbio Science & Technology, China) gevolgd door 1 procent zoutzuuralcoholoplossing voor kleurscheiding, gewassen met kraanwater, blauw gemaakt en gekleurd met eosine kleurstof. De gekleurde plakjes werden gewassen met gedestilleerd water, gedehydrateerd, helder gemaakt en afgesloten met neutrale gom. Voor Sirius-roodkleuring werden de plakjes van was ontdaan, gekleurd met Harris-hematoxyline, gewassen, gekleurd met Sirius-rood (Solarbio Science & Technology, China), direct gescheiden en gedehydrateerd met absolute ethanol, geklaard met xyleen en verzegeld. Vijf gezichtsvelden van deniercortex en proximaal tubulusgebied werden willekeurig geselecteerd voor elke muis. ImageJ-software werd gebruikt om het rode gebied te berekenen en het gemiddelde rode gebied werd berekend om het Sirius roodgekleurde gebied te bepalen.

In vivo MRI om de mate van nierfibrose te evaluerenMuizen ondergingen MRI op de 13e dag na SK-toediening met een 7T MRI-systeem voor kleine dieren (Agilent 7T MRI-systeem) en lichaamsspoel. Anesthesie werd geïnduceerd met 2 procent isofluraan en onderhouden met 1,5 procent isofluraan. De muizen werden in buikligging geplaatst met hun buik gecentreerd ten opzichte van het midden van de radiofrequentiespoel en verbonden met een ademhalingssensor om de ademhaling te volgen. Een RAPID Rat Head System werd gebruikt voor radiofrequentie-excitatie en signaaldetectie. Alle scans werden uitgevoerd onder vrije ademhaling. Beelden werden verkregen met behulp van diffusie tensor imaging (DTI) sequenties, en de parameters waren als volgt: richtingen=30 (b=1004.7s/mm 2 ) plus nul (b=0s/mm 2 ), Δ=4ms en δ=16ms. De parameters voor beeldacquisitie waren als volgt: TR/TE=3000ms/50.73ms, =60 graad, matrix=128×128, FOV=2×2 cm, en plakdikte voor beeldvorming =1mm. De totale duur van het diffusiepreparaat was 4 ms. Tussen de scans werd een scanvertraging van 16 ms toegepast en er werden twee b=0s/mm2 scans opgenomen om de effecten van T1-relaxatie te beperken. De totale scantijd was ongeveer 1 uur. Door hydronefrosenier sstructurele afwijkingen veroorzaakt door ureterobstructie, werden alleen de buitenste cortex en buitenste medulla van rattennierweefsel geëvalueerd voor beeldvormingsanalyse. Fractionele anisotropie (FA)-kaarten werden verkregen en berekend met VNMRJ4.0-software. Om de MRI-signaalintensiteit nauwkeurig te meten en de mate van fibrose tussen verschillende groepen te bepalen, werden vijf scanvlakken geselecteerd voor elk niermonster en werden drie kleine interessegebieden willekeurig geselecteerd voor elk scanvlak.

