Evaluatie van blootstelling aan ammoniak-stikstof in het immuunsysteem aanwezig op de milt en hoofdnier van Wuchang-brasem (Megalobrama Amblycephala)
Nov 13, 2023
Abstract:Ammoniak is een van de belangrijkste omgevingsfactoren in aquatische ecosystemen. Er zijn echter beperkte onderzoeken naar de effecten van chronische of langdurige ammoniakstress en het potentiële moleculaire mechanisme ervan bij vissen. Deze studie had tot doel de immuunrespons en moleculaire mechanismen in de milt en kop-nier van vissen te onderzoeken na chronische blootstelling aan ammoniak.Megalobrama amblycephala(9.98 ± {{0}},48 g) werd gedurende 30 dagen blootgesteld aan verschillende concentraties totale ammoniakstikstof (0–30 mg/l). Blootstelling aan ammoniak veroorzaakte significante verhogingen van de cortisolspiegels en verlagingen van de lysozym- en complement-3/4-concentraties in het serum, wat wijst op remmende effecten van ammoniakstress op aangeboren immuunreacties. Blootstelling aan ammoniak veroorzaakte ook concentratieafhankelijke stijgingen van de ammoniakconcentraties in weefsel, pathologische schade en indexen van milt en hoofd-nieren. Bovendien is de inhoud van immunoglobuline M (IgM), interleukine 1 (IL-1 ) en tumornecrosefactor (TNF- ) evenals mRNA-niveaus van tolachtige receptoren (TLR's) / Myeloïde differentiatiefactor 88 (MyD88) -onafhankelijke signaalmoleculen in de milt en de hoofdnier werden aanzienlijk gedownreguleerd na blootstelling aan ammoniak. Onze bevindingen suggereerden dat chronische blootstelling aan ammoniak de onderdrukking van aangeboren en adaptieve immuunreacties veroorzaakte door het downreguleren van TLR/MyD88-onafhankelijke signalering. De nadelige invloeden van chronische ammoniakstress waren ernstiger in de milt dan in de hoofdnier.
Trefwoorden: ammoniak; spanning; tolachtige receptoren; milt; hoofd-nier; immuniteit
KLIK HIER OM KRUIDENCISTANCHE VOOR DE NIER TE VERKRIJGEN
1. Inleiding
Ammonia is one of the most important environmental factors in aquatic ecosystems that affect the growth and health of aquatic animals [1]. Ammonia nitrogen generally comes in one of two ionized forms—NH4 + and the un-ionized form, NH3, in the aquatic environment. NH3 is extremely toxic to fish by reason of its ability to diffuse across cell membranes easily [2–4]. Over the past decades, high levels of ammonia frequently occur in aquatic environments due to disorderly discharges of sewage effluent, agricultural run-off, and high-density aquaculture [5–7]. Although the recommended level of ammonia nitrogen in drinking water is up to 3 mg/L (NH4/L) [8], the real ammonia level can reach much higher (>20 mg/L) soms vanwege ineffectieve of niet-bestaande rioolwaterzuivering of om andere redenen [9,10].
Het is bewezen dat de immunosuppressieve effecten van ammoniak bij vissen bijdragen aan het uitbreken van ziekten [11,12]. In sommige onderzoeken naar Takifugu rubripes, Scophthalmus maximus en Pelteobagrus fulvidraco zou acute blootstelling aan ammoniak de genexpressieniveaus van B-cel-activerende factor, heat shock-eiwit 70/90, tnf- en interleukine kunnen verhogen.- 1/1 /6/ 8/12 [13–15]. Wang et al. meldde ook dat de serumlysozymactiviteiten significant waren afgenomen bij Acanthopagrus schlegelii na 24 uur blootstelling aan ammoniak [16]. Op vergelijkbare wijze werden verlaagde mRNA-niveaus van complement C3 en IgM waargenomen in de milten van Pelteobagrus vachellii en Rhynchocypris lagowski onder acute blootstelling aan ammoniak [17,18]. Hoewel er veel aandacht is besteed aan de effecten van acute blootstelling aan ammoniak op de immuniteit van vissen, zijn er slechts beperkte onderzoeken naar de effecten van chronische of langdurige ammoniakstress en het potentiële moleculaire mechanisme ervan. Bovendien hebben sommige onderzoekers via transcriptionele analyse nadelige effecten van ammoniakstikstof op de mRNA-expressie van TLR's gerapporteerd [16,19-22]. Daarom veronderstellen we dat aanhoudende blootstelling aan ammoniak ook de immuniteit van vissen zou kunnen beïnvloeden, waarbij de TLR-signaalroute een belangrijke rol zou kunnen spelen.