CISTANCHE ZAL DE NIER/RENALE FUCTIE VERBETEREN

Western-blot-analyseTotaal eiwit werd uit cellen geëxtraheerd met behulp van 5 0 0 L RIPA-eiwitlysisbuffer (Solarbio, Beijing, China). Na 10 minuten centrifugeren bij 10.000 (× g) werd een Bradford-eiwittestkit (Applygen, Beijing, China) gebruikt voor eiwitkwantificering. Equivalente hoeveelheden eiwit (40 ug) werden gedenatureerd bij 100 graden gedurende 10 minuten in laadbuffer (Applygen, Beijing, China), gescheiden door elektroforese op 8-10 procent SDS-PAGE-gels volgens het relatieve molecuulgewicht en elektro-overgebracht op 0.{{ 10}} μm polyvinylideendifluoridemembranen (Millipore, Bedford, MA, VS). Vervolgens werden de membranen geblokkeerd in blokkeerbuffer (Nacalai Tesque, Japan) bij 25 ± 5 graden en geïncubeerd met primaire antilichamen, waaronder -actine (Proteintech Group, VS, 1: 5000), -SMA (Proteintech Group, VS, 1: 1000), collageen III (col I) (Abcam, VK, 1:5000), STAT3 (Proteintech Group, VS, 1:2000), p-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling Technology, VS, 1:2000), JAK2 (Cell Signaling Technology, VS, 1:1000), p-JAK2 (Cell Signaling Technology, VS, Tyr1007) (1:1000), en Peroxiredoxin 5 (Prdx5) (Proteintech Group, VS, 1:800), op 4 graden 's nachts. Na te zijn gewassen in TBST werden de membranen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundair antilichaam (Cell Signaling Technology, VS, 1:10000) en vervolgens opnieuw gewassen met TBST. Vervolgens werden ECL-detectiekits gebruikt voor blootstelling. Vervolgens werd de optische dichtheid van de eiwitbanden afgelezen en geanalyseerd door Image Lab™-software voor kwantitatieve analyse. De densitometrische waarden werden genormaliseerd naar de dichtheid van de -actineband.

Kwantitatieve realtime PCRTotaal RNA werd geëxtraheerd uit cellen ofnierweefsel met behulp van de Monarch® Total RNA Miniprep Kit volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens werd het GoScript Reverse Transcription System gebruikt om cDNA van de eerste streng te synthetiseren volgens de handleiding. Real-time kwantitatieve reverse transcriptie PCR werd uitgevoerd in een 20-μL-reactie. Gentargeting-primers werden ontworpen op basis van mRNA-sequenties gepubliceerd door NCBI en worden vermeld in tabel 1. De relatieve hoeveelheid mRNA werd bepaald op basis van de verhouding van specifieke mRNA-expressie tot -actine-mRNA-expressie in hetzelfde monster, en de vouwverandering ten opzichte van dat in de muizen in de sham-groep of de cellen in de 0ng/mL TGF- 1-groep werd berekend met de 2 -ΔΔCt-methode.

statistische analyseAlle gegevens van ten minste drie onafhankelijke experimenten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van het softwarepakket SPSS 20.0. Normaliteitstesten en homogeniteitstesten voor variantie werden uitgevoerd. Als de gegevens normaal verdeeld waren, werd de Student's t-test gebruikt om de verschillen tussen de twee groepen te vergelijken, en werd eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) (LSD-test voor even varianties en Dunnett's test voor ongelijke varianties) gebruikt om de verschillen tussen groepen. Als de gegevens niet normaal verdeeld waren, werd de niet-parametrische Mann-Whitney U-test gebruikt om de verschillen tussen twee groepen te vergelijken, en de niet-parametrische Kruskal-Wallis-test werd gebruikt om de verschillen tussen meer dan twee groepen te vergelijken. P<0.05, p=""><0.01 or="" p="" <="" 0.001="" indicates="" a="" significant="">

Resultaten

Effect van SK op de levensvatbaarheid van NRK-49F-cellen na behandeling met TGF- 1

TGF- is een belangrijke fibrogenetische cytokine die betrokken is bij nierfibrose. We gebruikten eerst verschillende doses TGF- 1 (0, 10,20, 40 en 80ng/ml) om de groei van NRK- 49F-cellen te stimuleren. Behandeling met TGF- 1 gedurende 24 uur verhoogde de levensvatbaarheid van de cellen op een dosisafhankelijke manier (Fig. 1a), wat consistent is met eerdere bevindingen verkregen via de MTT-assay [17]. Gradiëntconcentraties van SK (1, 2, 4 en 8 mg/ml) verminderden significant de verbetering van de levensvatbaarheid geïnduceerd door 10 ng/ml TGF- 1 (Fig. 1b), en het effect van behandeling gedurende 48 uur was meer voor de hand liggend dan die van behandeling gedurende 24 uur. Dit resultaat gaf aan dat SK TGF- 1-geïnduceerde nierfibroblastgroei en verbetering van de levensvatbaarheid in vitro kan onderdrukken.

SK remde door TGF- -geïnduceerde expressie van -SMA en afzetting van ECM-componenten in NRK-49F-cellenMyofibroblasten zijn actieve fibroblasten die worden gekenmerkt door de expressie van -SMA en ECM-afzetting. TGF- 1 is een belangrijk cytokine dat betrokken is bij de productie van ECM door myofibroblasten en fibrose [18]. Zoals getoond in Fig. 2a en b, zowel -SMA als col. III werden in hoge mate tot expressie gebracht in NRK-49F-cellen na behandeling met TGF- 1, wat aangeeft dat de gekweekte cellen werden omgezet in geactiveerde myofibroblasten wanneer TGF- 1 werd toegediend. Om verder te onderzoeken of SK de activering van renale interstitiële fibroblasten zou kunnen onderdrukken, onderzochten we het effect van SK op -SMA en collageen III-expressie in NRK-49F-cellen. SK-toediening verminderde duidelijk de expressie van -SMA (op een dosisafhankelijke manier) (Fig. 2 en 3a) en col. III (Fig. 2), wat suggereert dat SK TGF- 1-geïnduceerde activering van NRK-49F-cellen direct zou kunnen onderdrukken. Er was een tendens dat het effect van 4 ng/ml SK bij het verlagen van de TGF- 1-geïnduceerde expressie van -SMA en de afzetting van ECM-componenten superieur was aan dat van losartan (1 mg/l).

SK remde TGF- 1-geïnduceerde STAT3-, JAK2-activering en Prdx5-expressie in NRK-49F-cellenOm de mogelijke mechanismen te onderzoeken waarmee SK fibroblastactivering remt, hebben we STAT3- en JAK2-genexpressie en eiwitniveaus in NRK-49F-cellen verder gedetecteerd met respectievelijk RT-qPCR en Western blotting. NRK-49F-cellen brachten hogere niveaus van STAT3- en JAK2-mRNA tot expressie na TGF- 1-stimulatie dan vóór de behandeling. SK remde dramatisch door TGF - 1- geïnduceerde STAT3- en JAK2-mRNA-expressie na 24 uur (Fig. 3b en c). Fosforylering van STAT3 op Tyr705 en JAK2 op Tyr1007 was verhoogd in aanwezigheid van TGF- 1. SK onderdrukte ook de fosforylering van deze twee moleculen (Fig. 2). Prdx5, een JAK2/STAT3-routeregulator, werd opgereguleerd in aanwezigheid van TGF- 1, en deze opregulatie werd ook ongedaan gemaakt door SK-behandeling (Fig. 2). Bijna alle effecten, behalve die op de fosforylering van JAK2 en de expressie van col. III, waren robuuster in de hooggedoseerde SK-groep dan in de laaggedoseerde SK-groep. Bijgevolg lijkt het duidelijk dat SK door TGF- 1-geïnduceerde activering van NRK-49F-fibroblasten zou kunnen remmen door JAK2/STAT3-activering te reguleren. Bij 2 ng/ml of 4 ng/ml had SK een beter effect bij het verbeteren van TGF- 1-geïnduceerde STAT3- en JAK2-activering en Prdx5-expressie dan losartan.

SK verlichtte UUO-geïnduceerde nierdisfunctie en niermorfologische veranderingenEen muismodel voor nierfibrose werd vastgesteld door UUO te induceren. Figuur 4 a, b, c toont de nierdisfunctie-indexen van de schijngroep, de UUO-groep, de ARB-groep en de SK-groepen met een hoge, matige en lage dosis na 14 dagen behandeling. De hoge dosis SK verlaagde significant het Cys-C-niveau (P Kleiner dan of gelijk aan 0.05; Fig. 4a) en SCr-niveaus (P Kleiner dan of gelijk aan {{12} }.01; Fig. 4c), en SK verlaagde het BUN-niveau aanzienlijk bij alle doses (P kleiner dan of gelijk aan 0,05 of P kleiner dan of gelijk aan 0,01; fig. 4b). De bovenstaande resultaten suggereerden dat SK de nierfunctiestoornis en nierfibrose verbeterde en dat de effecten van SK vergelijkbaar waren met die van losartan. Renale HE-kleuring onthulde dat accumulatie van ECM, infiltratie van ontstekingscellen, dilatatie en / of atrofie van niertubuli, degeneratie en necrose van niertubuli-epitheelcellen zonder duidelijke veranderingen in de glomerulaire structuur in de UUO-groep (Fig. 4d). De nierfunctiestoornis was in verschillende mate verlicht in de verschillende behandelingsgroepen in vergelijking met de UUO-groep; de matige dosis en hoge dosis SK bereikten de beste effecten, hoewel de mate van nierfunctie in de schijnoperatiegroep niet werd bereikt in een van de behandelingsgroepen.