De milt en de kopnier zijn de belangrijkste immuunorganen bij beenvissen, die verantwoordelijk zijn voor het opvangen en opruimen van vreemde deeltjes en het handhaven van een stabiel intern milieu [23,24]. Het zijn ook de belangrijkste plaatsen waar immuunantilichamen worden geproduceerd [25-27]. Bovendien bestaat het aangeboren immuunsysteem bij vissen uit vaste en mobiele cellen, evenals een breed scala aan verdedigingsmoleculen (zoals lysozym, complement en cytokines) [28,29]. Wuchangbrasem (Megalobrama amblycephala) is een karperachtigenvis afkomstig uit het Yangtze-bekken van China, dat in 2014 op de 11e plaats stond wat betreft de totale jaarlijkse productie van deze vis [30]. Als belangrijkste aquacultuursoort is M. amblycephala een relatief gevoelige soort voor ammoniakstikstof en lijdt hij vaak onder stress veroorzaakt door ammoniakstikstof [31-33]. In het licht van het bovenstaande werd een chronisch blootstellingsexperiment uitgevoerd in Wuchang-brasem om de kenmerken van immuunreacties na chronische blootstelling aan ammoniak en het mechanisme achter deze effecten op te helderen door de detectie van veranderingen in serumimmuunparameters, histologie en TLR-pathway-gerelateerde moleculen. in de milt en de hoofdnier. Onze resultaten zijn ook bevorderlijk voor het monitoren van de gezondheidsstatus en het welzijn van M. amblycephala in intensieve aquacultuursystemen.
2. Resultaten
2.1. Ammoniakgehalte in milt en hoofdnier
Figuur 1 toont het ammoniakgehalte in de milt en hoofdnier van M. amblycephala na 30 dagen blootstelling aan verschillende niveaus van ammoniak. Er werd een significante toename van het ammoniakgehalte waargenomen in de milt van vissen die waren blootgesteld aan 30 mg/l totale ammoniakstikstof vergeleken met de controlegroep (p < 0,05). Er was geen statistisch verschil in ammoniakniveaus in de hoofdnier tussen alle ammoniakbehandelingsgroepen en de controlegroep (p > 0,05).
Figuur 1. Effecten van chronische blootstelling aan ammoniak op de accumulatie van ammoniak in de milt en hoofdnier van M. amblycephala. Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde ± SE van zes duplicaten. De waarden van p < 0.05 worden weergegeven als "*" boven de kolom, wat respectievelijk significante verschillen ten opzichte van de controle aangeeft.
2.2. Serumcortisol-, lysozym-, C3- en C4-niveaus
Zoals blijkt uit Figuur 2 stegen de serumcortisolspiegels significant in alle ammoniakbehandelingsgroepen vergeleken met de controlegroep (p < 0.05). Daarentegen waren de serumlysozymactiviteiten significant afgenomen bij de vissen die waren blootgesteld aan hogere concentraties ammoniak (20 en 30 mg/l totale ammoniakstikstof) (p < 0,05). Complement C3- en C4-niveaus in het serum waren significant verlaagd in de groepen behandeld met 10 tot 30 mg/l totale ammoniakstikstof (p < 0,01).
Figuur 2. Effecten van chronische blootstelling aan ammoniak op de niveaus van serumcortisol, lysozym, C3 en C4(AD) in M. amblycephala. Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde + SE van zes duplicaten. De waarden van p < 0.05 en 0.0l worden weergegeven als "" en "" boven de kolom, wat respectievelijk significante verschillen ten opzichte van de controle aangeeft.
2.3. Immuniteitsorgaanindexen
Zowel de milt- als de hoofd-nierindexen namen toe met de toename van de totale ammoniak-stikstofconcentraties na blootstelling (Figuur 3). Vergeleken met de controlegroep was de miltindex significant verhoogd bij de vissen die waren behandeld met een hoger totaal ammoniakstikstofgehalte (20 en 30 mg/l) (p < 0,05). Er werd geen significant verschil gedetecteerd in de hoofd-nierindex tussen alle ammoniakbehandelingsgroepen en de controlegroep (p > 0,05).
Figuur 3. Effecten van chronische blootstelling aan ammoniak op de milt (A) en hoofd-nierindexen (B) bij Mamblycephala. Waarden worden uitgedrukt als Min tot Max (n=18). De waarden vanp < 0.05 en 0,01 worden weergegeven als "" en "u" boven de kolom, wat respectievelijk significante verschillen ten opzichte van de controle aangeeft.
2.4. Pathologische evaluatie
De milt van Wuchang-brasem in de controlegroep vertoonde een normaal uiterlijk met overvloedige erytrocyten en leukocyten (Figuur 4A). Na blootstelling aan ammoniak gedurende 30 dagen werd een lichte toename van het aantal erytrocyten opgemerkt, samen met het optreden van melanomacrofaagcentra in de milt van vissen die waren blootgesteld aan 5 mg/L totale ammoniakstikstof (Figuur 4B, Tabel 1). Soortgelijke maar ernstiger veranderingen werden waargenomen bij vissen die werden behandeld met 10 tot 30 mg/L totale ammoniakstikstof, zoals toenamen in het aantal en de grootte van melanoom-macrofaagcentra, evenals aanzienlijk verhoogde aantallen erytrocyten (Figuur 4C,D). Bovendien werd vacuolisatie van het cytoplasma ook gedetecteerd in de milt van vissen die waren blootgesteld aan 30 mg/L totale ammoniakstikstof (Figuur 4E, Tabel 1).
Wat de hoofdnier betreft, toont figuur 5A een normale structuur van hoofdnierweefsel bij controlevissen na blootstelling. Er werd geen duidelijk pathologisch teken opgemerkt in de hoofdnier van vissen die waren blootgesteld aan een lager totaal ammoniakstikstofgehalte (5 mg/L) (Figuur 5B, Tabel 1). Een lichte toename van het aantal melanoom-macrofaagcentra werd waargenomen bij vissen die werden blootgesteld aan 10 en 20 mg/L totale ammoniakstikstof (Figuur 5C,D, Tabel 1). De grootte en het aantal melanoom-macrofaagcentra waren verbeterd in de 30 mg/L totale ammoniak-stikstofgroep (Figuur 5E, Tabel 1).
2.5. Analyse van weefselimmuunparameters
Niveaus van aangeboren immuunparameters (TNF-, IL-1) en verworven immuunparameters (IgM) in de milt en de hoofdnier namen af samen met de toename van de blootstelling aan ammoniak (Figuur 6, aanvullende tabel S1). In de milt waren de inhoud en mRNA-niveaus van TNF- en IgM significant verlaagd in alle ammoniakbehandelingsgroepen vergeleken met de controlegroepen (p < 0.{{10}}5). Intussen waren het IL-1-gehalte in de milt en de mRNA-expressieniveaus significant neerwaarts gereguleerd bij de vissen die waren blootgesteld aan meer dan 20 mg/l totale ammoniakstikstof (p < 0,05). Daarentegen waren alleen de inhoud en het mRNA-niveau van IL-1, evenals het expressieniveau van tnf- in de hoofdnier, opmerkelijk verminderd in groepen die met ammoniak werden behandeld vergeleken met controles (p < 0,05). Er waren geen significante verschillen in de niveaus van IgM-eiwit en genexpressie, evenals de TNF-concentratie in de hoofdnier tussen de met ammoniak behandelde groepen en de controlegroep (p > 0,05).