SK verlaagde de fibrose-gerelateerde FA-waarde die werd gedetecteerd met behulp van DTIZoals geïllustreerd door Fig. 5, werd de FA-waarde die een lineair verband heeft met de mate van fibrose in echt weefsel bepaald door in vivo DTI. Vergeleken met die in de sham-groep was de FA-waarde in de UUO-groep significant verhoogd (P<0.01). the="" increase="" in="" in="" the="" fa="" value="" in="" the="" presence="" of="" ureteral="" obstruction="" conditions="" was="" significantly="" reversed="" in="" the="" arb="" and="" high-,="" moderate-,="" and="" low-dose="" sk="" groups="" compared="" to="" the="" uuo="" group="">< 0.01="" or="" p=""><0.001), with="" moderate-dose="" sk="" having="" the="" most="" significant="" effect="" (p=""><>

SK remde fibroblastactivering en afzetting van ECM-componenten in UUO-muizenBovendien evalueerden we de expressie van de fibroblastactiveringsmarker -SMA, fibroblast-specifiek eiwit-1 (FSP-1), en de klassieke ECM-componenten fibronectine (FN), col. III en collageen I (col I) in de schijn-, UUO- en matige dosis SK-groepen met behulp van real-time PCR. Omdat de matige dosis SK gelijk is aan de klinisch aanbevolen dosis en omdat de algehele verbetering in de groep met een matige dosis superieur was aan die in de groepen met een hoge en lage dosis, werd een matige dosis SK gebruikt voor het beoordelen van mRNA-expressie. Zoals getoond in Fig. 7a en b, verlichtte een matige dosis SK de verhogingen in -SMA, FSP, FN, col. III en kl. ik niveaus. Deze resultaten waren consistent met de Siriusred-kleuringsresultaten, die aantoonden dat het rode gebied van fibrose in de aangetaste nier in de ARB-groep en de SK-groepen met een matige en lage dosis significant kleiner was dan die in de onbehandelde groep (P<0.05) (fig.="" 6),="" indicating="" that="" sk="" decreased="" the="" number="" of="" col-="" lagen="" bundles="" in="" the="" affected="">

Effect van SK op STAT3-, JAK2- en TGF-mRNA-niveaus en de expressie van regulerende moleculen en de suppressor van cytokinesignalering (SOCS) eiwitten SOCS1 en SOCS3 in UUO-muizenZoals getoond in Fig. 7c, waren de mRNA-niveaus van TGF-, JAK2 en STAT3 significant verhoogd in de UUO-groep in vergelijking met de schijngroep op de 14e dag. Vergeleken met nepmuizen vertoonden SK-behandelde UUO-muizen met een matige dosis een duidelijke afname in JAK2- en TGF-mRNA-niveaus op de 14e dag na obstructie, maar SK verminderde de STAT3-mRNA-niveaus niet significant na UUO. Dit resultaat suggereerde dat het effect van SK op nierfibrose en fibroblastactivering in UUO-muizen zou kunnen optreden door regulatie van JAK2- en STAT3-activering zonder veranderingen in totale STAT3-mRNA-expressie. Het niveau van TGF-, het stroomafwaartse molecuul van STAT3, werd ook verlaagd door SK in de context van ureterligatie. SOCS-eiwitten worden als essentieel beschouwd voor de negatieve regulatie van JAK/STAT-signalering [19]. Als reactie op UUO namen de SOCS1- en SOCS3-niveaus significant toe en werden significant verlaagd in de SK-groep in vergelijking met de modelgroep (figuur 7d). Dit resultaat suggereert dat SK de JAK / STAT-route zou kunnen onderdrukken om de expressie van zijn negatieve regulerende moleculen als feedback te verminderen.