Figuur 6. Relatieve mRNA-niveaus van genen voor de TLR-signaleringsroute, evenals de inhoud van TNF-, IL- 1 en IgM in de milt en hoofdnier van M. amblycephala. Waarden uitgedrukt als gemiddelden ± SE van zes duplicaten. igm: immunoglobuline M, il-1: interleukine 1, tnf-: tumornecrosefactor, jnk1: c-Jun N-terminale kinase1, erk1: extracellulair gereguleerd proteïnekinase 1, p38: door mitogeen geactiveerd proteïnekinase p38, nf-κb1 /2: nucleaire factor-κ-genbinding 1/2, pi3 k: fosfatidylinositol 3-kinase, akt: proteïnekinase B, myd88: myeloïde differentiatiefactor 88, traf6: tumornecrosefactorreceptor-geassocieerde factor 6, tlr1 /2/3/4/5: tolachtige receptor 1/2/3/4/5. De waarden van p < 0.05 en 0,01 worden weergegeven als "*" en "**" boven de kolom, wat respectievelijk significante verschillen ten opzichte van de controle aangeeft
Om het moleculaire mechanisme van chronische ammoniaktoxiciteit op het immuunsysteem op te helderen, werden transcriptionele veranderingen van sleutelgenen die betrokken zijn bij de TLR-signaalroute bepaald, samen met de niveaus van TNF-, IL-1 en IgM. In de milt waren de mRNA-niveaus van tolachtige receptorgenen (tlr2, tlr4), MyD88-onafhankelijke route-geassocieerde gene traf6, NF-KB-signaleringsroute-geassocieerde gen nf-κb2 en MAPK-signaleringsroute-geassocieerde gene erk1 aanzienlijk verlaagd. -gereguleerd in de ammoniakbehandelingsgroepen vergeleken met de controlegroep (p < 0.05), terwijl er geen opmerkelijke veranderingen waren in de expressie van tlr1, tlr3, tlr5, pi3 k, akt, myd88 , nf-κb1, jnk1 en p38a (p > 0.05). Op dezelfde manier waren de transcriptieniveaus van tlr1, tlr2, tlr5, akt, traf6, nf-κb1, erk1 en jnk1 significant rood, geen significante verschillen in expressie van tlr3, tlr4, myd88, pi3 k, nf-κb2 en p38 in de hoofdnier tussen de ammoniakbehandelingsgroepen en de controlegroep (p > 0,05).
2.6. Correlatie analyse
Zoals weergegeven in figuur 7 en aanvullende tabel S2 was de blootstellingsconcentratie aan ammoniak significant negatief gecorreleerd met de inhoud van TNF-, IL-1 en IgM, evenals transcriptionele niveaus van tnf-, il-1, igm, tlr2, traf6, nf-кb2 en jnk1 in de milt. Ondertussen vertoonden de inhoud en transcriptieniveaus van milt-TNF-, IL-1 en IgM significante positieve correlaties met elkaar (p < 0.05). De IgM-concentratie in de milt vertoonde een significante positieve correlatie met tlr2 en nf-кb2, en zowel TNF- als IL-1 vertoonden significante positieve correlaties met tlr2, traf6 en nf-кb2 (p < 0.{{ 53}}5). In de hoofdnier waren de blootstellingsniveaus aan ammoniak echter slechts opmerkelijk negatief gecorreleerd met het IL-1-gehalte en de expressie van genen tnf- , il-1 , tlr1/2/4/5, traf6, akt, nf-кb1, jnk1 en erk1 (p <0,05). Hoofd-nier-IL-1 was positief gecorreleerd met IgM, igm, il-1 , tlr4, myd88, traf6, akt, nf-кb1, erk1 en jnk1, terwijl IgM en TNF- een positieve correlatie vertoonden met p38a en tlr2, respectievelijk (p < 0,05).
Figuur 7. Spearman-correlatiecoëfficiënten® tussen de concentratie aan ammoniakblootstelling en immuunparameters die betrokken zijn bij de TLR-signaalroute in de milt en de hoofdnier van M. amblycephala na chronische blootstelling aan ammoniak. De waarden van p < 0.05 en 0,01 worden weergegeven als "*" en "**" boven de kolom, wat respectievelijk significante verschillen ten opzichte van de controle aangeeft
2.7. IBR-indexen
IBR-waarden werden berekend op basis van de gestandaardiseerde gegevens van 22 biomarkers in de milt en kop-nier van Wuchang-brasem onder verschillende niveaus van ammoniak in de omgeving na blootstelling van 30- dagen (tabel 2, figuur 8). Naarmate de blootstellingsconcentraties aan ammoniak toenamen, neigden de IBR-waarden in zowel de milt als de hoofdnier toe te nemen. De waarden van IBR waren hoger in de milt
Ondersteunende service van Wecistanche, de grootste cistanche-exporteur in China:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Winkel voor meer specificaties:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