CISTANCHE ZAL NIER/NIERENPIJN VERBETEREN

Discussie

Niertubulo-interstitiële fibrose is de ultieme gemeenschappelijke route van nierziekte in het eindstadium. Myofibroblasten, die zijn afgeleid van een verscheidenheid aan cellen, waaronder epitheelcellen, endotheelcellen en pericyten, via epitheliale-mesenchymale transdifferentiatie (EMT) of endotheliale-mesenchymale transdifferentiatie (EndoMT), kunnen helpen beschadigd weefsel te herstellen door ECM en -SMA te produceren om contractiele spanning genereren [20]. Van deze verschillende celtypen zijn geactiveerde interstitiële fibroblasten de belangrijkste bronnen van myofibroblasten, goed voor 50 procent van deze cellen [21]. Naast -SMA brengen geactiveerde fibroblasten ook specifiek FSP-1 tot expressie. TGF- wordt gedefinieerd als een belangrijke aanjager van nierfibrose en is geactiveerd in verschillende nierziektemodellen en niercellen. Geactiveerde TGF- bindt aan de TGF-receptor en induceert stroomafwaartse signaalmoleculen, waaronder moleculen en transcriptiefactoren gerelateerd aan EMT, EndoMT, fibroblastactivering, ECM-productie en remming van ECM-degradatie, via Smad, inclusief TGF- [23], STAT3 wordt geactiveerd door Tyr-fosforylatie op Tyr705 via Janus-kinasen. Het geactiveerde STAT3-eiwit komt de kern binnen in de vorm van een dimeer en bindt zich aan het doelgen. Bovendien induceert STAT3 TGF-pathway signaaltransductie [24]. In het UUO-model is inderdaad de activering van STAT3 op Tyr705 in renale interstitiële fibroblasten, samen met histopathologische laesies en fibroblastactivering, verhoogd vanaf de eerste dag, met een piek op 7 dagen en stijgend tot 14 dagen [25]. STAT3 is waarschijnlijk betrokken bij vele soorten nierziekten door regulatie van de expressie van doelgenen, met name de transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van CKD. In de huidige studie, op de 14e dag na obstructie, waren de mRNA-niveaus van -SMA, JAK2 en STAT3 significant verhoogd met een verhoogde mate van nierfibrose.

Volgens eerder onderzoek is gevonden dat SK en zijn componenten pathologische schade verminderen, de proliferatie van endotheelcellen remmen, proteïnurie en glomerulosclerose verlichten, de resterende nierfunctie beschermen en de ziekteprogressie vertragen, en zo ingrijpen in de progressie van CKD en nierfibrose; er zijn echter geen meldingen geweest van fibroblastactivering. Volgens eerdere onderzoeken en onze CCK-8-resultaten werd 10 ng/ml TGF- 1 gebruikt om fibroblasten te activeren; 1, 2 en 4 mg/ml werden geselecteerd als de lage, matige en hoge doses SK; en 48 uur werd geselecteerd als de interventietijd in de huidige studie. Opregulatie van -SMA en morfologische veranderingen vergezeld van celproliferatie en -activering, die zich manifesteerde als toename van de levensvatbaarheid van de cellen en ECM-productie, vond plaats in NRK-49F-cellen na TGF- 1-stimulatie [26, 27]. In deze studie werd bevestigd dat TGF- 1 de genexpressie van -SMA en ECM reguleerde door de stroomopwaartse JAK2/STAT3-route te activeren. Onze gegevens toonden aan dat SK de TGF- 1-geïnduceerde NRK-49F-celactivering en ECM-productie in vitro direct remde. Verder hebben we aangetoond dat SK de nierfibrose in UUO-muizen in vivo kan verminderen, waardoor interstitiële ECM-accumulatie op de 14e dag na obstructie wordt verminderd. Deze resultaten gaven aan dat SK renale fibrose aanzienlijk zou kunnen verzwakken door interstitiële fibroblastactivering te remmen en -SMA-expressie te verminderen. Het mogelijke mechanisme van het antifibrotische effect van SK is remming van fibroblastactivering door regulatie van de JAK2/STAT3-signaleringsroute, zowel in vitro als in vivo. Een matige dosis SK keerde ook significant de opregulatie van TGF- 1 geïnduceerd door UUO om, wat suggereert dat het effect van SK gerelateerd is aan TGF-. Omdat TGF- en STAT3 met elkaar interageren, kan SK STAT3 remmen door zich op TGF- te richten, TGF- neerwaarts reguleren door STAT3 te targeten, of beide remmen. Onze vorige systeemfarmacologische studie voorspelde STAT3 als een van de mogelijke doelwitmoleculen van SK [28], en deze bevinding werd geverifieerd in de huidige studie. We gebruiken losartan, een ARB

kan nierfibrose en renale tubulaire celapoptose aanzienlijk verminderen door fosforylering van het signaaleiwit STAT3 te remmen in een rattenmodel van UUO [29], als een positief controlegeneesmiddel. De eerdere bevindingen komen overeen met onze gegevens. Peroxiredoxines zijn een familie van mercaptaanafhankelijke peroxidasen die oxidatieve stress kunnen verminderen door de reductie van waterstofperoxide te katalyseren. Het Prdx5-gehalte in de rattennier nam af op de eerste dag na UUO. Er is waargenomen dat Prdx5-expressie geleidelijk toeneemt tot 5 dagen na TGF-behandeling. Overexpressie van Prdx5 bleek de TGF- -geïnduceerde fosforylering van STAT3 te remmen en de door TGF geïnduceerde -SMA- en FN-expressie in NRK-49F-cellen te verminderen, wat aangeeft dat Prdx5 TGF negatief reguleert- - geïnduceerde STAT3-activering en fibrose in NRK-49F-cellen [12]. Het belangrijkste regulerende mechanisme dat ten grondslag ligt aan endogene STAT3-signalering betreft de SOCS-eiwitfamilie. Nadat STAT3 is geactiveerd door cytokinen, wordt het STAT3-dimeer getransporteerd naar stroomafwaartse doelgenen van nucleaire inductie, waaronder SOCS [30]. In het bijzonder kan het kinase-remmende gebied van SOCS1 direct binden, nierfibrose en renale tubulaire celapoptose aanzienlijk verminderen door fosforylering van het signaaleiwit STAT3 te remmen in een rattenmodel van UUO [29], als een positief controlegeneesmiddel. De eerdere bevindingen komen overeen met onze gegevens. Peroxiredoxines zijn een familie van mercaptaanafhankelijke peroxidasen die oxidatieve stress kunnen verminderen door de reductie van waterstofperoxide te katalyseren. Het Prdx5-gehalte in de rattennier nam af op de eerste dag na UUO. Er is waargenomen dat Prdx5-expressie geleidelijk toeneemt tot 5 dagen na TGF-behandeling. Overexpressie van Prdx5 bleek de TGF- -geïnduceerde fosforylering van STAT3 te remmen en de TGF- -geïnduceerde -SMA- en FN-expressie in NRK-49F-cellen te verminderen, wat aangeeft dat Prdx5 TGF negatief reguleert{{ 38}}geïnduceerde STAT3-activering en fibrose in NRK-49F-cellen [12]. Het belangrijkste regulerende mechanisme dat ten grondslag ligt aan endogene STAT3-signalering betreft de SOCS-eiwitfamilie. Nadat STAT3 is geactiveerd door cytokinen, wordt het STAT3-dimeer getransporteerd naar stroomafwaartse doelgenen van nucleaire inductie, waaronder SOCS [30]. In het bijzonder kan het kinase-remmende gebied van SOCS1 direct binden

aan JAK2 en remmen STAT3-fosforylering [31]. UUO-geïnduceerde JAK/STAT-activering veroorzaakt SOCS-expressieverhoging [32]. Na stimulatie met 10 ng/ml TGF- 1 gedurende 48 uur, nam Prdx5-eiwitexpressie in NRK-49F-cellen significant toe, wat consistent is met eerdere resultaten. SK (4 mg/ml) verlaagde de Prdx5-eiwitniveaus significant na 48 uur interventie. Op de 14e dag na UUO waren de niveaus van SOCS1- en SOCS3-mRNA in de aangetaste nier significant opgereguleerd in de UUO-groep in vergelijking met de controlegroep, wat aangeeft dat de activering van STAT3-signalering na UUO de expressie van SOCS1 en SOCS3 induceerde tot het overgeactiveerde STAT3-signaal negatief reguleren. Na 14 dagen SK-interventie namen de niveaus van SOCS1- en SOCS3-mRNA aanzienlijk af. Deze resultaten toonden aan dat in plaats van negatieve regulatoren direct te verhogen om JAK2 / STAT3-signalering te remmen, SK JAK2 / STAT3 remde, wat resulteerde in neerwaartse regulatie van de negatieve regulatoren Prdx5, SOCS1 en SOCS3. JAK2/STAT3 zou dus een direct therapeutisch doelwit kunnen zijn van SK voor nierfibrose.

MRI is een zeer veilige methode om structurele en fysiologische veranderingen in de nier te beoordelen zonder het gebruik van een intraveneus contrastmiddel [33, 34]. Diffusion-weighted imaging (DWI) is een bekende MRI-methode die wordt gebruikt om moleculaire beweging of diffusie in beeld te brengen die veranderingen in de microstructuur van biologische weefsels weerspiegelt [35]. DTI is een nieuwe beeldvormingstechnologie die is ontwikkeld op basis van diffusiegewogen beeldvorming (DWI) die niet alleen de snelheid van watermoleculen kan beschrijven, maar ook de richting van hun beweging, namelijk anisotropie. Vergeleken met DWI is DTI gevoeliger en nauwkeuriger in het weergeven van de verandering in waterdispersie. DTI kan ook aanvullende informatie geven over de richting en mate van diffusie gemeten op basis van FA. Hueper et al. [36] toonde aan dat FA bij DN-ratten verband hield met glomerulosclerose, interstitiële fibrose en niertubulaire schade. Yan et al. [37] ontdekte dat FA een biomarker kan zijn van vroege DN. Kaimori et al. [38] observeerde een lineair verband tussen de FA-waarde en de mate van echte weefselfibrose in een UUO-rattenmodel. In deze studie hebben we de parameters geoptimaliseerd om de scantijd, anesthesietijd en het verbruik van experimentele middelen te verminderen. De DTI-resultaten waren consistent met Sirius-roodkleuring in termen van de mate van nierfibrose veroorzaakt door UUO en het vermogen van SK om nierfibrose te verlichten. Tot op zekere hoogte lieten deze bevindingen zien dat SK een reëel effect heeft op nierfibrose in vivo. In deze studie hebben we het mechanisme aangetoond waarmee SK renale interstitiële fibrose zowel in vivo als in vitro reguleert. In toekomstige studies is het gebruik van remmers of siRNA's om JAK2 / STAT3 te remmen vereist om dit mechanisme verder te verifiëren.

conclusies

Concluderend suggereren onze gegevens dat SK de activering van nierfibroblasten en nierfibrose bij UUO-muizen effectief kan remmen door de JAK2 / STAT3-signaleringsroute te reguleren. Onze resultaten geven een goed begrip van het mechanisme van SK bij de behandeling van nierziekte. De gedetailleerde moleculaire mechanismen van SK-behandeling bij nierfibrose vereisen echter verder onderzoek.